Transportul prin membrana celulara

O celula vie, fiind un sistem termodinamic deschis, are in permanenta schimburi de substanta cu mediul extern. Aceste schimburi se realizeaza in ambele sensuri prin intermediul unor mecanisme de transport prin membrana celulara.

Mecanismele de transport sunt diferite, fiind impuse de natura substantei transferate, de tipul celulei si de aportul ei energetic in schimbul de materie.

Transportul unor particule de dimensiuni mari (macromolecule, agregate macromoleculare) se realizeaza prin distrugerea locala a integritatii membranei celulare, ca de exemplu in cazul fenomenelor de:

fagocitoza - care reprezinta inglobarea unor particule solide de dimensiuni relativ mari, prin emiterea de prelungiri protoplasmatice (pseudopode), si

pinocitoza - care este inglobarea de picaturi microscopice de lichid extracelular, ce contine coloizi si macromolecule, prin formarea unei vezicule sau a unui canal in membrana prin care picatura trece in citoplasma.

In ambele fenomene, dupa transport, membrana se reface datorita plasticitatii sale deosebite.

In cazul particulelor de dimensiuni mici (micromolecule, atomi, ioni, molecule de apa, etc) transferul de substanta are loc cu pastrarea integritatii membranei celulare prin:

transport pasiv - care se realizeaza datorita gradientilor de concentratie, de presiune, de potential electric, in sensul lor, fara consum de energie. Depinde de structura si proprietatile fizico-chimice ale membranei celulare si are loc prin procese de difuzie si osmoza.

transport activ - ce are loc impotriva gradientilor de concentratie, de potential electric sau presiune osmotica si necesita consum de energie metabolica, care se obtine din reactiile biochimice exergonice. Se realizeaza cu ajutorul moleculelor transportoare, care au proprietati enzimatice.

In acest capitol se trateaza transferul de substanta prin mecanisme de transport pasiv si activ.

1. Transportul pasiv

Transportul pasiv este un proces de difuzie al moleculelor si ionilor prin membrana celulara. Se realizeaza fara consum de energie metabolica, in sensul gradientilor electrochimici sau de presiune.

Membrana celulara avand o structura de bistrat lipidic, o particula pentru a trece de pe o fata pe cealalta a membranei, trebuie sa traverseze zone hidrofile si hidrofobe. Din acest motiv, mecanismele de transport sunt diferite pentru particule hidrofile (ioni si molecule polare) si particule hidrofobe (molecule nepolare), respectiv pentru particule hidrosolubile si liposolubile. In functie de natura particulelor transportul pasiv poate avea loc prin:

difuzie simpla prin stratul bilipidic,

difuzie prin canale,

difuzie facilitata,

osmoza (in general pentru moleculele de apa).

Transportul pasiv are tendinta de a aduce sistemul celula-mediu extern in stare de echilibru. Procesul inceteaza cand energia potentiala totala are aceeasi valoare in cele doua compartimente extra- si intracelular.

1.1. Difuzia simpla

Substantele ce traverseaza membrana celulara prin difuzie trebuie sa fie solubile in lipidele care alcatuiesc dublul strat    membranar. In general, solubilitatea unei substante este diferita in mediul apos si in membrana lipidica fluida.

Se numeste coeficient de partitie solvent-apa (b raportul dintre solubilitatea intr-un solvent (in acest caz membrana lipidica fluida) si solubilitatea in apa.

In cele doua compartimente extracelular si intracelular separate de membrana se gasesc medii apoase: lichidul interstitial, respectiv citoplasma, de concentratii diferite. La interfata solutie-membrana apare cate un salt de concentratie, determinat de coeficientul de partitie b 1. (Fig. ). Intre concentratia membranei (C_m) si concentratia solutiei apoase ( C ) exista relatia:

C_m = b C (7.1)

Tinand cont de relatia (7.21) de definitie a coeficientului de permeabilitate (vezi Legile lui Fick), permeabilitatea prin membrana celulara devine:

(7.2)

unde D_m - coeficientul de difuzie al membranei, iar d - grosimea membranei.

