	Afaceri	Agricultura	Economie	Management	Marketing	Protectia muncii
	Transporturi

Viticultura

Index » business » » agricultura » Viticultura
» Metode de testare a bolilor virale la materialul saditor viticol

Metode de testare a bolilor virale la materialul saditor viticol

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA

FACULTATEA DE HORTICULTURA

BIOTEHNOLOGII VITICOLE

Metode de testare a bolilor virale la materialul saditor viticol

Aspecte generale

Identificarea virusurilor este un aspect laborios pentru studiul detaliilor de structura fiind nevoie de microscopie electronica performanta, de echipe de cercetatori specializati si de dotari corespunzatoare . In prezent pentru identificarea virusurilor se utilizeaza o serie de metode imunologice, care se bazeaza pe reactii serologice foarte bine studiate si cu rezultate rapide si sigure . In fitovirusologie, pentru identificarea virusurilor se observa efectele aspra spectrului de gazde, relatiile cu vecorii, aspectele simptomatologice pe plante test si indicatoare, modificarile histologice, morfologice si biochimice produse de infectia virala . In ultima perioada, in identificarea si diagnosticul vital, se utilizeaza metode moderne bazate pe studiul secvential al componentelor genomului viral, pe clonari si hibridari nucleare si enzimatice de tip ELISA, PCR, PMR . Aceste metode sunt foarte rapide si sigure dar necesita dotari corespunzatoare, aparatura adecvata si laboratoare specializate .

Lupta impotriva virusurilor si micoplasmelor incepe cu testarea materialului initial folosit la inmultire (coarde altoi, butasi portaltoi)

selectionat din punct de vedere genetic . In functie de rezultatul acestui test, materialul se dirijeaza spre inmultire daca este sanatos sau spre termoterapie sau culturi de meristeme daca este infectat . Tarile care fac parte din Uniunea Europeana nu pot comercializa materialul saditor viticol, decat daca acesta rezulta in urma selectiei clonale si este testat la bolile virotice (material viticol certificat) . S-a trecut la elaborarea sistemelor nationale de producere a materialului saditor "certificat" .

2 . Bolile virale si virusurile vitei de vie

Scurtnodarea (Grapevine fanleaf)

Fanleaf este cea mai importanta si raspandita boala virala a vitei de vie .

Principalele sinonime: scurtnodare (Ro), eourt-noue, panachure, degenerescence infectieuse (Fr), roncet, arricciamento, mosaico giallo (It), uricado (Po), Gelbmosaik (Ge) .

Principalele simptome: neregularitatea si scurtarea internodiilor, noduri duble, crestere in zig-zag, fasciatii . Aceste simptome, totusi pot sa apara si in cazul prezentei altor virusuri sau chiar la Vitele sanatoase (ex . noduri duble) . Frunzele au un sinus petiolar larg deschis, limb foliar asimetric si cu nervuri neregulate, diferite forme de decolorare prin ingalbenire (mozaic galben, ingalbeniri nervuriene) . Uneori intreaga frunza se ingalbeneste . Coardele sunt mai scurte si mai putine decat la vitele sanatoase, cu struguri subdezvoltati ce manifesta simptome de meiere si margeluire . Sistemul radicular este mai slab dezvoltat decat la plantele normale .

Agentul patogen: . Grapevine fanleaf virus (GFLV) - virusul scurtnodarii - este un nepovirus cu particule poliedrice avand un diametru de 30 nm . Se cunosc mai multe serotipuri . Este primul virus descoperit la vita de vie .

Transmiterea: Prin nematodul Xiphinema index care infecteaza radacinile . Prin altoire, utilizand altoi sau portaltoi infectati . in laborator virusul poate fi transmis mecanic prin inoculare pornind de ia tesut de vita infectata - la planta gazda erbacee, de exemplu Chenopodium quinoa sau C . amaranticolor . Transmiterea prin Xiphinema italie sau X . viuttenezi nu a fost demonstrata cu certitudine . Virusul este transmis prin seminte de C . amaranticolor si C . quinoa . Rezultatele cu privire la transmiterea prin seminte de vita de vie sunt controversate .

Susceptibilitatea si sensibilitatea varietala: aproape toate soiurile de Vitis vinifera L . sunt susceptibile, cu sensibilitati diferite . Portaltoii americani sunt de asemenea susceptibili si in general foarte sensibili . Vitis labrusca L . poate fi infectata dar prezinta simptome usoare . Vitis (Muscadinia) rotundifolia pare sa fie imuna si este folosita ca sursa gentica de rezistenta .

Detectarea: Testele serologice folosint tehnica ELISA sunt cele mai rapide, ieftine si sensibile . Indexarea prin altoire pe indicatori Vitis necesita timp lung si spatiu in sera sau camp, dar este necesara pentru confirmarea eliberarii de virus . Indexarea pe plante erbacee prin inoculare mecanica necesita sera cu sistem de racire si nu este mai sensibila ca ELISA . Este utila observarea simptomelor in camp si constitue primul pas al selectiei, dar nu este o metoda sigura .

Controlul: Folosirea materialului vegetal testat, atat altoiul cat si portaltoiul . In solurile contaminate folosirea produselor chimice

Controlul: Folosirea altoilor si portaltoilor sanatosi, testati .

