Studiu prin RMN in impulsuri asupra timpilor de relaxare si de corelatie ai apei

1.Consideratii teoretice

Spectroscopia de rezonanta magnetica nucleara studiaza ranzitiile dintre nivelele de energie ale momentelor magnetice asociate spinilor nucleari, in camp magnetic. Intrucat comportamentul spinului nuclear este puternic influentat de vecinatatea nucleului si de dinamica unor procese la care acesta ia parte, tehnica RMN poate fi utilizata pentru a oferi informatii asupra structurii moleculare, sau a vitezei de desfasurare a unor procese moleculare - intre care viteza de reorientare rotationala a apei.

Se indica pentru inceput, caracteristicile generale ale tranzitiilor RMN, specificand informatiile de ordin structural si cinetic care se coreleaza cu ele.

Caracteristici generale ale tranzitiilor RMN

Este cunoscut ca spectroscopia RMN inregistreaza energia radianta absorbita de proba plasata intr-un camp magnetic constant, in functie de frecventa radiatiei incidenta pe proba. Liniile de absorbtie RMN sunt caracterizate de urmatorii patru parametrii:

a)           Timpul de relaxare spin-retea (sau "longitudinal") T₁, este o masura a timpului in care nucleele (mai precis componenta magnetizarii paralela cu campul magnetic aplicat) revin, in urma aplicarii unei perturbatii, la starea initiala de echilibru.

b)          Timpul de relaxare spin-spin (sau "transversal"), T₂, masoara interactiunile ce au loc intre spinii nucleari invecinati si care conduc la defazarea (randomizarea) componentilor magnetizarii in planul perpendicular pe directia campului magnetic aplicat.

c)           Deplasarea chimica se refera la pozitia diferita in spectru a unei linii de rezonanta, datorita campurilor magnetice locale diferite, cauzate de mediul electronic specific fiecarui nucleu (rezultatul naturii sale chimice si a vecinatatii diferite).

d)          Despicarea spectrala spin-spin este cauzata de interactiunea momentelor magnetice nucleare apartinand nucleelor vecine dintr-o molecula.

Odata cu dezvoltarea spectroscopiei RMN in impulsuri, a devenit posibila masurarea directa si cu exactitate a timpilor de relaxare T₁ si T₂ (aceasta din urma se putea determina relativ usor si prin RMN clasic). Dintre acestia, valorile T₁ pot fi interpretate teoretic cu mai mare usurinta.

Relatia dintre relaxarea magnetica si timpul de corelatie

al fluctuatiilor

Ambele tipuri de relaxare sunt produse de fluctuatiile valorilor locale ale campurilor magnetice si electrice, care la randul lor sunt datorate miscarii termice haotice, prezenta in oprice stare a materiei. Aceste fluctuatii sunt caracterizate sub aspectul persistentei (periodicitatii) lor de un timp dse corelatie, g_c

Teoria relaxarii demonstreaza ca interactiunile contribuind la T₁ trebuie sa fluctueze puternic la frecventa de rezonanta w_o, in timp ce acelea care contribuie la T₂ sunt forte fluctuante care moduleaza nivelele de energie ale spinilor la frecvente apropiate de 0, fara a cauza tranzitii intre ele (si deci nici schimb de energie cu reteaua).

Valoarea T₂ T₁, intrucat T₂ cuprinde efectul tuturor perturbatiilor asociate cu T₁, plus cel datorat interactiunilor dintre spinii nucleari. Inversul timpului de relaxare T₂, 1/T₂, determina largimea benzii de absorbtie a spectrelor RMN inregistrate in conditii obisnuite (nesaturate).

Relaxarea apei

Relaxarea apei (in agitatie termica haotica) se datoreaza interactiunii dipolare, dependenta de orientare, dintre spinii protonilor sai, si se bucura de un tratament teoretic special. Acesta tine cont de faptul ca cei doi spini sunt cuplati si se comporta ca o singura particula cu spinul 1 in loc de ½ (spinul protonului). Relatia care exprima dependenta vitezei de relaxare longitudinala a apei (1/T₁) de timpul de corelatie este:

in care g_N este factorul g nuclear, b_N este magnetonul Bohr nuclear, - este constanta lui Planck / 2p w_o este frecventa de rezonanta a apei, iar r este distanta dintre protonii moleculei de apa. Se poate scrie o relatie asemanatoare si pentru 1/T₂. Analizand forma acestor relatii se deduc urmatoarele proprietati:

la (conditie indeplinita la temperatura camerei), timpii de relaxare longitudinal si transversal sunt egali (o proprietate general valabila si pentru alte mecanisme de relaxare dominate de miscarea browniana) si sunt dati de:

la temperatura camerei in care simbolurile au semnificatia cunoscuta.

la , crescand vascozitatea lichidului, timpul de relaxare T₂ variaza in continuare liniar cu , dat T₁ executa o intoarcere (la ), devenind la limita timpilor de corelatie lungi, proportional cu

Fig.1.Timpii de relaxare a apei la 29 MHz (w 10⁸ rad/s) in functie de valoarea timpului de corelatie

In figura 1 se observa ca punctul corespunzand apei la temperatura camerei este situat la stanga si departat fata de punctul de intoarcere al curbei pentru T₁. Aceasta explica de ce viteza de relaxare T₁ creste (timpul T₁ scade) daca libertatea de rotatie a apei se restrange prin participarea ei in complexele de hidratare ale unor ioni (paramagnetici) sau in urma imobilizarii acestor complexe prin asocierea lor cu macromoleculele.

