Albinele - testul de toxicitate acuta prin contact

ALBINELE - TESTUL DE TOXICITATE ACUTA PRIN CONTACT

METODA

Metoda de determinare a toxicitatii acute reproduce Linia directoare 214 a OCDE (1998).

INTRODUCERE

Prezentul test de toxicitate este o metoda de laborator, destinata determinarii toxicitatii acute prin contact a produselor pentru protectia plantelor si a altor produse chimice la albinele lucratoare adulte.

In evaluarea caracteristicilor toxice ale substantelor, s-ar putea sa fie necesara determinarea toxicitatii acute de contact la albine, de ex. cand este posibila expunerea albinelor la un anumit produs chimic. Testul de toxicitate acuta prin contact se efectueaza pentru determinarea toxicitatii inerente a pesticidelor si altor produse chimice la albine. Rezultatele testului respectiv se utilizeaza pentru a stabili necesitatea unei evaluari suplimentare. Prezenta metoda se poate utiliza in special in programele in mai multe etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin inaintare secventiala de la testele de toxicitate de laborator la experimentarile de semi-teren si teren (1). Pesticidele se pot testa sub forma de substante active (s.a.) sau de preparate.

Pentru verificarea sensibilitatii albinelor si a preciziei metodei de testare este necesara utilizarea unui etalon de toxicitate.

DEFINITII

Toxicitatea orala acuta: reprezinta efectele negative care apar in termen de maximum 96 ore de la aplicarea locala a unei doze unice dintr-o substanta.

Doza: reprezinta cantitatea de substanta testata aplicata. Doza se exprima ca masa (μg) de substanta testata per animal experimental (μg/albina).

DL₅₀ (doza letala medie) de contact: este o doza unica, obtinuta statistic, dintr-o substanta care poate provoca moartea a 50% din animale atunci cand se administreaza prin contact. Valoarea DL₅₀ se exprima in (μg) de substanta testata per albina. Pentru pesticide, substanta testata poate sa fie sub forma de substanta activa (s.a.) sau de preparat ce contine una sau mai multe substante active.

Mortalitatea: un animal se inregistreaza ca mort atunci cand este complet imobil.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se procedeaza la expunerea albinelor lucratoare adulte (Apis mellifera) la o serie de doze de substanta testata dizolvata intr-un purtator corespunzator, prin aplicare directa pe torace (picaturi). Durata testului este de 48 h. Daca rata mortalitatii creste in intervalul dintre 24 ore si 48 ore in timp ce mortalitatea martorului ramane la un nivel acceptabil, adica < 10%, este potrivit sa se prelungeasca durata testului pana la maximum 96 h. Mortalitatea se inregistreaza zilnic si se compara cu valorile martorului. Se analizeaza rezultatele pentru a calcula valoarea DL₅₀ la 24 h si 48 h si, daca studiul se prelungeste, la 72 h si
96 h.

VALIDITATEA TESTULUI

Pentru ca un test sa fie valabil, trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

media mortalitatii pentru numarul total de martori trebuie sa fie mai mica sau egala cu 10% la sfarsitul testului,

DL₅₀ a etalonului de toxicitate sa se incadreze in intervalul specificat.

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Colectarea albinelor

Este necesar sa se utilizeze albinele lucratoare adulte tinere, adica albinele de aceeasi varsta, modalitate de hrana, din acelasi roi etc. Albinele se obtin din colonii hranite in mod corespunzator, sanatoase, pe cat posibil fara boli si care provin din aceeasi regina, cu antecedente si stare fiziologica cunoscute. Acestea se pot colecta in dimineata in care se utilizeaza sau in seara de dinaintea testului si tinute in conditiile experimentale pana in ziua urmatoare. Sunt potrivite albinele colectate din rame fara progenituri. Se evita colectarea primavara devreme sau toamna tarziu, deoarece albinele au o fiziologie modificata in perioadele mentionate. Daca este necesara efectuarea testelor la inceputul primaverii sau sfarsitul toamnei, albinele se pot introduce intr-un incubator si se hranesc timp de o saptamana cu "painea albinelor" (polen recoltat din fagure) si solutie de zaharoza. Albinele tratate cu substante chimice, ca antibiotice, produse antivirale etc. nu se utilizeaza in testele de toxicitate timp de patru saptamani din momentul terminarii ultimului tratament.

