Structura secundara a ADN

Structuri secundare "normale"

Cum s-a mentionat anterior, structura primara a unui acid nucleic este determinata de succesiunea nucleotidelor in catena polinucleotidica, mai concret de legaturile 3' - 5' ale resturilor nucleotidice ce formeza legaturile fosfodiesterice. Grafic, ele pot fi reprezentate in mai multe moduri, dar, in general se considera ca resturile fosforice, impreuna cu zaharidul formeaza o "coloana vertebrala" de care sunt atasate bazele azotate. Este de retinut faptul ca in structurile normale nu exista legaturi 5' - 5' sau 3' - 3'.

Structura secundara este repezentata de conformatia macromoleculei ADN. Primele determinari realizate prin difractie de raze X pe fibre de ADN au demonstrat ca structura secundara a ADN este determinata de existenta (asocierea) a doua catene complementare (ca urmare a legaturilor de hidorgen A:T, respectiv, G:C). Cele doua catene sunt antiparalele: pornind de la un capat, pe una dintre catene, nucleotidele se succed 3'- 5', in timp ce pe cealalta, succesiunea este 5' - 3'.

Ele formeaza structuri spatiale de tip "dubla elice", cu orientare de dreapta. Rezulta astfel structuri cuasicilindrice (multa vreme s-a considerat ca rezulta niste "bastonase"), in interiorul cilindrului gasindu-se bazele azotate care se suprapun unele peste altele - rezulta astfel o "stiva" de baze intre care se realizeaza interactiuni de nelegatura, iar spre exteriorul cilindrului se gasesc cele doua coloane vertebrale reprezentate de fosfozaharide.

Ele determina, de asemenea, formarea unor santuri (adancituri, eng. groove), denumite sant minor, respectiv, sant major.

Studiile initiale au fost realizate pe fibre solide de ADN; ulterior, prin dezvoltarea tehnicilor experimentale, au devenit posibile si studii in solutie. De asemenea, au fost realizate sinteze de oligonucleotide (decameri, dodecameri etc) care au permis evidentierea si altor structuri (C, D, T, Z) care au fost apoi, uneori, identificate si in fibrele ADN "native".

Primele conformatii decelate au fost denumite A-ADN - caracteristica concentratiilor ridicate de saruri (sau invers, unei umiditati reduse <75%) si respectiv B-ADN, caracteristice la "umiditate (RH - relative humidity)" ridicata >95% (concentratie redusa de saruri), ultima fiind dominanta.

Studii ulterioare au demonstrat ca, de fapt, exista mai multe variante de tip B, aceasta formand o familie ce contine structurile B, B', C, C', C", D, E, si T - ADN.

Structura C se obtine sub forma de saruri de litiu din ADN nativ, la o valoare RH redusa. T-ADN a fost obtinut din ADN izolat din fagul T2 (care contine in loc de citozina, 5-hidroximetil-citozina, iar in loc de furanoza - glucoza). Conformatia B se transforma in T la valori RH < 60%.

In 1979 a fost descoperita (Rich) o structura "stanga", (obtinuta prin sinteze de oligonucleotide), denumita Z-ADN.

Pe masura ce au putut fi sintetizate si alte secvente de oligonucleotide - in cantitati suficiente pentru studii conformationale - notiunea de structura "unica" a catenelor ADN s-a modificat. In general, in prezent, se accepta conceptul potrivit caruia, intr-o dubla catena ADN exista "zone" locale caracterizate printr-una dintre variantele mentionate. Structura zonelor este determinata, de fapt, de structura primara locala, structura secundara se realizeaza in asa fel incat sa se minimalizeze interactiunile de "nelegatura" si sa se asigure o suprapunere maxima a bazelor. Structurile sunt insa "dinamice", datorita relativei flexibilitati a "coloanei" fosfodiesterice.

S-au urmarit si modificarile induse in structurile "normale" de formarea unor combinatii chimice (aducti) intre nucleotide si diversi compusi chimici (ex. metilare) sau chiar numai ca urmare a unor procese fizice ("intercalari").