Fig. Saltul de concentratie la interfetele membranei
datorat coeficientului de partitie.

Se poate constata ca permeabilitatea membranei celulare depinde de caracteristicile particulei transferate (b) si de proprietatile bistratului lipidic (D_m). Astfel, pentru ionii din mediul apos de dimensiuni mici (r = 1 ) coeficientul de partitie este de ordinul b 10^-60, deci permeabilitatea membranei, tinand cont de relatia (7.2), este extrem de mica. Macroionii nu pot difuza prin membrana, deoarece au dimensiuni mari si sarcina electrica.

Moleculele hidrofobe (nepolare) pot traversa membrana daca dimensiunile lor sunt mici si se pot "dizolva" in matricea lipidica a membranei, cum sunt alcoolii, acizii grasi, unele medicamente (exemplu penicilina etc).

In concluzie, membrana celulara este o bariera selectiva pentru ionii anorganici, macroionii organici, macromoleculele polare sau hidrofobe. Prin difuzie simpla doar moleculele mici nepolare pot traversa membrana.

1.2. Difuzia prin canale

Difuzia ionilor (Na⁺, K⁺, Cl^-, Ca²⁺, Mg²⁺ etc) prin membrana are loc prin intermediul unor structuri proteice specializate, ce strabat membrana pe toata grosimea ei, numite canale. In general, canalele permit trecerea ionilor in ambele sensuri, directia lor de deplasare fiind determinata de gradientul electrochimic.

Canalul ionic trebuie considerat o structura cu proprietati de selectivitate si functii complexe. Canalele ionice au caracteristici asemanatoare cu cele ale enzimelor, cum ar fi: energie redusa de transport, specificitate pentru un anumit ion, posibilitate de saturare la concentratii mari, posibilitate de inhibare. Ele mediaza transportul pasiv al ionilor.

Transportul ionilor prin canale poate fi descris formal printr-o cinetica de tip Michaelis-Menten, specifica reactiilor enzimatice. Astfel, canalul ionic poate fi considerat enzima E, care formeaza un complex (ES) cu ionul ce trebuie transferat, el reprezentand substratul S:

(7.3)

unde S₁ si S₂ reprezinta concentratia ionului in compartimentul extracelular, respectiv intracelular.

Factorii care influenteaza selectivitatea canalului ionic sunt urmatorii:

bariera energetica de legare a ionului de canal, exprimata prin constanta de viteza k₊;

bariera energetica de translocare a ionului de pe o fata pe alta a membranei, exprimata prin constanta de viteza k₂ ;   

concentratia de saturare a canalului.

Eficacitatea de transport a canalelor este foarte mare, astfel printr-un singur canal pot trece 10⁶ - 10⁸ ioni/s.

Canalele pentru cationi sunt mult mai frecvente decat cele pentru anioni. Astfel, canalele ionice pentru Na⁺, K⁺, si Ca²⁺ sunt proteine cu masa de cca. 300.000 Da, existand intre ele o similitudine: reduc bariera energetica cauzata de interiorul nepolar al stratului bilipidic (de cca. 60 kcal/mol) prin realizarea la nivelul stratului membranar a unei cai polare apoase. Deci, mediaza difuzia cationilor (Fig. 7.3).

Fig.7.3. Canale ionice transmembranare.

Fluxul ionilor Na⁺ si K⁺ prin membrana celulara se realizeaza conform gradientului electrochimic: un influx pentru Na⁺ si un eflux pentru K⁺. Acesti doi ioni joaca rolul cel mai important in stabilirea potentialului de repaus al membranei si in transportul substantelor nutritive, respectiv al produsilor de catabolism. Daca in anumite situatii permeabilitatea membranei pentru acesti ioni se schimba, ei pot fi utili ca traductori de semnale.