Conditii de adapost si hrana

Se utilizeaza custi usor de curatat si cu ventilatie buna. Se poate utiliza un material corespunzator, de ex. otel inoxidabil, plasa de sarma, custi din material plastic sau din lemn disponibile etc. Dimensiunile custilor experimentale trebuie sa corespunda numarului de albine, adica sa asigure spatiul corespunzator. Se prefera grupuri de 10 albine in fiecare cusca.

Albinele se tin la intuneric intr-o camera experimentala la o temperatura de 2 5± 2^oC. Pe toata durata testului, se inregistreaza umiditatea relativa, care este in mod normal de aproximativ 50-70%. Manipularea, care include tratamentul si observatiile se efectueaza la lumina (lumina zilei). Ca hrana se utilizeaza solutie apoasa de zaharoza cu o concentratie finala de 500g/l (50% greutate/volum) si se furnizeaza ad libitum pe durata testului, intr-un vas de alimentare. Acesta poate sa fie o eprubeta (cu lungimea de aproximativ 50 mm si diametrul de aproximativ 10 mm cu capatul deschis ingustat pana la un diametru de aproximativ 2mm).

Pregatirea albinelor

Albinele colectate se anesteziaza cu bioxid de carbon sau azot pentru aplicarea substantei testate. Cantitatea de anestezic utilizat si durata expunerii trebuie sa fie minime. Albinele muribunde se resping si se inlocuiesc cu albine sanatoase inaintea inceperii testului.

Pregatirea dozelor

Substanta testata urmeaza sa se aplice sub forma de solutie intr-un purtator, adica un solvent organic sau o solutie apoasa cu un agent de umectare. Ca solvent organic, se prefera acetona, dar se pot utiliza si alti solventi organici cu toxicitate mica pentru albine (de ex. dimetilformamida, dimetilsulfoxid). Pentru preparatele dispersate in apa si substantele organice cu polaritate mare, care nu sunt solubile in solventii organici purtatori, solutiile se pot aplica mai usor, daca se prepara intr-o solutie slaba de agent de umectare comercializat (de ex. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

Se prepara solutiile etalon corespunzatoare, adica, daca se utilizeaza un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substantei testate, trebuie sa se utilizeze doua grupe etalon separate: una tratata cu apa si una tratata cu solvent/agent de dispersie.

MODUL DE LUCRU

Grupele experimentale si cele martor

Numarul de doze si probe identice experimentate trebuie sa satisfaca conditiile statistice pentru determinarea DL₅₀ cu limite de incredere de 95%. In mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze in serie geometrica, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 si care sa cuprinda valorile pentru DL₅₀. Cu toate acestea, factorul de dilutie si numarul de concentratii pentru dozare trebuie sa se determine in functie de panta curbei de toxicitate (doza functie de mortalitatea) si tinand cont de metoda statistica aleasa pentru analiza rezultatelor. O proba pentru determinarea domeniului permite alegerea concentratiilor potrivite pentru dozare.

La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, se administreaza doze cu fiecare concentratie experimentata.

In afara de seriile tratate cu concentratiile experimentate, se urmaresc minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Daca se utilizeaza un solvent organic sau un agent de umectare, trebuie sa se includa trei serii martor suplimentare, de cate 10 albine fiecare.

Etalonul de toxicitate

In seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selecteaza cel putin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL₅₀. Pentru fiecare doza experimentata se utilizeaza minimum trei custi identice, fiecare continand 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat este dimetoatul, pentru care DL₅₀ - 24 h prin contact semnalata se situeaza intre valorile 0,10-0,35 μg s.a./albina (2). Cu toate acestea, daca se pot furniza suficiente date pentru verificarea raspunsului preconizat la doza, se pot accepta alte etaloane de toxicitate (de ex. parationul).