Alaturi de structurile considerate (mai mult sau mai putin) "normale" au fost identificate, inca din 1965, si alte structuri considerate ca "anormale sau "neuzuale"), cum ar fi supraincolacirea (Vinograd); ulterior au fost identificate structuri de tip "cruciform" si altele; unii autori considera aceste variante ca fiind structuri de ordin superior (tertiar, cuaternar).

O structura de ordin superior (secundara) poate fi caracterizata printr-o serie de parametric (vezi tabel urmator):

A - sensul de rotire al elicei (helix sense) - poate fi de dreapta (D, engl. R - right) sau de stanga (S, engl. L - left);

B - pasul elicei (inaltimea, cresterea verticala a elicei) - reprezinta lungimea helixului (spirei) - se exprima in Å sau nm;

C - numarul de resturi (nucleotide)/spira (residues per turn);

D - rotire / pereche baze (pb) (twist per bp) - reprezinta unghiul (diedru) dintre perpendicularele pe ax ale planurilor formate de doua pb succesive - se exprima in grade;

E - pozitia (centrului) bazei fata de axul elicei (displacement) - se exprima in Å sau nm;

F - crestere verticala / pb (rise per pb) - reprezinta distanta dintre perpendicularele pe ax ale doua pb succesive - se exprima in Å sau nm;

G - inclinarea bazelor (basetilt) - reprezinta unghiul (diedru) format intre planul bazelor si un plan perpendicular pe ax - se masoara in grade;

H - plierea zaharidului;

I - latimea santului (groowe width) major (Å sau nm);

J - latimea santului minor (Å sau nm);

K - adancimea (groowe depth) santului major (Å sau nm);

L - adancimea santului minor (Å sau nm);

M - diametrul cilindrului (Å sau nm).

Intre diversele valori exista, evident, relatii aritmetrice; astfel:

C x D = 360

C x F = B

Trebuie precizat ca valorile numerice sunt in curs de determinare(determinari realizate, in general, prin simulari pe calculator), astfel ca desi ele difera de la un autor la altul in functie de modelul ales, totusi caracteristicile generale sunt asemanatoare.

Valori pentru cateva conformatii ADN (Tabel ADN secundar)

Tabel ADN secundar

Particularitati structurale ale ADN

1.1. A-ADN

Primele variante de structuri oligonucleotidice A "pure" obtinute prin cristalizare (1970) au fost d(GGTATACC), d(CCGG)iodurata, d(GGCCGGCC). Structurile acestora erau similare cu cele observate pentru unele fibre de ADN. Sensul de rotire este "de dreapta".

In structurile A-ADN, ciclurile ribozice sunt paralele cu axul elicei, iar "coloana" fosforica zaharidica are o structura in zig-zag si se gaseste pe partea exterioara a unui cilindru cu diametrul de aprox. 24 Å. Bazele sun situate spre interior, suprapunandu-se una peste alta, rotite insa una in raport cu un plan perpendicular pe ax cu un anumit unghi ( ). Bazele nu sunt perfect paralele si nici total suprapuse.

Ele sunt situate ("deplasate") fata de axul elicei la o distanta de 4,5 Å, astfel ca, spre interiorul elicei exista un "gol" cu un diametru de aprox. 3 Å. Fiecare spira are o "inaltime" (pas) de 28 Å si cuprinde 11 baze astfel ca, cresterea verticala / pb este de 2,56 Å.

Ciclul furanozic are o pliere de tip C3'-endo, iar legatura glicozidica este in conformatie anti, ceea ce face ca distanta dintre doi atomi de fosfor succesivi sa fie de 5,4

Santul major este mai lat, dar mai putin adanc comparativ cu cel minor.

Familia B-ADN

Structura obisnuita a ADN este de tip B, identificata in fibre ADN nativ la o umiditate relativa (RH) de 95%. In detaliu ea a fost studiata folosind oligomeri, de exemplu: D(CGCGAATTCGCG), sau derivatul sau bromurat la citozina-9. Este o secventa bogata in grupari CG (mai energetice) terminale, care contine o secventa ce poate fi recunoscuta de enzima de restrictie EcoR1.

Caracteristicile structurilor ADN din familia B sunt redate in tabel.