Concentratia ionilor Ca²⁺ in mediul intracelular este mult mai mica decat in cel extracelular, aceasta disproportie permitand celulei utilizarea Ca²⁺ ca mesager in declansarea unor functii fiziologice. Are un rol important in memtinerea contractilitatii cardiace, in procesele de cuplare stimul-raspuns, in mentinerea integritatii celulare.

Deschiderea sau inchiderea canalului ionic se realizeaza printr-o modificare conformationala a proteinei canal si se poate face:

electric, prin modificarea potentialului de membrana (exemplu canalele de Na⁺ si K⁺ din membrana axonala);

chimic, prin moleculele ce se leaga specific la proteina canal (exemplu: canalul ionic de Na⁺ si Ca²⁺ din membrana celulei fotoreceptoare controlat de guanozinmonofosfatul ciclic GMP_c ,sau canalul de acetilcolina);

prin alte mecanisme (exemplu canale sensibile la variatiile de presiune).

Selectivitatea canalelor se realizeaza prin diferite mecanisme, de regula cunoscute. Exceptie face canalul de Na⁺, al carui mod de selectivitate nu este complet elucidat.

S-au descoperit doua posibilitati de transport pasiv ionic, la care, spre deosebire de canalele ionice selective, exista coordonari intre diferiti ioni. Astfel,    s-a constatat ca pentru concentratii mici de ioni de calciu (maxim 1mmol/l in mediu intracelular) exista un canal de eflux de K⁺ deschis, numit canal de K⁺ activat de Ca²⁺. De asemenea, exista un canal membranar numit schimbator de Na⁺-Ca²⁺, care transporta acesti ioni fara consum de energie (Fig.7.4.).

Fig.8.4. Mecanisme de transport ionic pasiv

a)    canal de K⁺ activat deCa²⁺

b)    schimbator Na⁺-Ca²⁺

In concluzie, particulele incarcate (ioni) sunt transportati prin membrana prin difuzie cu ajutorul canalelor ionice, care din punct de vedere electric au o rezistenta mica, respectiv o conductanta constanta, de ordinul 10^-12 S (Siemens).

1.3. Difuzia facilitata

Moleculele hidrofile mari, cum sunt majoritatea factorilor nutritivi si anumiti ioni, nu pot trece nici matricea lipidica si nici prin canalele ionice, nefiind liposolubile. Transferul acestora de pe o fata pe cealalta a membranei poate avea loc printr-un transport mediat de o molecula transportoare, proces cunoscut sub numele de difuzie facilitata.

Transportul de substanta prin difuzie facilitata, desi are loc in sensul gradientului electrochimic, se desfasoara cu viteze mai mari decat valorile date de legile difuziei simple. De regula, molecula transportoare este o proteina specifica cu rol enzimatic. Difuzia facilitata poate fi descrisa tot pe baza cineticii Michaelis-Menten, avand caracteristici comune cu cataliza enzimatica, cum ar fi:

fiecare proteina are un loc specific de legare a substratului (molecula ce trebuie translocata);

viteza transportului este maxima cand toate locurile de legare ale proteinei sunt ocupate;

difuzia depinde de pH;

exista o inhibitie competitiva cu compusi similari si necompetitiva prin alte substante.

Proteina transportoare se poate afla in doua stari conformationale diferite, avand un loc de legare pe una din fetele membranei.

Mecanismul transportului facilitat consta in crearea unei stari legate intre proteina transportare P si molecula de transferat M, deci formarea unui complex proteina-molecula. Modificarea conformationala are drept rezultat transferul complexului pe cealalta fata a membranei si eliberarea moleculei M (Fig.7.5.). Viteza de reactie este proportionala cu concentratia substratului, asadar transportul se desfasoara in sensul gradientului chimic.

Acest tip de difuzie facilitata se cunoaste si sub denumirea de mecanism ping-pong. Apare la transportul glucozei, glicerolului, neelectrolitilor, ureei, aminoacizilor.

Fig. 7.5. Difuzia facilitata: mecanism ping-pong. M - molecula transferata,
P₁,P₂ - proteina in starea conformationala 1, respectiv 2.