Scurtnodarea (Grapevine fanleaf) - simptome

Virusul scurtnodarii observat la microscop

Strierea lemnului (Grapevine stem pitting - Rugose Wood Complex)

Principalele sinonime: Strierea lemnului (Ro), stem pitting, stem grooving (En), legno riccio (It), bois strie, cannelures du tronc (Fr), madera rugosa (Sp), lehno rogoso (ARN-polimeraza) . Rugozitatea scoartei (Ro), corky bark, rough bark (En), suberosi corticale (It), ecorce liegeuse (Fr), Korkrindenkrankheit (Ge) .

Principalele simptome: Vitele afectate apar mai putin viguroase si pot prezenta intarzieri ale deschiderii mugurilor in primavara . Unii butuci isi pierd vigoarea si mor la cativa ani de la plantare . Vitele altoite prezinta deseori umflaturi sub punctul de altoire si diferente mari intre diametrul altoiului si portaltoiului . La unele soiuri, sub punctul de altoire, lemnul se ingroasa si se striaza si apare o textura cu aspect spongios . Pot sa apara goluri si umflaturi in lemn, atat la altoi cat si la portaltoi . in majoritatea cazurilor nu apar simptome foliare, desi unele soiuri por prezenta rasucire, ingalbeniri sau inrosiri ale frunzelor, similare celor induse de leafroll . Ciorchinii pot fi mai rari si mai mici decat la vitele normale .

Rugose wood este o boala complexa ce cuprinde patru manifestari diferite, ce pot fi recunoscute prin altoire pe indicatorii V . vupestris, LN33 si Kober 5BB:

1 . Rupestris stem pitting . Se distinge prin aparitia unui sant indreptat in jos de la punctul de altoire la V . rupestris . LN33 si Kober 5BB nu prezinta simptome .

Strierea lemnului (Grapevine stem pitting)- simptome

Scoarta de pluta (Grapevine corky bark)

Apar umflaturi si adancituri in toate zonele lemnoase la V . rupestris si LN33, dar nu si la Kober 5BB . Efecte severe asupra cresterii la LN33, insotite de rasucirea si inrosirea frunzelor .

Scoarta de pluta (Grapevine corky bark) - simptome

Virusul grapevine corky bark observat la microscop

Kober stem grooving . Marcat prin aparitia de caneluri ale scoartei la Kober 5BB . Nu apar simptome la LN33 si V . rupestris .

LN33 stem grooving . Caneluri pe scoarta la LN33, asemanatoare celor corky bark, dar nu sunt insotite de ingrosari internodiale, nici de decolorari foliare . V . rupestris si Kober 5BB nu prezinta simptome .

Agentii patogeni: Sunt inca necunoscuti . Totusi, in vitele afectate de corky bark s-au descoperit doua virusuri cu particule lungi de 800 nm si respactiv 1 . 400-2 . 000 nm . Sunt informatii contradictorii in ceea ce priveste implicarea virusului A (GVA) in etiologia stem pitting .

Transmiterea: Raspandirea la distante mari s-a facut prin propagarea materialului infectat . Corky bark este transmisa de Planococcus ficus si Pseudococcus longispinus .

Susceptibilitatea varietala: Majoritatea - daca nu toate - soiurile V . vinifera si portaltoii americani sunt susceptibili . Unele sunt infectate fara sa prezinte simptome . Intensitatea anomaliilor lemnului variaza, posibil in relatie de combinatia altoi/por tal toi .

Detectarea: Altoirea pe indicatori Vitis este singura metoda eficace .

Controlul: Folosirea butasilor si portaltoilor liberi de virusuri, obtinuti prin termoterapie sau cultura de meristeme .

Line pattern

Principalele sinonime: nici unul

Principalele simptome: Decolorari galbene ale frunzelor, formarea de cercuri marginale sau aparitia de linii tipice pe partea superioara a limbului foliar, urmand conturul frunzei . Vigoarea si productia sunt diminuate .

Agentul patogen: Grapevine line pattern virus (GLPV), un posibil membru al grupului Ilarvirus, cu particule polimorfi ce (cvasi sferice spre baciliforme) cu lungimi intre 20 pana la peste 100 nm si un genom multipartit .

Transmiterea: Raspandirea la distante mari s-a facut prin propagarea materialului infectat . Corky bark este transmisa de Planococcus ficus si Pseudococcus longispinus .

Detectarea: Altoirea pe indicatori Vitis este singura metoda eficace .

Controlul: Folosirea butasilor si portaltoilor liberi de virusuri, obtinuti prin termoterapie sau cultura de meristeme .

Marmorarea (Grapevine fleck)Fleck

Principalele sinonime: Marbrure (Fr), maculatura infettiva, screazitura (It), Marmorierung der Rebe (Ge) .

Principalele simptome: Aceasta boala este latenta la majoritatea soiurilor de vita de vie europene si la majoritatea portaltoilor americani . Simptomele apar pe V . rupestris si constau in clarefierea nervurilor de ordin trei si patru, producand pete locale translucide . Frunzele puternic patate sunt deformate si se pot rasuci spre partea superioara . Susele puternice pot provoca diferite grade de degenerare .

Agentul patogen: Grape vine fleck virus (GFkV), un virus ARN, asociat floemului, netransmisibil mecanic, cu particule izometrice cu diametrul de 30 nm . GFkV nu este atribuit nici unei grupari taxonomice .