Sunt structuri mai "relaxate" decat structurile de tip A. Astfel, fata de 11 nucleotide / spira in structura A, numarul de pb / spira scade la 10 pentru forma "uzuala" B, scazand si mai mult (8) pentru formele mai putin uzuale (D si T); pasul elicei pentru structura B este de 34 Å. Trebuie precizat ca in raport cu primele determinari ale structurii B, realizate pe fibre solide, ulterior, cand dezvoltarea tehnilor experimentale au permis studii in solutie (de retinut faptul ca normal, in celula, ADN este asociat puternic cu molecule de apa - vezi mai jos, fiind astfel, practic, "in solutie") valoarea parametrului C (pb/spira) a crescut, astfel ca valoarea medie acceptata in prezent este de 10,5.

In toate cazurile, santul major este mai ingust comparativ cu cel minor (deci invers fata de A). Diferentele de adancime sunt mai putin marcate (in structurile B si D ele sunt apropiate, iar in varianta C - practic egale).

Suprapunerea bazelor este mai accentuata, fiind mai putin deviata fata de planul perpendicular pe axul elicei (exceptie structura D); unii autori considera ca unghiul de rotire este nul pentru structura B.

Datorita structurii mai relaxate si a plierii zaharidelor distantele P - P vecine sunt mai mici (la B ea este de 6,7 Å).

Studiile realizate in solutie (in special, prin RMN) au demonstrat ca, in ambele "santuri", se gasesc molecule de apa legate de fibra de ADN; ele interactioneaza cu gruparile expuse ( -C = O, -N , -NH) din baze sau cu gruparile fosforice din "coloana vertebrala". In santul minor (la structura B) moleculele de apa formeaza un lant ordonat, in zig-zag; in medie, la o pereche nucleotidica corespunzand cca. doua molecule de apa. Fenomene similare au fost observate si in oligonucleotide care au permis determinari mai exacte; astfel, s-a constatat ca perechea G:C asociaza doua molecule de apa, iar dubletele A:T - trei, astfel ca in dreptul regiunilor A:T exista niste "spini" formati din molecule de apa. S-a presupus chiar ca tranzitia intre formele A- si B-ADN se explica prin modificarea formei si stabilitatii "spinilor" de apa.

1.3. Z-ADN

Primele structuri de tip "stanga" au fost observate in unele oligonucleotide d(CGCGCG), d(CGCG) sau d(CGCATGCG). Initial, s-a crezut ca pentru existenta acestei structuri este necesara o succedare stricta a purinelor si pirimidinelor, dar ulterior aceasta ipoteza a fost abandonata, intrucat structuri de tip Z au fost decelate si in d(CGATCG) in care citozina a fost modificata prin bromurare sau iodurare la C-5 sau in secventa GTTTG si GACTG.

Rotirea spre stanga a duplexului ADN este determinata de modificarea unghiurilor de torsiune ale legaturilor glicozidice, ceea ce conduce la o conformatie sin a uneia dintre nucleotidele din perechile de baze, de obicei o purina. Existenta unei secvente alternative anti-sin determina o structura in zig-zag a atomilor de fosfor din coloana, de unde provine si denumirea de Z-ADN. In acelasi timp, plierea zaharidului se modifica de la conformatia C-2' endo (intalnita in resturile anti) la conformatia C-3' endo in nucleotidele sin. Aceste modificari au urmari profunde si asupra modului de suprapunere a bazelor, ca si a unghiului dintre doua baze succesive. Astfel secventa GpC conduce la un unghi de -45⁰ - (-51⁰), ca urmare, santul minor al Z-ADN este atat de adanc incat include practic axa elicei, in timp ce "santul" major dispare fiind inlocuit de o suprafata convexa, fiind astfel situati spre exterior ("expusi") atomii C-5 (citozina), N-7 (guanina) si C-8 (guanina).    