Eficacitatea transportului mediat de o molecula transportoare este mult mai mica decat a celei prin canale. De exemplu, transportul de glucoza prin membrana eritrocitara mediaza transferul a cca. 300 molecule/s.

Un caz particular al difuziei facilitate il constituie transportul ionilor prin formarea in jurul lor a unor structuri hidrofobe, care le permit difuzia prin stratul bilipidic. Se numeste ionofor o substanta, care inclusa in membrana celulara, permite translocarea ionilor de pe o fata pe cealalta.

Ionoforii mobili sau carausii sunt proteine, de regula peptide ciclice, care au o zona polara capabila sa capteze un ion. Mecanismul de transport (Fig.7.6.) poate fi imaginat ca un lant de reactii:

S⁽¹⁾ + C⁽¹⁾ SC⁽¹⁾ SC⁽²⁾ S⁽²⁾ + C⁽²⁾ (7.4)

unde: S - substratul (ionul de transportat)

C - proteina caraus.

Fig. 7.6. Mecanism de transport cu ionofori mobili.

Fluxul de ioni este pasiv, transportul avand loc in sensul gradientului electrochimic.

Daca se considera afinitatea substratului (ionului) fata de proteina aceeasi pe ambele fete ale membranei si N un numar cunoscut de proteine din membrana, in prima aproximatie, lantul de reactii este determinat de miscarea proteinei de pe o parte pe alta a membranei. Atunci, numarul de ioni transportati este:

dN/dt = - k N (x₁ - x₂) (7.5)

unde: k - constanta de reactie

x₁, x₂ - fractiile de saturare ale proteinelor pe cele doua fete.

Se poate constata ca transportul inceteaza cand substratul are aceeasi concentratie in ambele compartimente despartite de membrana sau cand fractiile de saturare ale proteinelor pe cele doua fete sunt egale.

Ionoforii mobili au o specificitate pentru un anumit ion, de exemplu: valomicina pentru K⁺, gramicidina pentru Na⁺.

In ce priveste transportul apei, respectiv al protonilor, se realizeaza atat prin difuzie simpla, cat si prin pori aposi (canale). Din datele experimentale s-a constatat ca permeabilitatea membranelor pentru apa este mult mai mare decat ceea ce ar corespunde celor prezentate mai sus. Mecanismele de transport al apei sunt mai complexe, un rol important avand gradientul de presiune osmotica.

In concluzie, membrana celulara poate fi traversata prin transport pasiv de molecule mici hidrofobe prin difuzie simpla, de ioni prin canale sau difuzie facilitata si de molecule hidrofobe mari prin difuzie facilitata. Permeabilitatea membranei pentru o specie moleculara sau ionica caracterizeaza capacitatea particulei respective de a traversa in mod pasiv membrana, indiferent de mecanismul de transport.

2. Transportul activ

Transportul activ are loc impotriva gradientilor de concentratie, de potential electric sau de presiune osmotica, necesitand consum de energie metabolica. Din acest motiv, procesul este cuplat cu reactii biochimice exergonice, donoare de energie libera.

2.1. Transportul activ primar

Transportul activ primar este determinat de existenta unei distributii asimetrice a ionilor in cele doua compartimente extra- si intracelular despartite de membrana celulara.

Substanta este transferata de pe o fata pe cealalta a membranei celulare prin intermediul unor molecule transportoare cu proprietati enzimatice.

Transportul activ este de doua tipuri:

primar - realizat prin pompe ionice, fiind cuplat cu o reactie producatoare de energie metabolica;

secundar - care este cuplat cu transportul simultan al unei alte substante in sensul gradientilor.

Transportul activ este o caracteristica fundamentala a materiei vii si permite adaptarea la conditiile de mediu.

Se realizeaza prin intermediul unei proteine transportoare cu rol enzimatic, care leaga ionul pe o parte a membranei si suferind modificari conformationale il "pompeaza" pe cealalta parte. Acest mecanism a primit denumirea generica de pompa ionica.