Timpul de corelatie se poate estima folosind urmatoarea relatie derivata de Debye, combinata cu formula lui Einstein pentru coeficientul de difuzie sferica (D') al unei molecule sferice (de raza a) ce se roteste intr-un mediu de vascozitate (h

Mentionam ca un tratament mai complet al relaxarii apei include in ecuatie si un termen suplimentar, care descrie relaxarea cauzata de difuzie moleculelor de apa vecine

unde D = coeficientul de difuzie, N = concentratia spinilor si b = diferenta minima de apropiere dintre spinii moleculelor invecinate (1,74Å ).

Metoda experimentala

Principiul masurarii timpilor de relaxare prin tehnica RMN in impulsuri

Spre deosebire de spectroscopia RMN clasica (in "unda continua") tehnica in impulsuri face uz de impulsuri    scurte de radiofrecventa, cu desfasurarea observatiilor dupa incetarea impulsurilor.

Procesul poate fi inteles in cadrul formal specific tratamentului lui Bloch pentru procesele de relaxare, adica adoptand un punct de vedere macroscopic, in care ne concentram asupra magnetizarii globale, M, a unei probe continand un numar mare de spini. In cadrul acestei teorii, magnetizarea M (ca si momentele magnetice individuale ale spinilor) se comporta ca un giroscop clasic; acesta se opune alinierii slae cu campul magnetic B_o (aplicat dupa directia notata Z), executand o miscare de precesie libera in jurul campului magnetic B_o, cu viteza unghiulara w_o ("Frecventa Larmor"). In absenta relaxarii precesia Larmor ar continua la nesfarsit, insa, drept consecinta a proceselor de relaxare, vectorul magnetizarii isi va atinge pozitia de echilibru, devenind aliniat cu directia Z. Un camp de radiofrecventa B₁, perpendicular pe B_o, ce oscileaza la frecventa Larmor, fiind sincronizat cu frecventa de precesie a spinilor, produce asupra magnetizarii un cuplu insemnat. Acesta, prin lucru mecanic efectuat asupra spinilor aflati in precesie, este raspunzator de absorbtia de puetere, deci, de fenomenul de rezonanta.

Fig.2. Sistemul de referinta rotitor

Privit in sistemul de referinta (fig.2), x'y'z' care se roteste (impreuna cu B₁) in jurul axei z' (II z) cu o viteza unghiulara egala cu pulsatia campului de radiofrecventa, efectul lui B₁ este de a roti vectorul magnetizarii in jurul directiei lui B₁ (care defineste axa x'= printr-un unghi (q) care depinde de intensitatea campului de radiofrecventa B₁ si de timpul de aplicare. Daca campul de radiofrecventa este aplicat sub forma unui impuls de intensitate B₁ si de durata t_p, acest unghi q este dat de

(rad)

Un asa zis impuls de 90° aduce magnetizarea M in planul (x', y') perpendicular pe directia campului magnetic aplicat, si anume, aliniat cu axa y'. Precesia libera, in acest plan, a momentelor magnetice individuale ce alcatuiesc magnetizarea M, dupa incetarea impulsului de 90°, este supusa proceselor de defazare (cauzate de relaxarea de tip T₂ si de efecte instrumentale), ceea ce face ca magnetizarea globala a probei, M, aflata in precesie    in acest plan, sa decada la zero cu un timp caracteristic T₂^* ( T₂).

Un impuls de 180° aduce pe M in orientarea aliniata cu axa - z. Viata acestei stari, ca de altfel a oricarei alte orientari a vectorului M diferita de orientarea de echilibru (adica cea paralela cu axa +z), este limitata de procesele de relaxare de tip T₁ care fac momentele magnetice sa paraseasca orientarea de neechilibru si sa revina la orientarea de echilibru, cu o viteza dictata de T₁.

Timpii de relaxare amintiti mai sus se gasesc in relatia de ordine: T₂^* T₂ <T₁.

Aparatele de RMN in impulsuri inregistreaza semnalul indus intr-o bobina receptoare, de catre orice moment magnetic aflat in miscare de precesie in planul xy. Astfel, dupa un impuls de 90°, se inregistreaza un semnal, numit inductia libera, a carui amplitudine scade de la o valoare maxima (proportionala cu M) pana la 0, cu timpul caracteristic T₂^*. Avand posibilitatea de a inregistra amplitudinea semnalului de inductia libera si folosind un program de impulsuri adecvat se pot determina timpii de relaxare T₁ si T₂ ai probei.