Structurile de tip Z contin cel mai mare numar de baze / spira - 12, avand si cea mai mare valoare a distantei dintre baze - 3,7

Studiile prin diviziune celulara au demonstrat ca sunt posibile tranzitii intre diversele conformatii B→Z, la concentratii ridicate de sare (NaCl 4M). Se pare ca tranzitia este favorizata si de faptul ca se reduce distanta dintre anionii fosforici (8 Å - pentru Z, fata de 11,7 Å la B-ADN).

2. Structuri ADN anormale (neregulate)

Introducerea, dupa 1980, a unor tehnici analitice noi, ca si a unor posibile de modificare chimica a acizilor nucleici, a condus la identificarea unor structuri ADN anormale. In aceasta categorie pot fi incluse si structuri rezultate prin modificarea celor "normale structurile rezultate fiind denumite, de unii autori, "structuri neregulate").

Multe dintre structuri au fost identificate prin analiza unor oligonucleotide sintetice; unele dintre acestea au fost introduse (clonate) in ADN circular plasmidic, putandu-se astfel urmari si efectele asupra supraincolacirii (supercoiling). Trebuie, de asemenea, precizat ca nu toate structurile "anormale" au fost efectiv identificate, unele dintre acestea fiind imaginate teoretic, uneori pentru a incerca sa fie elucidate date experimentale.

2.1. Structuri de tip "curb"

Exista mai multe variante de ADN "curbat", atat inchise cat si deschise; curbarea se poate realiza numai local sau se poate extinde la intreaga catena. De asemenea, poate implica ambele catene sau numai una dintre ele.

Dintre diversele variante se pot mentiona:

A.    Structuri deschise:

ADN dublu catenar, curb, deschis;

ADN cu "muguri" (ADN buclat - sleeped ADN);

ADN anisomorfic;

ADN cruciform.

B.     Structuri inchise:

ADN circular;

ADN inlantuit catenat (catenated ADN);

ADN inodat (trustted ADN).

2.1.1. ADN dublu catenar, curb

Existenta unor duplexuri ADN deschise, curbate a fost identificata in cazul ADN kinetoplastic extras din tripanosomatide. Acesta consta din aproximativ 200 pb, putandu-se curba pana la 360⁰. Ulterior au fost obtinute secvente sintetice care au incercat sa explice factorii ce determina curbarea. Astfel s-a observat ca exista secvente scurte de adenina aflate la intervale de 10 pb. In zona centrala sunt prezente patru secvente CA_5-6T, separate prin alte 2-3 nucleotide. La capatul fiecarei secvente se produce o inclinare de 20-25⁰, mai pronuntata la capatul 3

Curbarea este determinata de existenta unor factori structurali proprii moleculei de ADN; sunt posibile si alte curbari, determinate insa de factori externi (ex. asocierea cu proteine).

ADN "cu muguri" (buclat)

Existenta unei structuri de tip "inmugurit" - caracterizata prin existenta unor zone monocatenare, in care una dintre catene fiind "mugurul" - a fost postulata. Se considera ca aceste zone sunt importante pentru atacul nucleazelor monocatenare (single strand nucleases), avand si importante roluri reglatoare.

ADN anisomorfic

ADN anisomorfic este caracterizat prin existenta unor secvente dublu catenare, dar necomplementare, ceea ce conduce la aberatii structurale. Astfel de secvente au fost identificate in regiunile de "legare" (joint region) ale ADN viral.

Structuri cruciforme

Structurile de tip cruciform reprezinta unele dintre structurile "anormale" cele mai studiate. Identificate in jurul anului 1980 - la 20 de ani dupa ce ele au fost descrise teoretic - au fost decelate in plasmide (in secvente repetitive, inversate de tip palindromice) si in fagi, cazuri in care supraincolacirea joaca un rol important.

Structurile cruciforme se pot forma din structuri bicatenare normale. Au fost propuse doua variante de tranzitie: C si S.

Varianta S este mai rapida si necesita o energie libera de aprox. 100 kJ/mol. Prima etapa este reprezentata de formarea unei zone in care catenele sunt decuplate, urmata de formarea unui intermediar probabil cruciform. In final se produce modificarea dimensiunilor bratelor cu formarea unei structuri cruciforme ce contine doua bucle (luping) laterale si o zona centrala cu patru jonctiuni. Astfel de structuri au fost observate in plasmidul PIRbKe8.