Transmiterea: Nu se cunoaste nici un vector . Desi exista date recente in ceea ce priveste raspandirea naturala in camp, diseminarea s-a facut initial prin propagarea materialului infectat . Nu are loc transmiterea prin seminte .

Susceptibilitatea si sensibilitatea varietala: GFkV infecteaza natural un numar mare de soiuri si specii Vitis . Nu sunt informatii despre susceptibilitatea individuala .

Detectarea: Pentru testele de rutina poate fi folosit testul ELISA, dar indexarea pe V . rupestris este inca o metoda utila .

Controlul: Utilizarea materialului de propagare liber de virusuri, obtinut prin termoterapie sau cultura de meristeme .

Marmorarea (Grapevine fleck) - simptome

Necrozarea nervurilor (Grapevine chrome mosaic

Virusul a fost gasit in Ungaria, langa lacul Balaton, si mai este numit Hungarian Chrome Mosaic Virus . Frunzele sunt artial sau total ingalbenite sau albite, un simptom similar cu Yellow Mosaic, produs de virusul fanleaf . Vitele afectate scad in vigoare, prezinta noduri duble si internodii scurte . Pierderile in productie pot sa atinga 60% . Unele suse nu evidentiaza simptome . Virusul este distant inrudit cu TBRV . Particulele de GCMV au fost gasite - prin imunoelectronomicroscopie -in Xiphinema index, dar nu sunt date clare in ceea ce priveste transmiterea virusului prin acest nematod . Recent s-a demonstrat ca GCMV se transmite prin seminte de vita de vie .

Necrozarea nervurilor (Grapevine chrome mosaic) - simptome

Enatiunea (Grapevine enation)

Boala enation a fost inregistrata in mai multe tari din intreaga lume, in unele cazuri din secolul trecut .

Principalele sinonime: Enationenkranlheit der Rebe (Ge), maladie des enations (Fr), malattia delle enazioni, omeoplasie crestiformi (It) .

Principalele simptome: Vitele afectate prezinta intarziere in deschiderea mugurilor si incetinire a cresterii lastarilor in primavara, ceea ce da aspectul de tufa butucului . Mai tarziu, in cursul anului, cresterea tinde sa reintre in normal . Apar creste mai ales pe parte inferioara a limbului foliar, la frunzele de la baza lastarilor . Ele au o inaltime de 2-3 mm si o lungime de 3-5 mm sau mai mult si sunt orientate mai mult sau mai putin paralel cu nervura principala . Frunzele bazale - purtatoare sau nu de creste - au o forma anormala, cu aspect de evantai; sunt deseori mai groase, cu nervurile proeminente . Frunzele afectate puternic cad prematur . Internodiile bazala sunt scurte si neregulate ca lungime si orientare, si prezinta uneori strieri . Frunzele care apar mai tarziu - spre inceputul verii -sunt normale . Productia este redusa drastic si de slaba calitate . Exprimarea simptomelor difera de la an la an, aparent in relatie cu conditiile de clima .

Agentul patogen: Etiologia bolii enation nu a fost clarificata . Transmiterea prin altoire sugereaza ca este o boala virala si prezenta virusului fanleaf in vitele bolnave de enation sustin ipoteza ca aceasta boala ar putea fi provocata de o susa puternica a virusului fanleaf . Aceasta ipoteza, totusi, nu a fost sustinuta de cercetari recente .

Transmiterea: Prin propagare vegetativa . Transmiterea prin altoire se soldeaza deseori cu esec . Agentul infectios al bolii poate fi purtat de altoi si zona din coarda ce sustine mugurele .

Susceptibilitatea si sensibilitatea varietala: Sunt putine date disponibile . S-au observat simptome pe mai multe varietati de V . vinifera in Europa si California . Soiurile Panse Precoce, Primus, Italia, Riesling, Grenache si Tokay par sa fie pe deplin susceptibile si dezvolta simptome severe la infectie .

Detectarea: Prin observarea simptomelor de pe frunze si indexarea pe hibridul LN33 . Totusi, pentru ca exprimarea simptomelor

variaza de la an la an si transmiterea priri altoire nu este de 100%, absenta simptomelor nu inseamna neaparat ca planta este sanatoasa .

Controlul: Folosirea materialului sanatos . Nu sunt informatii asupra posibilitatii de indepartare a bolii prin termoterapie sau cultura de meristeme .

Yellow mottle

Principale sinonime; Nu sunt

Principalele simptome: Diferite forme de ingalbeniri pe frunze . Primavara apar ingalbeniri, mai mult sau mai putin extinse, ale limbului foliar care nu se extind si pe nervuri . Pete, cercuri si dungi galbene aparute in timpul verii constitue raspunsul tipic al vitelor afectate . Vigoarea si productia nu pare sa fie puternic afectate .

Agentul patogen: Alfalfa mosaic virus (AMV), un virus transmisibil mecanic, cu particule polimorfice (de la cvasiizometrice la baciliforme), masurand 28-58 x 18 nm si continand un genom tripartit .

Transmiterea: Vectorii sunt inca necunoscuti dar se suspecteaza afidelc . Raspandirea se face prin propagarea materialului infectat .

Susceptibilitatea varietala: S-ar putea sa existe diferente de susceptibilitate intre soiuri, dar informatiile sunt putine .

