Biologie	Chimie	Didactica	Fizica	Geografie	Informatica
	Istorie	Literatura	Matematica	Psihologie

Biofizica

Index » educatie » » biologie » Biofizica
» SPECTROFOTOMETRIE ABSORBTIA SI EMISIA RADIATIILOR DE CATRE MOLECULE

SPECTROFOTOMETRIE ABSORBTIA SI EMISIA RADIATIILOR DE CATRE MOLECULE

 

Extinctia, datorata unui component din solutie, creste linear cu concentratia lui molara, C, si cu grosimea stratului de solutie strabatut, x :

E = e C x (legea Lambert si Beer

e se numeste coeficient molar de extinctie si, pentru scopuri biologice, unitatea curenta este de M cm , exprimata uneori ca litri mol^.cm . Valoarea lui nu depinde decat de natura absorbantului si de lungimea de unda la care a fost masurata. Se poate demonstra ca :

E = lg I₀ / I = lg T, unde T este gradul de transmisie al luminii, adica

T = I / I₀ sau T(%) = I /I₀ . 100.

Spre exemplu, valoarea extinctiei unui fascicol luminos a carui intensitate scade de 10 ori fata de cel incident pe suprafata, va fi E=1.

Se numeste curba caracteristica de absorbtie, sau spectrul de absorbtie al substantei, graficul dependentei coeficientului molar de extinctie de lungimea de unda: e e l

Informatiile oferite de curba caracteristica de absorbtie privesc: a) tipurile legaturilor si energetica lor (prin lungimile de unda la care se plaseaza maximele de absorbtie) si b) abundenta gruparilor sau legaturilor absorbante (prin valorile coeficientilor de extinctie). Ea este determinata de natura moleculei (compozitie, structura) si depinde de interactiunile (intra- sau intermoleculare) pe care le are molecula sau parti ale ei.

Selectarea lungimilor de unda potrivite pentru determinarea concentratiilor prin masuratori de extinctie se face utilizand monocromatoare. Lungimea de unda la care se fac determinarile se alege astfel incat substanta de determinat sa prezinte absorbanta maxima iar ceilalti componenti ai amestecului sa absoarba cat mai putin (sau deloc). Trebuie mentionat ca toate corpurile apar colorate in culoarea complementara radiatiilor absorbite, deci pentru a obtine extinctia maxima pentru o solutie de o anumita culoare, trebuie ales un filtru de culoare complementara acesteia (vezi diagrama de mai jos).

Fig.4. Diagrama culorilor complementare

Gruparile cromofore reprezinta grupari de atomi, legate prin interactiuni chimice sau fizice, si care au benzi de absorbtie caracteristice.   

Absorbtia in ultraviolet si vizibil se datoreste gruparilor cromofore reprezentate de legaturile covalente Cromo-for inseamna "purtator de culoare". Culoarea observata la o solutie strabatuta de lumina alba, se datoreste radiatiilor pe care moleculele ce o compun le lasa sa treaca (nu le absoarbe).

Legatura simpla, C-C, absoarbe sub 160 nm, dar studiile la l < 180 nm sunt imposibile in solutie apoasa, intrucat si legaturile covalente ale apei absorb puternic in acest domeniu.

Legaturile duble absorb intre 180 si 300 nm prin tranzitiile electronice intre orbitalii p si p*.

Dublele legaturi conjugate ale ciclurilor aromatice (aminoacizi ca Phe, Tyr, Trp), sau ale heterociclurilor bazelor azotate (purinice si pirimidinice), au cate o banda de absorbtie intensa intre 230 si 300 nm. Deplasarile lungimilor de unda ale maximelor, si variatiile coeficientilor molari de extinctie ai radicalilor, servesc la studiul structurii si a interactiunilor cu agentii de mediu: forta ionica, pH-ul, temperatura.

Legaturile pepetidice (avand craracter de dubla legatura) absorb intr-o banda cu doua maxime: unul mai exprimat, la 200 nm, si altul mai redus, la 225 nm. Spectrele lanturilor polipeptidice, daca acestea adopta o structura secundara definita, au particularitati caracteristice ale spectrului de absorbtie (Fig.5).