Un alt mecanism - tranzitia C este mai lent - deoarece necesita o energie mai mare △G = 180 kJ/mol, fiind observat in plasmidul pCoIIR315. Intermediar se formeaza o structura de tip "balon din guma de mestecat" (bubble gum) care se transforma apoi in structura cruciforma. Energia necesara tranzitiilor este asigurata de relaxarea supraincolacirilor.

Structurile cruciforme sunt sensibile la actiunea unor enzime sau a unor factori chimici. Astfel, buclele sunt atacate de nucleaza monocatenara (S1 sau P1) sau compusi chimici: bromoscetaldehida, tetraoxid de osmiu, bisulfit si glioxal. In schimb, zona catenara este sensibila la actiunea T4 endonucleazei.

Cu toate aceste corelatii nu se cunoaste semnificatia biologica clara a structurii cruciforme.

2.2. ADN circular

Existenta unui ADN dublu catenar circular a fost identificata prima data in bacteriofagul ΦX174. Ulterior, structuri similate au fost decelate in bacterii si virusuri, fiind caracteristice si pentru ADN plasmidic sau mitocondrial. (Virusurile pot contine si ADN circular monocatenar sau ARN circular monocatenar).

Existenta structurii circulare este esentiala pentru functionalitatea moleculei. (vezi, spre exemplu, replicarea ADN). In variantele liniare ei devin putin activi sau chiar inactivi. Ciclizarea se poate realiza prin legarea covalenta a capetelor libere→ capete coezive (cis).

Structura (topologia) ADN circular a fost descrisa pentru prima data de Vinograd in 1965, fiind corelat si cu existenta procesului de supraincolacire ("ADN superhelical", "supercoiled" sau "supertwisted"). El a demonstrat ca este posibila trecerea de la forma circulara "relaxata" la cea supraincolacita si invers:

Trecerea se realizeaza prin intermediul unei stari de tranzitie b, in care se produce o scindare (o gatuitura = nick) a uneia sau a ambelor catene; prin modificarea numarului de spire se produce o tensionare a catenei ADN, care pentru relaxare - atingerea minimului energetic - se supraincolaceste. Supraincolacirea se poate produce atat spre stanga, cat si spre dreapta, in functie de cresterea sau scaderea numarului de spire.

Relatia existenta intre variatia numarului de spire si cel al numarului de noduri a fost determinata de Vinograd, care a introdus mai multi parametri (indici) topologici:

indicele (parametrul) de legatura L_k ("linkage number") - ce reprezinta nr. "legaturi" (mai exact, "capete") dintre resturile de "helixuri" ("spire") ADN. Oarecum, echivalentul chimic al L_k este "gradul de polimerizare", ce reprezinta numarul de resturi de monomeri dintr-o catena polimerica. In cazul ADN, "monomerul" este reprezentat de o spira (helix). In aceste conditii, valoarea L_k este egala cu raportul dintre nr. total de perechi de nucleotide din catena si nr. resturi de nucleotide/spira (considerat, in medie, pentru structura de tip B-ADN ca fiind 10,5).

indicele de twisting T_w (twisting number) - reprezinta numarul twist-uri (o forma particulara de "twist" fiind helixul) din dubla catena ADN. La modul ideal, T_w este egal cu suma dintre nr. helixuri "mici" (din dubla catena) la care se adauga nr. de helixuri "mari" formate prin supraincolacire;

indicele de supraincolarire (writhing number) W_r - se defineste in doua moduri:

numarul de "supraincolaciri (supercoils)" - respectiv, de helixuri "mari" rezultate prin relaxare.

numarul de noduri (suprapuneri) ale catenei ca urmare a supraincolacirii.

Topoizomerii ADN reprezinta structuri circulare ce au aceeasi secventa nucleotidica dar difera prin valorile numarului de legatura L_k.

Valorile L_k, T_w, W_r pot fi pozitive sau negative, in functie de sensul de rotire; astfel L_k, T_w sunt pozitive daca rotirea este spre dreapta, iar W_r se considera pozitiv daca rotirea este de stanga.