Detectarea: AMV este transmisibil mecanic la plantele gazda erbacee si poate fi identificat si prin testul ELISA in vitele afectate .

Controlul: Utilizarea materialului sanatos obtinut prin termoterapie .

3 . Sistemul de producere a materialului saditor certificat

3 . 1 Etape

Producerea materialului saditor certificat cuprinde 4 etape distincte: obtinerea materialului initial, conservarea acestuia, preinmultirea si inmultirea lui pentru necesitatile productiei .

Pentru obtinerea materialului initial se porneste de la plantatiile cu cel mai valoros material existent din soiul sau clona respectiva (materialul initial) . parcela va fi stabilita de catre amelioratori . Pe baza observatiilor efectuate timp de un an asupra a cel putin 100 de butuci, se aleg 10 butuci care prezinta in cel mai inalt grad insusirile soiului sau clonei; atentie deosebita se acorda starii fitosanitare a butucilor, care nu trebuie sa prezinte simptome caracteristice virozelor .

Toamna se recolteaza individual, toate coardele de la primii 5 butuci din cei 10 alesi; restul raman in rezerva pentru cazul in care butucii alesi initial sunt infectati cu virusuri . Coardele recoltate vor servi la confectionarea butasilor care se planteaza in vase de vegetatie (aproximativ 1/3 din coarde); celelalte se folosesc pentru testarea virusologica . In urma testarii se identifica fie clonele infectate, fie cele libere de virusuri .

Descendentele clonale libere de virusuri sunt trecute direct in campul de conservare, prin inmultire rapida (micropropagare), folosind butasii care au fost plantati in vasele de vegetatie . Descendentele infectate se supun tratamentului de devirozare prin termoterapie sau culturi de meristeme .

Cresterea nivelului cantitativ si calitativ al materialului saditor viticol si obtinerea unor plante viguroase in vederea realizarii de plantatii incheiate si longevive determina cresterea preocuparilor pentru elaborarea unor tehnologii moderne . La inmultirea rapida a unor genotipuri valoroase se practica vitro - cultura de tesuturi meristematice (apexuri intens regenerative si muguri axilari) .

Pentru obtinerea materialului saditor viticol certificat liber de viroze este necesara testarea virusologica a materialului biologic initial introdus la inmultire ca urmare a patogenitatii virotice in plantatiile viticole .

Tabelul nr . 1

Durata

Metodele de diagnosticare *

Virusurile diagnosticate **

2-3 luni

Descendentele clonale selectate din materialul initial

I . Inocularea mecanica pe plante de Chenopodium; testare prin metodele:

IEM, ELISA

D . C . infectate

D . c . cu reactie negativa

VSNVV, VMArmVV, VMAr,

* IEM - Metoda imunomicroscopica

ELIZA - Metoda imunoenzimatica

D . C . - Descendente clonale

** VSNVV - virusul scurtnodarii vitei de vie;

VMArmVV -virusul mozaicului aramiu al vitei de vie;

VMAr - virusul mozaicului arabisului;

Urmatoarea secventa tehnologica o constituie devirozarea prin termoterapie . Plantele furnizoare de explante se trateaza prin termoterapie . Conditiile de termoterapie se realizeaza gradual, de la 28° C la 37° ± 1° C, pe o durata de 15 - 18 zile, in regim normal de umiditate a a substratului de nutritie, higroscopicitate de 70 - 80 % si fotoperiodism in spectrul otic de absorbtie . Dupa 30 de zile de termoterapie este supus controlului devirozarii si folosit la multiplicarea rapida (culturi de meristeme sau vitrocultura de explante vegetale, apexuri si muguri axilari) . Prin clonarea materialului biologic in conditii optime ale sistemului de nutritie biohormonal se obtine material biologic devirozat .

Particularitatile tehnologice de devirozare si clonare includ posibilitati de inlocuire a termoterapiei cu alte procedee de vitrocultura meristematica si chimioterapie virotica prin folosirea mediilor de cultura eficiente si a metodelor rapide si eficiente pentru devirozare .

Tehnica in vitro de perspectiva o reprezinta embriogeneza somatica, ca rezultanta a capacitatii embrionilor somatici de a da nastere la plante intregi di culturi de celule izolate sau din calus . Cercetarile privind identificarea factorilor genetici, fiziologici si fizici care influenteaza procesul androgenetic, au evidentiat rolul determinant al genotipului in exprimarea potentialului de regenerare .

In campul de conservare, descendentele clonale libere de virusuri si de micoplasme, insumand aproximativ 100 plante la fiecare soi sau clona, sunt cultivate pe radacini proprii in plantatii de tip butasiera (2,20 m x 0,60 m, distantele de plantare) . Coardele care se obtin de la vitele din campul de conservare, se folosesc la infiintarea plantatiei nucleu de preinmultire (material de baza) .

Plantatia nucleu de preinmultire constituie materialul de baza . Aici fiecare soi sau clona va fi reprezentat prin 2000 - 3000 de vite . Cultura vitelor se face tot pe radacini proprii, in sistemul plantatiilor "butasiera" . Coardele care rezulta se folosesc la infiintarea plantatiilor mama de inmultire intensiva . Tinandu-se seama de cerintele unui control permanent si calificat, atat campul de conservare, cat si plantatia nucleu de preinmultire, trebuie sa se afle in acelasi loc (aceeasi unitate de cercetare) .