Metaloproteinele, ca si compusii ce contin radicali aromatici policiclici si sisteme de duble legaturi conjugate absorb in domeniul vizibil.

Prima categorie include compusii metalelor tranzitionale, iar pentru a doua se pot cita flavo-proteinele. Proteinele heminice (hemoglobina - Fig. si citocromii) au spectre caracteristice datorate, pe de o parte, nucleului conjugat tetrapirolic si, pe de alta parte, prezentei ionilor de fier. Cuprul, determina spectrele ceruloplasminei plasmatice, citocrom-oxidazelor mitocondriale sau al hemocianinei (transportorul de oxigen din sangele unor nevertebrate).

Absorbtia in infrarosu, in conditii apropiate de cele biologice, are loc datorita vibratiilor moleculare, fiindca, asa cum s-a vazut, in solutie starile rotationale pure nu pot exista. Domeniul spectral in care se lucreaza este IR apropiat si mediu.

In cazul vibratiilor longitudinale ale legaturilor marginale, de exemplu, se cunosc lungimile de unda ale maximelor de absorbtie. Daca atomii acestora participa la punti de hidrogen se produc deplasari caracteristice, in sensul cresterii lungimilor de unda. (Tabelul. 1)

Tabelul 1 : Pozitiile maximelor de absorbtie pentru vibratiile longitudinale ale unor legaturi

LEGATURA Lungimea de unda Lungimea de unda

in lipsa legaturii de H in prezenta legaturii de H

-O-H 2,75 mm 3,00 mm

-N-H 2,95 mm 3,10 mm

-S-H 3,90 mm 4,00 mm

-C=O 5,90 mm 6,05 mm

Solutiile apoase nu sunt propice studiilor in infrarosu datorita celor doua benzi de absorbtie intensa ale apei (in jurul a 3,1 mm si 6,1 mm). Legaturile de hidrogen, care de pot studia usor in solventi neaposi, nu pot fi studiate in apa.

5. DESCRIEREA SPECTROFOTOMETRULUI UV-VIS

SP-8001 METERTECH

Parametrii tehnici

Domeniul de masurare: 200-1100 nm

Latime de banda: 2 nm

Precizia lungimii de unda: 1 nm

Monocromator: split beam (raza divizata)

Reproductibilitate: 0.2 nm

Domeniul fotometric: - 0.300-3.000 Abs

Precizia fotometrica: 0.005 % la 1.000 Abs

Stabilitate (drift): < 0.0003 Abs / ora la 500 nm (dupa 1 ora de incalzire)

Stabilitate baseline: 0.002 Abs (intre 210-1000 nm)

Lumina imprastiata: < 0.05% la 340 nm si 220 nm

Sursa de lumina: lampa deuteriu (UV) si lampa halogen (VIS)

Schimbare sursa de lumina: automat

Detector: doua fotodiode

Viteza de inregistrare spectru: 100-5000 nm/min

Drum optic: schimbabil intre 10-100 mm

Afisaj: LCD cu iluminare din spate, contrast reglabil

Iesiri semnal: port serial si paralel

Alimentare / sigurante: 100/120/220/240 V ~ 50/60 Hz

sigurante: T 2A 220/240 V, T 4A 100/120 V

Ambient / umiditate: temperatura camerei: 15-30°C, umiditate < 80%

Dimensiuni: 506 mm x 430 mm x 220 mm. Masa: ~18 kg

Moduri de masurare: la lungime de unda fixa, inregistrare de spectru, masurare in timp la o lungime de unda, masurare cantitativa, cinetica simpla.

ELEMENTE DE COMANDA

Comanda spectrofotometrului, introducerea parametrilor de masurare precum si vizualizarea rezultatelor se face cu ajutorul butoanelor tastaturii protejate cu folie. Se pot observa urmatoarele grupuri:

PORNIRE SI FUNCTIONARE: Ne asiguram ca in incinta de lucru nu este nici o cuva. Se inchide capacul incintei, se porneste aparatul. Pe afisaj vor aparea urmatoarele mesaje:

Aparatul va executa un autotest, va aprinde lampile si va recunoaste accesoriile optionale, daca ele exista, toate acestea in mod automat. Dupa initializare va fi afisata fereastra meniului principal. De aici se poate alege din sapte (sase) optiuni.

