Tehnica real-time pcr

Tehnica

REAL-TIME PCR

PCR este o tehnica de biochimie si biologie moleculara, care permite amplificarea exponentiala a unei secvente de ADN (secventa de interes), in afara unui organism viu.

FAZELE REACTIEI PCR

Pentru intelegerea limitarilor tehnicii clasice de PCR, este important de mentionat ce se intampla in timpul acestei reactii.

Reactia PCR prezinta 3 faze (figura):

1. Faza exponentiala: in aceasta etapa, are loc dublarea cantitatii de ADN la fiecare ciclu, eficacitatea reactiei fiind de 100%. Reactia este foarte precisa si specifica.

2. Faza liniara: in aceasta faza, componentele reactiei incep sa fie consumate, reactia incetineste si produsii se pot degrada.

3. Faza de platou: aceasta este faza in care are loc detectarea ampliconilor in gel de agaroza (PCR clasic). Reactia s-a oprit si produsii incep sa se degradeze rapid.

LIMITARILE TEHINICILOR TRADITIONALE DE PCR

1. Rezolutie scazuta
2. Consuma mult timp
3. Analiza neautomatizata a produsilor de amplificare
4. Rezultatele nu sunt exprimate cantitativ
5. Discriminarea ampliconilor se face numai pe baza dimensiunii
6. Colorarea cu bromura de etidiu nu are valoare cantitativa
7. Procesarea datelor se face la sfarsitul reactiei de PCR

Exista o relatie direct proportionala intre cantitatea de matrita care a intrat in reactie si cantitatea de amplicon la orice moment al reactiei.

Prin Real-Time PCR se determina cantitatea de produs de amplificare acumulata in diferitele momente ale reactiei. Datele sunt apoi masurate in timpul fazei exponentiale a procesului, faza care reprezinta momentul optim de analiza

PCR "in timp real" este o metoda de cuantificare care ofera o analiza mai usoara si mai precisa a produsilor de amplificare, comparativ cu metodele clasice.

Acumularea datelor de amplificare se realizeaza cu ajutorul unui fluorocrom, a carui concentratie creste pe parcursul reactiei, permitand cuantificarea produsilor de amplificare pe masura ce acestia se formeaza

Exista 3 sisteme majore de monitorizare a fluorescentei de-a lungul reactiei de amplificare: agenti de legare la ADN, probe de hidroliza si probe de hibridizare

• Agenti de legare la ADN: tehnica de colorare cu SYBR Green

Una dintre variantele reactiei de Real Time PCR utilizeaza in calitate de colorant SYBR Green.

SYBR Green are proprietatea de a se lega la nivelul curburii minore a ADN-ului dublu catenar; in momentul in care se leaga, fluorescenta sa este amplificata. Pe masura ce reactia progreseaza si cantitatea de ampliconi creste, creste direct proportional si cantitatea de fluorocrom fixata, si implicit, nivelul de fluorescenta

• Probe de hidroliza: The 5' Nuclease Assay - TaqMan probe

Se bazeaza pe activitatea 5' exonucleazica a AmpliTaqGold Polimerazei si pe fenomenul numit FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer .

Se uitlizeaza un fragment oligonucleotidic, TaqMan® Probe complementar fata de secventa de interes (intre primeri). Proba prezinta la fiecare capat cate un fuorocrom: Reporter, la capatul 5' si Quencher (engl. stingator), la capatul 3'.

Cand proba este intacta, fluorescenta emisa de Reporter este inhibata de cea emisa de Quencer. Cand proba este clivata de activitatea 5' exonucleazica a enzimei, fluorescenta emisa de Reporter creste.

• Probe de hibridizare

Se utilizeaza doua secvente oligonucleotidice: una care poarta la capatul 3' un fluorocrom donor si cealalta este marcata la capatul 5' cu un fluorocrom acceptor.

In timpul alinierii, probele hibridizeaza intr-un aranjament cap-coada si energia este transferata de la donor la acceptor, printr-un mecanism FRET.