Schema producerii materialului saditor certificat

Plantatia mama de inmultire intensiva . Coardele din plantatia nucleu se altoiesc pe portaltoi liberi de virusuri, iar vitele altoite rezultate servesc la infiintarea plantatiilor mama de inmultire intensiva . Din aceste plantatii se obtine materialul "certificat"adica coardele care trec la inmultire prin reteaua pepinierelor (scolilor de vite) .

In toate etapele sistemului national de producere a materialului saditor viticol certificat, trebuie sa se adopte un complex de masuri care sa excluda posibilitatea reinfectarii cu virusurile transmisibile . Astfel in toate verigile sistemului, vitele nu vor fi plantate decat pe terenuri pe care nu s-a mai cultivat vita de vie, minimum 4 ani; plantatiile sa fie izolate la cel putin 100 m, fata de restul plantatiilor . anual in plantatiile respective se efectueaza 2 controale fitosanitare, la infloritul vitei de vie si la maturarea strugurilor .

Materialul saditor viticol certificat circula sub denumirile acceptate pe plan international si anume: "material de baza", cand provine din plantatiile nucleu de preinmultire si care va purta eticheta de culoare alba; "material standard", cand rezulta din soiuri sau clone ce nu au fost supuse selectiei fitosanitare si care va purta eticheta de culoare portocalie .

In ierarhia selectiei clonale conservative, obligatorie in sistemul de producere a materialului saditor viticol certificat, materialul rezultat din plantatia nucleu va reprezenta baza superelitei (BSA); materialul rezultat din plantatia - mama de inmultire intensiva constituie superelita (SE); iar vitele altoite certificate obtinute in scoala de vite, reprezinta elita (E) .

DEVIROZAREA INTENSIVA A MATERIALULUI

Face parte din biotehnologiile de varf care se aplica in domeniul geneticii ti patologiei celulare la vita de vie, in scopul de a se obtine descendente vegetative cu vigoare si uniformitate genetica, stabilite productiv, in plantatiile viticole . Astfel de tehnologii se practica in sistem semiindustrial la S . CP . V . V . Stefanesti-Arges (D . B a d i te s c u si colab . , 1901) . Schema tehnologica folosita este prezentata in figura 8 . 37 .

Alegerea materialului biolofjic initial . Materialul biologic este reprezentat prin clonele obtinute in urma lucrarilor de selectie si superselectie care se desfasoara-la unitatile de cercetare cu program-de ameliorare a vitei de vie . Descendentele clonale sunt . fortificate in vase de vegetatie in conditii de sera pe o durata de 30-35 de zile, dupa care sunt supuse la termoterapie . Pentru evitarea socurilor de temperatura asupra vitelor, termoterapia se aplica graduat, de la 28°C la 37°C±1°C pe o durata de 15-18 zile .

Clonarea meristematica, in acest scop, se utilizeaza ca explante portiunile apicale intens regenerative si mugurii axilari situati la 2-3 noduri subterminal . Recoltarea si prelevarea explantelor se face in mai multe etape intr-o perioada de 30-50 de zile, dupa supunerea vitelor la termoterapie . Clonarea se face in conditii de vitrocultura (temperatura 27°C^1OC, intensitatea luminii 3 500-5 000 de lucsi, cu fotoperiodism de 16 ore lumina, alternand cu 8 ore intuneric) .

Dupa o perioada de initiere a subculturii care se realizeaza in 20 - 30 de zile de la inocularea explantului pe mediul nutritiv, se petrec etapele de orga-nogeneza cu diferentierea de primordii si axile de lastari . Pentru stimularea capacitatii regenerative si cresterea numarului de primordii, sunt necesare 3 - 4 subculturi repetate . Pentru inradacinarea lastarilor (minilastarilor), acestia sunt detasati periodic din subculturi si trecuti pe mediul nutritive irizat care contine componente hormonale de formare a radacine . lor (chine-e si AIA) . Durata procesului de rizogeneza este de 18 - 24 de zile . Momentul detasare a lastarilor este atunci cand ei au lungimea de 3 - 5 cm .

Infiintarea nucleului izolator Plantele cu radacinile formate sunt legate de mediul de nutritie agarizat prin spalari repetate cu jet de apa si imer-nare in solutii aseptice, dupa care se trec in ghivece cu substrat-nutritiv id (pamant de telina, mranita, turba, nisip si perlit in proportii volumetrice Je) . Adaptarea plantelor Ia noile conditii, cu emiterea de radacini secunde si intensificarea ritmului de crestere, are loc in sere . Dupa o etapa de -18 zile, plantele adaptate la conditiile de sera,'cu lastari de 20-30 cm . gime, se trec Io cultura pe sol in nucleul izolator de preinmultire . Aici loc si testarea virusologica a vitelor .

Multiplicarea vegetativa . Dupa confirmarea testului virusologie, materia-biologic devirozat (liber de virusuri) este inmultit vegetativ si se infiin-za plantatiile furnizoare de coarde altoi in regim de butasiera .

Consideratii generale . infiintarea plantatiilor de vii roditoare necesita cheltuieli mari de investitii, prin care se urmaresc obtinerea unor productii sporite de struguri, de calitate, in conditiile promovarii tehnologiilor moderne de cultura a vitei de vie si ale unei eficiente economice maxime .