Alegerea se face prin tastarea numarului corespunzator sau prin deplasarea benzii luminoase (hightlight) urmate de apasarea tastei ENTER. Pe partea de jos a afisajului mai sunt doua optiuni, dintre care 'Sample Control' are sens doar in cazul utilizarii unui suport multicell (multicuva), iar cu tasta F1 de sub 'Quick Run' se poate intra in meniul de fisiere, ca si cu ajutorul tastei QUICK RUN. Parametrii de baza ai spectrofotometrului se pot seta din submeniul 6, 'System Setup'. Optiunile din acest submeniu se aleg prin tastarea numarului corespunzator urmata de apasarea tastei ENTER.

EFECTUAREA MASURATORILOR IN DIFERITE MODURI

a) MASURARE LA LUNGIME DE UNDA FIXA

Este un mod de masurare simplu, la lungime de unda fixa. Se porneste din meniul principal, alegand punctul 1. Apare fereastra Photometric Parameter setup.

Deplasandu-ne cu ajutorul sagetilor, putem selecta parametrii doriti pentru setare sau editare. Avem posibilitatea de a incarca si seturi de parametri de la masuratori anterioare, prin apasarea tastei functie F1, de sub afisaj. Cu tasta F2 se salveaza, cu F3 se tiparesc parametrii. Pot fi setati urmatorii parametri de masurare:

Dupa setarea tuturor parametrilor, se recomanda salvarea lor intr-un fisier. Dupa apasarea tastei F2, apare un careu cu litere. Selectarea unei litere are loc prin deplasarea cu ajutorul sagetilor pe linia care o contine, urmata de apasarea numarului corespunzatoare coloanei in care se gaseste ea.

Dupa completarea numelui se apasa tasta ENTER, apoi cu ajutorul sagetilor ne deplasam pe o linie goala si se apasa din nou ENTER; fisierul este salvat. Se pot salva cate 15 fisiere pentru fiecare mod de masurare.

Atentie! Aparatul va suprascrie fara intrebare fisierele cu acelasi nume!!

Dupa introducerea parametrilor se apasa tasta F5, apare un tabel gol, si fotometrul se pozitioneaza pe prima lungime de unda din lista.

A se urmari intotdeauna mesajele din partea de jos a afisajului, operatiile acelea trebuie efectuate.

Pentru a tine cont de valoarea blancului, se aseaza cuva goala sau umpluta cu solvent in suportul de cuve si se apasa tasta AUTO ZERO.

Masurarea porneste dupa apasarea tastei READ. La sfarsit se poate reporni masurarea sau pot fi printate datele. Exista si un mod foarte simplu de masurare pentru cazul in care se lucreaza la o singura lungime de unda. Din meniul principal se apasa tasta λ. Cu tasta 'Mode' se alege modul fotometric de masurare (absorbanta, transmitanta, concentratie).

Se introduce lungimea de unda si se valideaza cu ENTER, dupa care masurarea porneste imediat si se afiseaza rezultatul. Se poate si salva prin apasarea tastei F2. O masuratoare noua se poate porni apasand din nou tastele λ si ENTER. Cu tasta F1 (View Data) se pot afisa rezultatele masuratorilor si se pot si tipari. Rezultatele nu sunt salvate definitiv; daca se iese din acest mod de masurare, ele se pierd.   

b) INREGISTRARE DE SPECTRU

In modul de inregistrare de spectru avem posibilitatea de a masura fie pe un domeniu restrans, fie pe tot domeniul spectrofotometrului, cu specificarea vitezei de scanare. Spectrul rezultat poate fi prelucrat in diverse moduri, poate fi printat, salvat si deschis mai tarziu. Spectrele pot fi si suprapuse in aceasi fereastra (overlay). Pentru pornirea acestui mod, din meniul principal se alege punctul 2. Navigand cu tastele sageti, putem seta sau edita parametrii.