Reactia de transfer, endergonica, este cuplata cu o reactie exergonica, de obicei hidroliza ATP:

ATP + H₂O ADP + P_i cu DG = -7,3 kcal/mol    (7.6)

unde ATP - adenozintrifosfat, ADP - adenozindifosfat, P_i - fosfat anorganic.

In functie de ionii specifici translocati, in organismele vii exista mai multe tipuri de pompe ionice.

a)     Pompa Na⁺/ K⁺.

Pompa ionica Na⁺/ K⁺ transporta ionul Na⁺ din mediul intracelular (i) spre mediul extracelular (e) si ionul K⁺ din exterior spre interiorul celulei, concentratiile celor doi ioni in mediile respective fiind [Na⁺]_i << [Na⁺]_e si [K⁺]_i >> [K⁺]_e. Deci, transferul ionilor se face in sens invers gradientului electrochimic, necesitand consum de energie metabolica.

Proteina transportoare cu rol enzimatic este ATP-aza specifica, ce are doua    stari conformationale distincte: X cu locuri de legare pe fata interna si Y cu locuri de legare pe fata externa a membranei.

Mecanismul de functionare al pompei Na⁺/ K⁺ este ilustrat in figura 7.7.

Fig.7.7. Mecanismul pompei Na⁺/ K⁺.

Forma conformationala X leaga pe fata interna a membranei ATP si ioni de sodiu, formand complexul    X-ATP-3Na⁺. Legarea sodiului determina hidroliza ATP, ceea ce duce la fosforilarea enzimei si eliberarea de ADP. Enzima se transforma in forma Y, astfel ionii Na⁺ sunt transferati pe fata externa unde sunt eliberati. Aceasta forma leaga ionii de potasiu formand complexul Y-P_i-2K⁺. Legarea K⁺ determina defosforilarea enzimei si trecerea ei in forma X, iar ionii K⁺ sunt translocati pe fata interna a membranei. Astfel se inchide un ciclu in care sunt transportati 3 ioni de sodiu spre lichidul interstitial si 2 ioni de potasiu spre mediul celular.

Pompa Na⁺/ K⁺ poate fi inhibata de catre glicozidele cardiotonice (digitala si oubaina) si de oligomicina, care impiedica eliberarea ionului Na⁺ din complexul enzimatic. De asemenea, ATP-aza Na⁺/ K⁺ specifica poate lega in locul fosfatului (P_i) vanadatul, care care nu mai disociaza, blocand astfel pompa.

Stoechiometria pompei Na⁺/ K⁺ poate fi exprimata prin reactia:

3(Na⁺)_i + 2(K⁺)_e + ATP 3(Na⁺)_e + 2(K⁺)_i + ADP + P_i (7.7)

Se constata ca la fiecare ciclu de functionare al pompei are loc un transfer net de sarcina pozitiva (1Na⁺) spre exterior, ceea ce determina polarizarea menbranei: pozitiv spre exterior si negativ in interior.

In conditii fiziologice normale, tinand cont de numarul de cicluri efectuate in unitatea de timp ( 175 cicluri/s) curentul transmembranar creat de pompa este de ordinul 10^-15 A. Cunoscandu-se rezistenta membranei celulare de 10¹¹ -10¹² W, diferenta de potential este de ordinul mV sau chiar mai mica are o contributie foarte mica la potentialul de repaus al membranei.

2.2. Transportul activ secundar

Transportul activ secundar reprezinta transportul unei substante impotriva gradientului de concentratie, cuplat cu transportul altei substante in sensul gradientului de concentratie, asigurat de un transport activ primar. Cele doua substante sunt translocate de pe o fata pe alta a membranei celulare de aceeasi proteina transportoare.

Prin transportul activ secundar pot fi transferati aminoacizii, acizii mono- si dicarboxilici, acizii biliari, glucidele, precum si diversi ioni de fosfat, sulfat, bicarbonat, calciu.

Transportul activ secundar este intalnit in tesuturile epiteliale, cum ar fi tesutul intestinal si renal.