La baza infiintarii plantatiilor viticole stau proiectele de executie, elaborate de unitati specializate de cercetare- . proiecEare, . Pentru intocmirea proiectelor de infiintare sunt necesare studii complexe asupra terenurilor destinate plantatiilor viticole . si anume: studii topografice, hidrologice, pedo-logice, agroehimice, climatice etc . Problemele care trebuie rezolvate prin proiectare sunt urmatoarele:* .

. )- stabilirea sistemului de cultura si a tipului de plantatie viticola;

I- alegerea judicioasa a terenului pentru amplasarea plantatiilor in areajele favorabile culturii vitei de vie;

- proiectarea lucrarilor hidroameliorative care sa asigure folosinta indelungata a terenului prin cultura vitei de vie;

- organizarea terenului in unitati de exploatare, urmarindu-se folosirea rationala a pamantului si asigurarea conditiilor optime de mecanizare a lucrarilor;

- amenajarea antierozionala a terenului pentru conservarea soiului si crearea conditiilor favorabile pentru cresterea si fructificarea vitei de vie;

- pregatirea terenului in vederea plantarii vitei de vie;

- alegerea, soiurilor si amplasarea lor pe teren;

- stabilirea distantelor de plantare;

- plantarea vitei de vie .

Etapele procesului de devirozare

4 . Testarea bolilor virale la materialul saditor viticol

Vita de vie este afectata de multe boli, unele dintre ele fiind transmisibile prin coardele folosite la altoire si butasire . Agentii fitopatogeni reprezentati prin bacterii, ciuperci, micoplasme, virusuri si viroizi pot infecta coardele si vitele in mod lent, fara simptome vizibile, transmitandu-se prin tehnologiile de producere a materialului saditor viticol . Se obtine material saditor infectat, in special cu virusuri si micoplasme, din care rezulta plantatii viticole afectate de boli endemice cum sunt virozele .

Viroizii sunt foarte raspanditi, insa implicarea lor la bolile vitei de vie nu a fost stabilita, decat pentru "patarea galbena a strugurilor" la soiurile din Australia .

Virusurile reprezinta agentii fitopatogeni cei mai periculosi, deoarece se transmit cu usurinta de la o celula la alta si infecteaza intreaga planta . Simptomele care apar pe organele plantelor, constau din coloratiile anormale ale frunzelor si lastarilor, deformari ale organelor . Virusurile care afecteaza vita de vie sunt numeroase .

Primul si cel mai important pas in problemele legate de boli la plante il constituie identificarea corecta a acestora . Desi unele boli pot fi diagnosticate rapid prin examinare vizuala, altele necesita teste de laborator pentru diagnostic . Aceste teste pot dura zile sau chiar saptamani pentru a fi duse la bun sfarsit, si in ele cazuri pot fi irelevante . Intarzierile pot avea efecte negative atunci cand este vorba de un dignostic rapid astfel incat masurile de control al bolilor trebuiesc luate pentru a preveni degradarea plantelor .

Din fericire, ca rezultat al avansurilor in biotehnologie, noile produse si tehnici devin disponibile reducand astfel timpul consumat in cadrul procedurilor de laborator .
Multe produse sunt deja utilizabile, in timp ce altele sunt inca in stadiul de dezvoltare . Unele proceduri necesita aparatura de laborator si instruire, in timp ce alte proceduri pot fi utilizate pe loc de catre o persoana fara o instuire specializata .

O serie de echipamente de detectare ale bolii sunt proiectate pentru a fi utilizate la locul unde apare suspiciunea de boala . Aceste echipamentele de acestia, care in cele mai multe cazuri nu necesita aparatura de laborator, sunt in special folosite de catre producatori . Unele teste pot fi executate numai in cinci minute .

Echipamentele de diagnostic se sprijina pe o metoda prin care o serie de proteine numite anticorpi sunt utilizate pentru a detecta o boala cauzata de catre organisme existente in plante (agentii patogeni) . Aceasta tehnica se numeste ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) . Procedura se sprijina pe abilitatea unui anticorp de a recunoaste si a forma legaturi prin intermediul unui antigen specific, o substanta asociata cu un patogen al plantei .

Metode de identificare a infectiilor virotice la plante

Identificarea infectiilor cu virusuri Ia plante prezinta importanta teoretica, dar mai ales practica . Pentru identificarea infectiilor virotice se folosesc diferite metode, dintre care vom prezenta cateva (observatia vizuala, tehnici serologice, microscopia imunoelectronica) .

4 . 1 Metode de determinare a caracteristicilor biologice

Virusurile fitopatogene prezinta o serie de caracteristici biologice care pot fi determinate in laborator .

Determinarea rezistentei in vitro

Pentru determinarea rezistentei in vitro se foloseste suc vegetal brut care contine virus sau preparat viral purificat . Rezistenta virusului in sucul vegetal se testeaza, de obicei, la temperatura camerei . Pentru aceasta, se determina imediat infectivitatea inoculuiui proaspat preparat, precum si la diferite intervale de timp de la preparare . Determinarea infectivitatii se realizeaza prin infectii mecanice pe plante test sensibile . in timpul testarii, inoculul este tinut la temperatura camerei . Cu timpul, infectivitatea scade, pana ce dispare . Se noteaza limita de timp la care inoculul inca mai pastreaza infectivitatea .