Expunerea

Administrarea dozelor

Albinele anesteziate se trateaza individual prin aplicare locala. Albinele se distribuie in mod aleatoriu pentru diferite doze experimentate si diferiti martori. Se aplica un volum de 1 μl solutie de substanta testata in concentratii potrivite cu o micropipeta pe partea dorsala a toracelui fiecarei albine. Daca este necesar, se pot utiliza alte volume. Dupa aplicare, albinele sunt repartizate in custi si li se administreaza solutii de zaharoza.

Durata

Durata testului este de preferinta de 48 ore. Daca mortalitatea creste cu mai mult de 10% intre 24 h si 48 h, durata testului se prelungeste la maximum 96 ore, cu conditia ca mortalitatea martorului sa fie mai mica sau egala cu 10%.

Observatiile

Mortalitatea se inregistreaza la 4 h dupa administrarea dozelor si apoi la 24 h si 48 h. Daca este necesara o perioada prelungita de observare, se fac alte evaluari la intervale de 24 h, pana la maximum 96 h, cu conditia ca mortalitatea martorului sa fie mai mica sau egala cu 10%.

Se consemneaza toate manifestarile anormale observate in timpul desfasurarii testului.

Testul la valori limita

In unele cazuri (de ex. cand se preconizeaza ca o substanta testata are o toxicitate mica) se poate efectua un test la valori limita, utilizand 100 μg s.a./albina pentru a demonstra ca DL₅₀ este mai mare decat valoarea respectiva. Se utilizeaza acelasi mod de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevanti si utilizarea etalonului de toxicitate. Daca se observa efecte subletale (vezi 1.6.4), se consemneaza.

REZULTATELE SI RAPORTAREA

REZULTATELE

Rezultatele se sistematizeaza in tabele, care prezinta pentru fiecare grupa supusa tratamentului, precum si pentru grupele martor si cele tratate cu etalon de toxicitate, numarul de albine utilizate, mortalitatea in fiecare moment de observare si numarul de albine cu un comportament negativ. Datele privind mortalitatea se analizeaza prin metode statistice corespunzatoare (de ex. analiza probit, media mobila, probabilitatea binominala) (3( (4). Se traseaza curbele doza-raspuns pentru fiecare observare recomandata (adica la 24 h, 48 h si, daca este relevant, 72 h, 96 h) si se calculeaza pantele curbelor si dozele letale medii (DL₅₀) cu limite de incredere de 95%. Sunt posibile corectii pentru mortalitatea martorului cu ajutorul corectiei lui Abbott (4) (5). DL₅₀ se exprima in μg de substanta testata per albina.

RAPORT DE TESTARE

Raportul de testare trebuie sa contina urmatoarele date:

Substanta testata

- natura fizica si proprietatile fizico-chimice relevante (de ex. stabilitatea in apa, presiunea de vapori),

- datele de identificare chimica, care includ formula structurala, puritatea [adica pentru pesticide, identitatea si concentratia substantei(substantelor) active].

Speciile experimentale

denumirea stiintifica, roiul, varsta aproximativa (in saptamani), metoda de colectare, data colectarii,

datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experimentale, care includ starea de sanatate, eventuale boli ale adultilor, tratamente prealabile, etc.

Conditii experimentale

temperatura si umiditatea relativa in camera experimentala,

conditiile de adapost care includ tipul, dimensiunea si materialul custilor,

metodele de administrare a substantei testate, de ex. solventul purtator utilizat, volumul solutiei de substanta testata aplicat, anestezicele utilizate,

protocolul testului, de ex. numarul de incercari si concentratiile testate, numarul de martori; pentru fiecare concentratie experimentata si martor, numarul de custi identice, si numarul de albine per cusca,

data efectuarii testului.

Rezultatele

rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, daca s-a efectuat,

datele brute: mortalitatea la fiecare concentratie experimentata si fiecare moment de observare,

trasarea curbelor doza-raspuns la sfarsitul testului,

valorile DL₅₀ cu limite de incredere de 95%, la fiecare din momentele de observare recomandate, pentru substanta testata si etalonul de toxicitate,

metodele statistice utilizate pentru determinarea DL₅₀,

mortalitatea la martori,

alte efecte biologice observate sau masurate si orice raspunsuri anormale ale albinelor,

orice abatere de la modul de lucru descris si orice alte date relevante.

BIBLIOGRAFIE

EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products ó Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.

Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.

Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.

Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.