Vinograd a demonstrat ca intre acesti parametri exista urmatoarea relatie algebrica:

L_k = T_w + W_r

Este clar ca L_k poate varia numai daca se scindeaza catena. In exemplul prezentat, in structura a, W_r = 0, iar ADN fiind circular, L_k = T_w =20 (se presupune existenta a 20 spire spre dreapta pe intreg ciclul). In structura b, ca urmare a scindarii si invartirii catenei, urmata de relegarea capetelor libere, se reduce cu 2 numarul de spire, deci T_w = 18, iar L_k = 18. Structura b este insa tensionata; pentru a se relaxa ea trebuie sa realizeze un proces de supraincolacire. Intrucat conform regulei lui Vinograd, L_k = constant, daca nu se mai produce o scindare a catenei - catena sufera o supraincolacire spre dreapta, formandu-se doua noduri, W_r = -2, dar numarul de spire total T_w revine la +20 astfel incat:

20 + (-2) = 18 ≡ T_w + W_r = L_k

Sunt posibile si tranzitii B-Z sau invers; trecerea de la o rotire spre dreapta la una spre stanga conduce la o modificare a valorii T_w cu -2, ceea ce determina o variatie △W_r = +2, prin formarea unei supraincolaciri spre stanga. O astfel de tranzitie a fost dedusa determinandu-se viteza de sedimentare a ADN extras din SV40, trecerea realizandu-se prin intermediul unei forme circulare, cu coeficient de sedimentare minim.

Uneori, gradul de supraincolacire se exprima sub forma densitatii de supraincolacire s = W_r / T_w care, pentru ADN celular sau viral, are valori in jur de 0,06.

2.3. Topoizomerazele

Jim Wang a descoperit existenta unor enzime, denumite topoizomeraze, capabile sa modifice valorile L_k, cu alte cuvinte sa transforme un topoizomer ADN in altul. Au fost identificate doua categorii de topoizomeraze:

clasa I - care modifica L_k cu valori intregi: △ L_k= ±n;

clasa II - care modifica L_k cu valori 2n: △ L_k= ±2n.

Topoizomerazele I scindeaza una dintre catene, o roteste in jurul celeilalte si o releaga, avand deci un mecanism "nick - swivel - close taie - invarteste -leaga). La eukariote ele pot actiona pe orice varianta de supraincolacire, in timp ce la prokariote pot actiona numai asupra supraincolacirilor negative (de dreapta). Un caz studiat experimental prin electroforeza, a fost cel al ADN plasmidic.

Topoizomerazele II scindeaza ambele catene, pe care le roteste (motiv pentru care mai sunt denumite si giraze, ex. cele extrase din E.coli) si le releaga; spre deosebire de clasa I, procesele catalizate de enzimele din clasa II necesita un consum energetic, energia fiind furnizata de hidroliza ATP.

Studiile referitoare la ADN circular s-au extins si la ADN "liniar", care de fapt prezinta numeroase portiuni curbe, in care se manifesta procese similare cu cele din ADN circular. Astfel, topoizomerazele actioneaza si asupra ADN liniar, in mod deosebit in cursul proceselor de replicare, dar probabil si in alte cazuri.

Prezenta supraincolacirii este importanta si in alte cazuri. Astfel ARN polimeraza este de 10 ori mai activa cand actioneaza asupra ADN supraincolacit fata de ADN relaxat. Promotorul tyrT din E.coli este, in vitro, de 100 ori mai activ in forma supraincolacita.

4. ADN circular inlantuit (catenated) si inodat (knolted)

Insasi denumirea sugereaza structura acestor tipuri de ADN:

Aceste structuri rezulta prin actiunea topoizomerazelor II care, dupa scindarea catenelor, poate conduce la structuri diferite:

modificarea L_k, cu formarea unor structuri noi, de exemplu ADN circular;

inlantuirea ADN circular inainte de relegare - cu o alta molecula ADN supraincolacit, urmata de relegare;

trecerea de la o forma circulara la una inodata.

Existenta acestor structuri a fost dovedita prin microscopie electronica, putand fi generate si in vitro din ADN mitocondrial.