Comenzile afisate in partea inferioara a ferestrei se pot executa cu ajutorul tastelor de sub ele. Putem seta urmatorii parametri de lucru:

Dupa setarea tuturor parametrilor, este indicata salvarea lor intr-un fisier, similar celor descrise la modul fix de masurare. Acestea pot fi rechemate oricand pentru pornirea unei masuratori. Putem salva in total 15 fisiere de parametri. Dupa umplerea memoriei, randurile vor fi suprascrise. Deasemenea, la o salvare aparatul nu va cere confirmarea suprascrierii randului actual. Din acest motiv, se recomanda deplasarea cu ajutorul sagetilor pe un rand gol. Dupa validarea parametrilor de masurare se apasa tasta F5 (Next Screen) si se va intra in fereastra grafica de masurare.

Pe partea de jos a ecranului apare mesajul 'Press READ when ready'. A se urmari intotdeauna mesajele din partea de jos a afisajului, operatiile acelea trebuie efectuate.

Deoarece spectrofotometrul are un singur drum optic, un spectru masurat s-ar compune din absorbantele ansamblului cuva + solvent + proba necunoscuta. Din aceasta cauza, pentru luarea in consideratie a valorii de blanc, inainte de masurarea propriu zisa, vom introduce in suport cuva sau cuva cu solventul pur si vom apasa tasta AUTO ZERO. Dupa care aparatul va masura un baseline (blanc) pe domeniul de lungimi de unda definit prin parametri de lucru; acesta va fi scazut din masuratorile de probe pornite cu tasta READ.

Se aseaza cuva cu proba in locasul din incinta de lucru, se inchide capacul incintei. Se apasa tasta READ, masuratoarea porneste si spectrul va fi trasat pe ecranul grafic. Pe partea de sus a ecranului sunt afisate lungimea de unda si valoarea fotometrica, actuale. Masuratoarea poate fi oricand oprita prin apasarea tastei ESC. La sfarsit, daca este nevoie, cu tasta READ putem inregistra din nou spectrul. Pe partea de jos a ecranului se vad ferestrele operatiilor posibile.

Ele pot fi executate cu ajutorul tastelor functii (F1-F5), aflate dedesubt.

Cu tasta 'Prev Screen' (F5) ne intoarcem in fereastra de parametri. Cu tasta 'Clear Graph' (F3) putem sterge spectrul. Daca am activat overlay, vor fi sterse toate spectrele.

Cu tasta 'Acces Data' (F1) acceptam masuratoarea. In ferestrele de jos vor aparea noi mesaje:

F 3 'Print Data' printarea rezultatului;

F 2 'Save Data' salvarea spectrului sub numele dat de noi (5 fisiere);

F 1 'Load Data' reincarcarea spectrelor salvate pentru analiza. Cu banda luminoasa ne pozitionam pe randul dorit si cu ENTER il incarcam in fereastra grafica de mai inainte. Cu tasta ESC putem urca cu un nivel mai sus, unde putem face analiza spectrului.

c) ANALIZA DE SPECTRU

Putem intra in acest punct de meniu dupa inregistrarea unui spectru sau dupa reapelarea unui spectru salvat in prealabil. Pentru acesta trebuie sa apasam tasta F2 de sub fereastra 'Manipulate'.

Vom avea urmatoarele posibilitati:

- F1 Smooth Data: netezirea automata a curbei

- F2 Zoom Data: marirea/micsorarea curbei; la axa Y palpaie cursorul, acolo trebuie introdusa noua valoare apoi se valideaza cu ENTER. Cursorul va sari la pozitia urmatoare; prin repetarea operatiei precedente si terminand pe partea dreapta a axei X, curba va fi redesenata conform coordonatelor. Apasand din nou tasta F2 se va repeta procesul, sau se poate reveni la aspectul initial cu tasta F5.

- F3 Show Track: apare o linie verticala, in randul de sus va fi afisata pozitia ei actuala si valoarea fotometrica corespunzatoare. Poate fi deplasata cu tastele sageti, astfel putem cauta orice varf sau vale. Daca intr-un loc apasam tasta 'Save Data', datele vor fi salvate. Cu 'View Data' se pot vizualiza, cu 'Print Data' se pot printa datele varfurilor. Iesirea se face cu tasta ESC.