Pentru determinarea lui T₂ sunt adecvate urmatoarele secvente de impulsuri:

Secventa denumita "180° - t - 90°": Primul impuls inverseaza M in -M, unde este lasat sa decada cu timpul carcateristic T₁. Pentru a masura valoarea magnetizarii (de pe directia Z) atinsa dupa scurgerea unui timp t, se aplica impulsul de 90°, care aduce aceasta magnetizare in planul x'y' si o masoara prin valoarea initiala a amplitudinii semnalului inductiei libere. Timpul T₁ se determina din curba exponentiala reprezentata de rezultatul aplicarii repetate a procedurii, cu timpi diferiti.

Secventa 90°- t - 90°, aplicabila daca T₁>>T₂: Intrucat, in aceste conditii, inductia libera dupa primul impuls decade la zero datorita defazarii spinilor, inainte de magnetizarea M_z sa fi ajuns la valoarea de echilibru, prin al doilea impuls se masoara aceasta valoare, stinsa de magnetizarea M_z dupa timpul arbitrar t (ca mai sus).

Unele programe de impulsuri se termina prin secventa 90° - t t - 90° (care insumeaza o rotatie totala de 360°), ce are rolul de a restabili mai rapid starea initiala de echilibru a sistemului, in cazul timpilor de relaxare lungi comparativ cu T₂ (ideal pentru T₁=T₂ >>T₂). Runda urmatoare de impulsuri poate incepe dupa o asteptare de 4t

Masuratori experimentale

In aceasta lucrare se determina timpul de corelatie t_c al apei, din valoarea timpului de relaxare T₁ masurat experimental pe baza ecuatiei si se compara cu valoarea sa teoretica calculata pe baza ecuatiei.

Pentru masurarea timpului de relaxare T₁ se foloseste spectrometrul RMN in impulsuri de productie romaneasca AREMI 78 echipat cu unitatea de prelucrare numerica a datelor. Pentru efectuarea masuratorilor se va apela la manualul de folosire a aparatului.

Proba consta din 1 cm³ apa distilata, in interiorul unei microeprubete. Se determina timpul de relaxare T₁ al probei prin metoda revenirii magnetizarii, folosind programul de impulsuri 180 - t - 90, cu timpul de asteptare, t, in multiplii de aproximativ 1 secunda.

Se determina t_c din ecuatie utilizand pentru parametrii ce intervin urmatoarele valori numerice:

Pentru comparatie se calculeaza t_c pe baza ecuatiei, utilizand urmatoarele valori numerice pentru parametrii ce intervin (valabile pentru temperatura mediului ambiant 20°C):

Se compara cele doua valoriale timpului de corelatie t_c, indicand originea probabila a eventualelor diferente.

In "Consideratii teoretice" au fost strecurate indicii despre cel putin doi dintre numerosii factori care pot influenta viteza de relaxare a apei. Sa se identifice acesti factori si sa se imagineze experiente simple prin care sa se evidentieze efectul lor.

Observatii privind utilizarea masuratorilor relaxarii apei in cercetare

Substantele paramagnetice (ce poseda un electron neimperecheat, ionii unor metale, radicalii liberi) daca sunt prezente in solutie, reprezinta o sursa puternica de relaxare. Viteza de relaxare a apei creste in continuare atunci cand specia paramagnetica (de exemplu ionul Mn²⁺) se leaga la o molecula mai mare (de exemplu, o macromolecula proteica) ce se introduce in solutie. In acest caz, sistemul contine apa libera, neinfluentata de ionii paramagnetici de Mn²⁺, alaturi de apa legata la Mn²⁺ este legat de catre proteina. La realizarea asocieraa Mn²⁺ - proteina, se modifica constanta de timp care descrie rotatia complexului paramagnetic (alaturi de gradul de expunere al Mn-ului fata de solvent, care depinde de geometria exacta a locului de legare al Mn-ului la suprafata macromoleculei proteice). Aceste efecte, pe care noi le masuram prin modificarea timpului de relaxare T₁ al apei, reflecta numarul de ioni de Mn legati de proteina, si deci, ca in orice tehnica spectroscopica, ele pot fi exploatate pentru a determina constanta de legare a Mn²⁺ la proteina, un parametru fundamental care caracterizeaza orice complex chimic.

Pe de alta parte, observam ca ecuatia stabileste o relatie intre timpul de relaxare (T₁) al unui proton al apei, distanta r pana la un moment magnetic perturbator vecin (in cazul acesta, celalalt proton) si timpul de corelatie t_c caracteristic reorientarii rotationale a vectorului r, permitand astfel determinarea unuia dintre acesti trei parametri, daca ceilalti doi se cunosc. De aceea, masuratorile de timpi de relaxare (pe alte sisteme decat apa), pot fi folosite ca mijloc de calcul al unor distante intermoleculare.

In sfarsit in conditii experimentale diferite, timpii de relaxare pot fi utilizati pentru a caracteriza complexele moleculare dintr-o solutie sub aspectul timpului lor mediu de viata.