Fluorescenta emisa de acceptor poate fi masurata.

PARAMETRII DE CUANTIFICARE ai reactiei Real Time PCR

Acestia sunt: linia "prag" (Th), "ciclul prag" (CT) si curba de topire (Tm)

Curba de amplificare ofera informatii valoroase privind analiza cantitativa a ADN si/sau ARN. Linia "prag" (threshold) reprezinta punctul la care fluorescenta probei devine decelabila, depaseste nivelul fluorescentei de fond. Linia "prag" este setata in timpul fazei exponentiale a reactiei, avand in vedere ca, in aceasta faza, se face cel mai bine distinctia dintre probe. Ciclul la care se atinge acest nivel este numit "ciclu prag" (cycle threshold CT ). Acesti doi parametri, Ct si Th, sunt foarte importanti pentru analiza datelor.

O valoare mica a Ct semnifica o cantitate initiala mare a matritei

Curba de topire

Orice molecula de ADN dublu catenara are o temperatura de topire (Tm) la care 50% din ADN este monocatenar. Temperatura de topire depinde de lungimea fragmentului, de continutul in baze GC. Cand se folosesc fluorocromi ce se leaga la ADN, la o crestere a temperaturii are loc o descrestere brusca a nivelului de fluorescenta

descrestere detectata atunci cand se atinge Tm, datorita eliberarii fluorocromului de la nivelul ADN.

Dupa terminarea programului de PCR, aparatul poate fi programat sa realizeze o curba de topire.

Semnificatia curbei de topire: cand are loc o amplificare specifica (numai secventa de interes este amplificata), toate probele vor avea o singura Tm. Amplificarile nespecifice si dimerii de primeri pot fi detectati prin analiza curbei de topire, deoarece vor prezenta alte Tm fata de fragmentul de interes (vezi figura de mai jos).

Analiza curbei de topire poate fi folosita si in identificarea de noi mutatii pentru ca o mutatie noua va prezenta o alta Tm precum si in discriminare alelica

Aplicatiile reactiei     de Real-Time PCR

Cuantificarea expresiei genice

Verificarea datelor de microarray

Monitorizarea eficientei terapiilor

Cuantificare virala (detectarea numarului de particule virale)

Identificarea agentilor patogeni

Studiul ADN mitocondrial

Imunoprecipitarea cromatinei

Determinarea instabilitatii microsatelitilor

Determinarea nivelului de metilare a ADN

Detectia inactivarii cromozomului X

Monitorizarea post-transplant a grefelor de tesut sau de organe

Diagnosticul cancerului

Cuantificarea ADN in medicina forensica (medicina legala)

Discriminare alelica si calcularea frecventei alelelor in populatii

metode de cuantificare a reacTiei de real-time pcr

Cuantificarea absoluta

Se foloseste pentru identificarea numarului absolut de molecule, a cantitatii absolute dintr-o proba necunoscuta, prin compararea valorii Ct fata de o curba standard.

O curba standard este generata cu ajutorul unei serii de dilutii seriale realizate dintr-o proba de referinta cu concentratie / numar de molecule cunoscute (ADN genomic, ARN, ADN plasmidial). Din reprezentarea grafica a log din conc sau nr de còpii, fata de valorile Ct, se obtine curba standard.Curba standard este folosita pentru estimarea concentratiei probelor necunoscute.

Aplicatii:

Medicina forensica

Cuantificare virala

Cuantificarea patogenilor din alimente

Identificarea si cuantificarea OMG

Identificarea mutatiilor (duplicatii)

Cuantificarea relativa

Se foloseste pentru analiza modificarilor de expresie a genelor in proba de interes, fata de o proba de referinta. Metoda foarte utila in analiza modificarilor de expresie a unor gene (oncogene si gene supresori tumorali) in cancer astfel de modificari pot fi considerate markeri tumorali, cu valoare de prognostic in evolutia bolii canceroase si in monitorizarea raspunsului la tratament, al pacientilor.