- F4 Peak Walley: dupa apasare, apare jos un meniu nou.

Alegand 'Search Peak' se va face o cautare de maxime. Daca se alege 'Search Valley' se vor cauta minime ale spectrului. Folosind tastele 'Less Point', 'More Point' se va executa o cautare pentru mai putine, respectiv pentru mai multe puncte. Dupa cautare, datele pot fi afisate sub forma tabelara daca se apasa tasta 'View Data', de aici pot fi si printate.

Cu tasta F5 (Prev Screen) ne intoarcem in fereastra precedenta, de analiza. Cu tasta ESC ne putem deplasa inapoi prin structura meniului.

d) MASURARE IN TIMP (TIME SCAN)

In acest mod de masurare putem inregistra variatia in timp a valorii fotometrice alese, la o lungime de unda. Se utilizeaza pentru urmarirea reactiilor, pentru masuratori de cinetica. Este posibila intarzierea masuratorii propriu-zise (Delay Time), astfel citirea porneste numai dupa expirarea timpului setat. Din meniul principal putem ajunge in modul Time Scan alegand punctul trei. Apare fereastra "Parameter Setup".

Dupa ce am setat parametrii, putem porni masuratoarea sau ii putem salva intr-un fisier. Tot de aici, parametrii pot fi si printati. Putem seta urmatorii parametri:

Dupa setarea parametrilor, daca este necesar, masuram valorea de blanc, apoi asezam cuva cu proba in incinta de lucru si inchidem capacul.

Apasam tasta READ, dupa trecerea timpului setat la delay time va porni masuratoarea si curba va fi trasata pe ecranul grafic. In partea de sus al ecranului se poate vedea timpul scurs si valoarea fotometrica actuala. Putem opri masuratoarea cu tasta ESC.

La sfarsit putem repeta masuratoarea cu tasta READ.

Pe partea de jos a ecranului sunt afisate ferestrele comenzilor ce pot fi executate.

Acestea pot fi lansate cu tasta aflata dedesubtul lor (F1-F5). Analiza rezultatelor se face similar celor descrise la analiza spectrelor.

e) MODUL DE MASURARE CANTITATIVA

In acest mod de masurare avem posibilitatea determinarii concentratiei unei probe necunoscute, pe baza unei curbe de calibrare inregistrate in prealabil de catre utilizator cu ajutorul unor solutii standard, a caror concentratie se cunoaste. Se pot inregistra patru tipuri de curba de calibrare. Din meniul principal putem ajunge in modul Quantitative alegand punctul cinci. Apare fereastra "Parameter Setup".

Navigand cu tastele sageti, putem seta sau edita parametrii. Validarea lor se face prin apasarea tastei ENTER. Putem incarca si seturi de parametri salvati anterior.

Lista parametrilor de setat este urmatoarea:

Dupa validarea tuturor parametrilor, cu tasta F5 trecem in fereastra Quantitative Standard Table. Apasam tasta READ, pe randul de sus apare concentratia introdusa mai inainte, precum si un mesaj in partea de jos: 'Press READ for read stds'. Dupa apasarea tastei apare un mesaj nou: 'Insert stds and press READ'. Acum putem introduce primul standard din seria de dilutie. Se apasa READ, dupa care valoarea absorbantei masurate va fi inscrisa in randul corespunzator. Celelalte solutii din seria de standarde se masoara la fel. Cu tasta F2 trecem in fereastra 'manipulate' unde 'View Curve' ne va afisa curba de calibrare, iar 'View Equati' ecuatia pe baza careia aparatul va calcula concentratia probelor necunoscute, dupa ce le-a masurat absorbanta. (Apasand 'Keyin Factor' putem edita parametrii K1 si K0 ai ecuatiei, corectand astfel valoarea calculata). Daca nu dorim folosirea factorului, ne intoarcem cu 'Prev Screen'.

Cu tasta 'Sample Measure' (F2) ajungem in fereastra de masurare propriu zisa.