Determinarea punctului de inaetivare termica

Pentru determinarea punctului de inaetivare termica, se incalzeste inoculul viral ia diferite temperaturi, o perioada de timp (I minut . 5 minute sau cel mai frecvent 10 minute) . Se noteaza prima valoare de temperatura la care . incalzind inoculul, acesta isi pierde infectivitatea dupa 0 minute . Determinarea infectivitatii se face prin metoda infectiilor mecanice pe plante test sensibile .

Determinarea rezistentei la pH

Se modifica pH-ul suspensiei de inocul viral, pana ce se constata pierderea infectivitatii . Se noteaza valoarea acelui pH .

Metode de observare a agentilor patogeni

4 . 2 . 1 . Observatia vizuala

Aceasta metoda de identificare a infectiilor virotice Ia plante este cea mai expeditiva, dar si cea mai putin sigura . Metoda se bazeaza pe observarea simptomelor (reducerea taliei, tumori, scurtarea internodiilor, patari foliare etc . ) evidentiate de plantele infectate . Observatia vizuala a virozelor prezinta anumite limite . Astfel, prin aceasta nu se stabileste cu certitudine virusul sau virusurile care au produs infectia . De asemenea, se stie ca simptomele produse de virusuri difera in functie de planta gazda si de conditiile de crestere a acestora . De exemplu, Plum pox virus determina de multe ori infectii latente Ia prun .

4 . 2 . 2 . Tehnici serologice

Tehnicile serologice sunt foarte precise, dau rezultate rapide, sunt laborioase si permit efectuarea unui numar foarte mare de teste . Cele mai multe dintre ele au fost preluate din medicina umana si au fost adaptate pentru studiul virusurilor fitopatogene . Reactia serologica are Ia baza contactul dintre suspensia virala si antiserul specific . Evidentierea reactiei specifice dintre antigen si antiser se realizeaza prin diferite teste, precum testul de floculare, testul de difuzie in gel, testul ELISA .

Testul de floculare

Cand particulele virale interactioneaza cu anticorpii specifici in mediu lichid, formeaza combinatii care precipita . Aceste precipitate pot fi observate in tuburi (testul tub) sau in picaturi plasate pe suprafete netede (testul de microprecipitare) . Testul de microprecipitare se utilizeaza, in principal, pentru diagnoza virusurilor alungite . De obicei, se foloseste sucul plantei purificat prin centrifugare si asezat in vase Petri, sub forma de picaturi .

Microscopia imunoelectronica

Microscopia imunoelectronica (IEM) este o tehnica recenta (Derrick, 1973) care permite vizualizarea reactiei serologice (antigen . anticorp) Ia microscopul electronic . Are mare precizie i prezinta doua mari avantaje: consumul de antiser este extrem de redus, ian antigenul poate fi folosit direct din extract vegetal brut .

Testul ELISA

Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este un test imunologic foarte sensibil al carui principiu se bazeaza pe interactiunea antigen-anticorp . Aceasta tehnica a fost introdusa in virologia vegetala in anul 1976 (Clark si Adams, 1977) .

Spre deosebire de testele de difuzie in gel i de floculare, ELISA permite detectarea virusurilor care se gasesc in concentratie foarte mica in plante si chiar direct din vectorii lor . Datorita sensibilitatii ridicate a testului, virusurile se pot evidentia inaintea manifestarii simptomelor .

Testul ELISA utilizeaza o metoda de dozare imunoenzimatica de tip "double antibody sandwich"(DAS) . in care anticorpi specifici sunt cuplati direct cu o enzima (fosfataza alcalina) . Antigenul (A) este capturat pe faza solida, de catre anticorpii (IgG) fixai anterior . in urmatoarea etapa . anticorpii cuplati cu fosfataza alcalina vin si se leaga pe antigen . In final, hidroliza substratului (p-nitrofenilfosfat) de catre enzima duce Ia obtinerea unei coloratii galbene a carei intensitate poate Ii masurata fotometric prin citirea densitatii optice Ia 405 nm (valoarea absorbtiei) .

Testul ELISA este folosit pentru detectarea a numeroase virusuri Ia plante (Clark si Adams, 1977; Flegg si Clark, 1979 etc . ) .

ELISA este un test care poate detecta proteinele care apartin agentilor patogeni specifici . ELISA a fost si este folosita in domeniul medicinei umane, al medicinei veterinare si al depistarii manifesarilor de boli la plante . Testul a fost frecvent utilizat pentru detectarea unor agenti patogeni periculosi ca HIV, anthrax, varicela, plum - pox . ELISA functioneaza pe baza recunoasterii proteinelor specifice fiecarui organism . Specificitatea testului ELISA este reprezentata de abilitatea de a identifica proteina care este unica pentru fiecare organism

Platouri alveolare din material plastic utilizate la realizarea testului ELISA

Anticorpii utilizati in cadrul echipamentelor de testare sunt reprezentati de proteine purificate produse prin injectarea intr-un animal cu sange cald (un iepure) a unui antigen asociat cu o anumita boala a plantelor (1) . Animalul rectioneaza cu antigenul si produce aticorpi (2) . Anticorpii recunosc si reavtioneaza numai la proteinele asociate cu agentul care cauzeaza boala .