Transportul activ secundar are un consum de energie metabolica mai redus decat transportul activ pasiv, deoarece utilizeaza energia furnizata de gradientul electrochimic mentinut de pompa ionica.

Din punct de vedere al sensurilor fluxurilor de substanta, transportul activ secundar este de doua tipuri: antiport si simport.

a)     Antiport (contratransport)

Antiportul transporta o substanta in sensul gradientului ei electrochimic, mentinut prin transport activ primar si o alta substanta in sens contrar gradientului ei. Acest transport activ secundar este cunoscut si sub denumirea de contratransport.

Mecanismul de functionare al pompei antiport este asemanator cu cel al pompei ionice, dar cu consum energetic redus. Astfel, proteina transportoare (T), ce se poate transforma conformational, leaga pe fata (1) a membranei o substanta (S) pe care o transloca pe fata (2) a membranei, unde leaga o alta substanta (P) transferand-o pe fata (1) a membranei (Fig. 7.8).

Fig.7. 8. Pompa antiport - mecanism.

Viteza de transport depinde de concentratiile celor doua substante pe fetele membranei unde sunt legate de proteina, mai exact de produsul acestor concentratii.

In cazul unor coeficienti stoechiometrici ai reactiei enzimatice egali cu unitatea (s=p=1), la echilibru, vitezele de transport pe cele doua fete sunt egale:

S₁ P₂ = S₂ P₁     (7.8)

respectiv raportul concentratiilor este:

(7.9)

Generalizand, daca sunt transportati s moli de substanta (S) si p moli de substanta (P), raportul concentratiilor devine:

(7.10)

Astfel, se constata ca raportul concentratiilor substantelor transportate depinde de stoechiometria reactiei enzimatice.

Un exemplu de contratransport este antiportul Na⁺/Ca²⁺, care asigura o concentratie scazuta de ioni de calciu in interiorul celulelor tesutului muscular cardiac

b)    Simport (cotransport)

Simportul asigura transportul a doua substante in acelasi sens, din acest motiv este denumit si cotransport. Proteina transportoare leaga pe aceeasi fata a membranei ambele substante, una dintre ele fiind transferata in sensul gradientului de concentratie, mentinut tot de transportul primar activ, si cealalta in sens contrar gradientului (Fig. 7.9).

Fig. 7.9. Simport - mecanism.

Viteza de transport este proportionala cu produsul dintre concentratiile celor doua substante pe aceeasi fata a membranei.

La echilibru, pentru o stoechiometrie de 1/1, vitezele de transport sunt egale S₁ P₁ = S₂ P₂ , iar raportul concentratiilor este:

(7.11)

Pentru o stoechiometrie a reactiei enzimatice de s/p, raportul concentratiilor este:

(7.12)

Exemplu de cotransport este simportul Na⁺/glucoza care se gaseste in tesutul intestinal si cel renal.

In continuare este prezentat simportul Na⁺/glucoza utilizat in elaborarea urinei. Concentratia de glucoza din urina pimara este comparabila cu cea din sange. Ea este reasorbita total la nivelul tubului urinar impreuna cu ionii de natriu, care sunt transportati in sensul gradientului de concentratie, mentinut de pompa Na⁺/K⁺.

In tubul urinar se gasesc doua pompe simport Na⁺/glucoza: una in regiunea proximala cu o stoechiometrie de 1/1 si cealalta in zona distala cu o stoechiometrie de 1/2. Ele asigura absorbtia totala a glucozei in patul vascular (Fig. 7.10.).

Fig. 7.10. Simportul Na⁺/glucoza la nivelul tubului urinar.

Glucoza este o molecula neutra, ionul Na⁺ transfera o sarcina pozitiva, astfel apare un potential electrochimic, deci simportul Na⁺/glucoza este electrogenic.

TEME:

1. Structura supramoleculara a membranei celulare.
2. Transportul pasiv prin membrana celulara. Clasificare.
3. Transportul activ. Clasificare.