Acum putem aseza cuva cu proba de concentratie necunoscuta in incinta. Dupa inchiderea capacului se apasa tasta READ; masuratoarea va fi executata. Pe randul de sus vor fi inregistrate numarul de ordine al probei, absorbanta masurata precum si concentratia calculata pe baza curbei de dinainte. Urmatoarele probe necunoscute vor fi masurate pe rand, la fel. La sfarsit putem printa rezultatele.

Dupa validarea tuturor parametrilor, cu tasta F5 trecem in fereastra Quantitative Standard Table.

Apasam tasta READ, pe randul de sus, langa concentratia introdusa in prealabil, va palpai cursorul. Aici trebuie introdusa cu tastele numerice valoarea absorbantei, apoi se valideaza cu ENTER. La sfarsit cu tasta Esc validam curba de calibrare. Apasam F2 si intram in fereastra 'Manipulate', unde 'View Curve' ne afiseaza curba de calibrare, iar 'View Equati' ne arata ecuatia pe baza careia aparatul va calcula concentratia probelor necunoscute, dupa ce le-a masurat absorbanta. Apasand 'Keyin Factor' putem edita parametrii K1 si K0 ai ecuatiei. Daca nu dorim folosirea factorului, ne intoarcem cu 'Prev Screen'. Cu tasta 'Sample Measure' (F2) ajungem in fereastra de masurare propriu zisa. Acum putem aseza cuva cu proba de concentratie necunoscuta in incinta. Dupa inchiderea capacului se apasa tasta READ, masuratoarea va fi executata. Pe randul de sus vor fi inregistrate numarul de ordine al probei, absorbanta masurata precum si concentratia calculata pe baza curbei de dinainte. Urmatoarele probe necunoscute vor fi masurate pe rand, la fel. La sfarsit putem printa rezultatele.

f) CINETICA

In acest mod de masurare inregistram variatia absorbantei in timp la o lungime de unda fixa; pe baza curbei inregistrate se poate calcula activitatea. O aplicatie tipica este analiza activitatii enzimatice. Alegand punctul patru din meniul principal System, ajungem in acest mod de masurare. Apare fereastra "Parameter Setup".

De aici putem introduce sau edita parametrii de masurare. Putem incarca si parametri salvati anterior. Avem acces la urmatorii parametri:

Dupa setarea lor, parametrii pot fi salvati pentru utilizari ulterioare. Dupa validarea parametrilor, intram in fereastra de masurare cu F5. Asezam proba in incinta de lucru, apoi apasam tasta READ. Masuratoarea va porni, vor trece intervalele delay time si lag time, dupa care curba va fi trasata pe ecran. Putem opri oricand masuratoarea cu tasta ESC.

Dupa terminarea masuratorii se va executa calcularea activitatii; rezultatul va fi afisat in partea de jos a ecranului. Patratelele de pe curba arata punctele de calculatie. ΔT arata parametrul rate time, ΔABS/ΔT rata de variatie a absorbantei, iar ΔC/ΔT rata de variatie a concentratiei in cazul utilizarii unui factor.

De aici putem printa datele sau le putem afisa sub forma de tabel (cu tasta Data List). Cu tasta F2 (Manipulate) obtinem doua noi optiuni de analiza. In submeniul Show Track putem deplasa o dreapta verticala cu ajutorul tastelor sageti, evaluand curba astfel. Linear Fit aseaza peste curba o dreapta de regresie. Optiunea Original va reafisa curba initiala.

APLICATII : 1. Trasarea unei curbe de etalonare

Dependenta coeficientului de extinctie de concentratia substantei dizolvate este un indiciu asupra existentei unor interactiuni intre moleculele dizolvate, deci este o pretioasa sursa de informatii. In cadrul acestei lucrari se va trasa, pentru o anumita substanta etalon, a carei concentratie este cunoscuta, graficul dependentei extinctiei de concentratie, adica E = E (c). Acest grafic va putea fi utilizat pentru : a) determinarea concentratiilor unor solutii necunoscute (preparate pornind de la etalon) , b) stabilirea domeniului de concentratii pentru care este valabila legea Lambet-Beer, c) evidentierea unor eventuale interactiuni intre moleculele de solvit (de exemplu, moleculele de albastru de metilen avand o structura aromatica planara, tind sa se agrege in solutie apoasa, datorita fortelor hidrofobe).