Acesti anticorpi sunt introdusi intr-o alveola de plastic sau intr-un detector similar dintr-un kit de testare . Proba test se prepara dintr-o mostra de planta strivita intre bucati de hartie abraziva . Proba de baza este introdusa intr-o sticla care contine lichid de extractie . Acest lichid este apoi pus in alveole de plastic (3) . Daca organismul responsabil cu declansarea bolii (Agentul Patogen) este prezent in mostra, anticorpii specifici din alveole vor forma legaturi cu proteinele asociate patogenului si vor adera la unitate .

Un al doilea anticorp este de asemenea adaugat pentru a rectiona cu proteinele asociate agentilor patogeni . Acest anticorp este special deoarece actioneaza prin producere de culoare pe baze chimice el purtand numele de rectiv . Schimbarea culorii pe suprafata unitatii indica o rectie pozitiva (prezenta bolii) . Daca nu sunt prezente proteine asociate cu agentul patogen (4b), detectorul de anticorpi nu poate fproduce culoare in prezenta reactivului . In prezent, un numar limitat al acestor metode de detectare pe loc a bolilor sunt disponibil . Majoritatea kiturilor de diagnostic ELISA sunt folosite in laborator, se pot realiza oricum teste pentru o gama variata de agenti patogeni .

Cele 14 etape ale testului Elisa

Anticorpi si enzime prezente in cadrul testului Elisa

Tamponarea directa a tesuturilor

Un alt mijloc de diagnosticare care foloseste de asemenea anticorpii ca metoda de detectie poarta numele de tamponare directa a tesuturilor . Cu ajutorul acestei tehnici localizarea directa a agentului patogen in planta gazda poate fi determinata, permitand deectarea mai rapida si o mai buna intelegere a modului cum progreseaza boala la nivelul plantei . Tesutul plantei gazda este presat intr-o coala speciala de hartie . Anticorpii care formeaza legaturi cu agentul patogen sunt introdusi in hartie . O schimbare a culoriii indica un rezultat pozitiv aratand locatia agentului patogen la nivelul tesuturilor plantei gazda .

Un alt set de instrumente care pot fi folosite pentru diagnosticare abolilor la planteeste reprezentat de proba cu acid nucleic . Aceste probe reprezinta fragmente de acid nucleic aranjat intr-o secventa complementara a ADN sau ARN a diferitilor agenti patogeni . Datorita faptului ca secventele se completeaza unele pe altele, aceste probe pot fi utilizte pentru diferite boli .

Metoda zdrobirii tesutului

O alta metoda care utilizeaza tehnologia probelor cu acid nucleic este cunscuta ca metoda zdrobirii tesutului aceasta tehnologie este asemanatoare cu "tamponarea directa a tesuturilor": Astfel tesuturile dintr-o planta care sunt suspecte de a fi afectate de boala sunt strivite intr-o coala speciala de hartie numita membrana (1) . Acesta membrana este tratata cu o proba (2) care se pote lega sau hibrida cu acid nucleic ale agentilor patogeni existenti in tesuturile plantelor . Hibridarea sau legaturile se vor manifesta cand sunt prezente (3)secventele perechi . Dupa adaugarea a cateva substante in membrana, daca o rectie de colorare (4) inseamna ca secventele de acid nucleic au hibridat si boala e prezenta . O reactie incolora insemna ca testul pentru boala este negativ .

PCR

O noua tehnologie, PCR (polymerase chain reaction - reactie de polimerizare in lant) are un mare potential in vederea cresterii sensibilitatii a diferitelor metode care utilizeaza probe de acid nucleic . PCR este folosit pentru a produce un numar enorm de copii a unei secvente specifice de acid nucleic . Aceste tehnici pot permite detectarea urmelor de agent patogen prin amplificarea secventelor patogenului pana la un nivel detectabil .

Diagrama obtinuta in urma realizarii unui test PCR

Etapele care au loc in cadrul unui test PCR

Obtinerea unor reactii in cadrul testelor PCR

PCR localizat

PCR localizat nu reprezinta altceva decat o repetare a reactiei cu conditia faptului sa amplifice fragmente mai mici decat prima reactie, tinta ADN este localizata prin amplificarea primei reactii si astfel produsul PCR localizat este intotdeauna mai mic decat produsul obtinut in prima faza . PCR localizat este folosit din mai multe motive: 1) cresterea specificitatii PCR . In acest caz PCR localizat Este folosit pentru a distinge intre un test fals pozitiv si unul pozitiv cu adevarat, acesta din urma amplificand produsele cu secvente corecte obtinute de la primul pas .

PCR multiplex

PCR multiplex este o simpla rectie PCR prin care doua sau mai multe tinte sunt detectate in aceeasi reactie . Aceasta metoda consuma mai putin timp decat PCR localizat, si uneori poate fi extrem de utila atunci cand se doreste realizarea unui control intern care va indica faptul ca acea reactie este corecta . Aceasta rectie este utilizata de catre Universitatea de Stat din Oregon .

Transcriptia inversa PCR - RT PCR (Reverse transcription PCR)

Transcriptia inversa PCR este utilizata de obicei pentru detectarea mai multor virusuri de plante din cauza faptului ca nu au ADN, au ARN . In acest caz, testul PCR precedat de o etapa care foloseste o enzima (numita trancriptaza reversibila) pentru a convert ARN in ADN . Altfel este identic cu PCR .