Plecand de la solutia etalon care are o concentratie cunoscuta, se prepara in eprubete diferite dilutii, cu apa distilata: 5%, 10%, 30%, 40%, 50%, 70%.

Pentru cazul in care se lucreaza la o singura lungime de unda, din meniul principal al spectrofotometrului se apasa tasta λ. Cu tasta 'Mode' se alege modul fotometric de masurare (absorbanta). Valoarea lungimii de unda se alege corespunzator culorii solutiei, urmarind diagrama culorilor complementare (daca etalonul este albastru de metilen se va selecta λ = 480 nm ). Prima masuratoare se va efectua cu apa distilata: pentru a tine cont de valoarea blancului, se aseaza cuva umpluta cu solvent (apa) in suportul de cuve si se apasa tasta AUTO ZERO. Dupa ce se salveaza rezultatul, se inlocuieste cuva care contine blancul (apa distilata) cu o cuva care contine pe rand, solutiile preparate din etalon, salvand de fiecare data rezultatul. In final, toate valorile extinctiilor vor aparea in tabel, care poate fi printat ulterior.

Se va trasa graficul E =E(c), tinand cont ca pentru c = 0 E = 0 (graficul incepe din origine), observand cresterea extinctiei odata cu concentratia solutiei. Apoi se va determina spectrofotometric extinctia solutiei (solutiilor) necunoscute, iar pe baza graficului se va stabili concentratia acesteia. De asemenea se va observa ca portiunea liniara a graficului reprezinta domeniul de concentratii pentru care legea Lambert -Beer este strict valabila.

2. Determinarea concentratiilor diferitelor forme ale hemoglobinei in solutii si in sange

Hemoglobina se poate afla in solutii sub trei forme diferite: oxihemoglobina, deoxihemoglobina si methemoglobina ( fig.6) . Formele oxi si deoxi trec reversibil una in cealalta in functie de presiunea partiala a oxigenului in solutie, au fierul heminic sub forma Fe ²⁺ si sunt active din punct de vedere fiziologic in procesul de transport al oxigenului. Forma met apare sub actiunea unor oxidanti puternici , are fierul heminic sub forma Fe³⁺ si este inactiva din punct de vedere fiziologic. Conform fig. 4. spectrele de absorbtie ale acestor forme difera intre ele , iar coeficientii de extinctie molari au valori diferite in functie de lungimea de unda. Punctele de intersectie a curbelor coeficientilor de extinctie se numesc puncte isosbestice, adica au aceeasi absorbtivitate pentru lungimea de unda corespunzatoare lor. In cazul hemoglobinei, un interes deosebit il reprezinta concentratia totala de hemoglobina in sange (hemoglobinemia ) dar si proportia de methemoglobina din hemoglobina totala. Concentratia hemoglobinei in sange (hemoglobinemia) se poate determina convertind toate formele de hemoglobina la methemoglobina, cu ajutorul unei solutii ajutatoare de ferocianura de potasiu, dupa care se efectueaza masurarea fotometrica a concentratiei la lungimea de unda 540 nm, unde absorbtivitatea molara (coeficientul molar de extinctie) are valoarea maxima ε = 11^. 10³ M^-1cm^-1.

Fie proba de sange care contine solutia de methemoglobina diluata de d ori fat din sangele proaspat recoltat. Extinctia probei in cuve de 1 cm grosime va fi:

E_Hb⁵⁴⁰ = ε_met^{540 .} c , de unde rezulta concentratia c_Hb = E_Hb⁵⁴⁰ / ε_met⁵⁴⁰, dar concentratia reala in sange va fi de d ori mai mare, adica

c_Hb = ( d / ε_met⁵⁴⁰) ^. E_Hb⁵⁴⁰.

Proportia de methemoglobina se calculeaza dupa determinarea extinctiilor solutiei de hemoglobina rezultata din hemoliza la doua lungimi de unda diferite: prima este 525 nm unde formele oxi si met au un punct isosbestic, iar a doua la 540 nm unde diferenta de absorbtivitate ale celor doua forme este maxima (vezi fig.6.) . Deoarece se lucreaza cu solutii saturate cu aer, in care se poate considera ca toata hemoglobina activa este sub forma oxi, cantitatea aflata sub forma deoxi se neglijeaza. La 525 nm cele doua forme au aceeasi absorbtivitate, deci extinctia se poate scrie sub forma:

E⁵²⁵ = ε⁵²⁵ .c_Hb, iar la 540 nm , unde absorbtivitatile difera ,

E⁵⁴⁰ = ε_oxi ⁵⁴⁰. c_oxi + ε_met ⁵⁴⁰. c_met.

Apoi se tine cont de faptul ca concentratia in forma oxi reprezinta de fapt diferenta

c_oxi = c_Hb - c_{met .}

Daca se calculeaza rapoartele coeficientilor de extinctie pentru cele doua forme de hemoglobina la 540 si respectiv 525 nm se obtine:

ε_met ⁵⁴⁰/ ε⁵²⁵ = 1.091, respectiv ε_oxi ⁵⁴⁰/ ε⁵²⁵ = 1.753.

Tinand cont de aceste valori, dupa un sir de calcule simple, relatia pentru procentul de methemoglobina din proba se poate scrie sub forma urmatoare:

MetHb % = (2.649-1,151. E⁵⁴⁰/ E⁵²⁵) :100 (1)

Prepararea solutiilor, citirea extinctiilor si prezentarea rezultatelor.

Se pregatesc doua eprubete curate si uscate. In prima se pipeteaza 5 ml de solutie methemoglobinizanta (continand fericianura de potasiu) iar in cealalta 5 ml de solutie hemolizanta ( continand amoniac 0,1%) . In fiecare se adauga cate 0,02 ml de sange proaspat recoltat, utilizand pipeta automata. Cele doua eprubete se agita si se lasa in repaus circa 5 minute.Dupa acest interval in prima eprubeta va aparea o coloratie bruna, caracteristica methemoglobinei, iar in a doua coloratia va fi rosie-rubinie, caracteristica oxihemoglobinei. Aceste probe se vor plasa in cuve standard de 1 cm. Pentru determinarea hemoglobinemiei se va citi extinctia solutiei din prima eprubeta (care contine intreaga cantitate de hemoglobina convertita la hemoglobina) la λ = 540 nm, fata de solutia methemoglobinizanta ca blanc. Valoarea obtinuta se noteaza E_Hb⁵⁴⁰. Procentul de methemoglobina se determina folosind ca blanc solutia hemolizanta si apoi citind extinctile solutiei din eprubeta a doua la 525 si respectiv 540 nm. Valorile se noteaza E⁵²⁵ respectiv E⁵⁴⁰.

Hemoglobinemia se va calcula conform formulei prezentata anterior tinandu-se cont de factorul de dilutie d = 5/ 0,02 = 251 si de valoarea ε_met ⁵⁴⁰ = 11^.10^-3 M^-1cm^-1. Astfel,

C_Hb = 22,8 E_Hb⁵⁴⁰ mM. (2)

Masa moleculara a hemoglobinei este 16 000 Da, o solutie milimolara contine deci 1,6 g Hb/100ml, deci concentratia de hemoglobina se mai poate exprima si astfel:

C_Hb = 36,8 E_Hb⁵⁴⁰ g/100ml sange. (3)

Procentul de methemoglobina se va calcula cu ajutorul formulei (1) .

Interpretarea rezultatelor se face tinand cont ca hemoglobinemia normala are urmatoarele valori, raportat la varsta subiectilor umani:

In mod normal mai putin 0,3 % din hemoglobina totala se afla sub forma de methemoglobina, aceasta valoare creste semnificativ in cazul unor intoxicatii cu substante oxidante cum ar fi nitriti, nitrati, chinone, nitribenzen, anilina, etc. Precizia metodei se incadreaza in limitele de ± 1%, chiar daca precizia aparatului este mult mai buna. Valorile necunoscute se pot determina si folosind modul de masurare cantitativa a spectrofotometrului, dupa ce in prealabil a fost salvata in memorie curba de etalonare. Este interesant de verificat daca rezultatele coincid.