Albinele - testul de toxicitate orala acuta

ALBINELE - TESTUL DE TOXICITATE ORALA ACUTA

METODA

Metoda de determinare a toxicitatii acute reproduce Linia directoare 213 a OCDE (1998).

INTRODUCERE

Prezentul test de toxicitate este o metoda de laborator, destinata determinarii toxicitatii orale acute a produselor pentru protectia plantelor si a altor produse chimice la albinele lucratoare adulte.

In aprecierea si evaluarea caracteristicilor toxice ale substantelor, ar putea fi necesara determinarea toxicitatii orale acute la albine, de ex. cand este posibila expunerea albinelor la un anumit produs chimic. Testul de toxicitate orala acuta se efectueaza pentru determinarea toxicitatii inerente a pesticidelor si altor produse chimice la albine. Rezultatele testului respectiv trebuie utilizate pentru a stabili necesitatea unei evaluari suplimentare. Prezenta metoda se poate utiliza in special in programele in mai multe etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin inaintare secventiala de la testele de toxicitate de laborator la experimentarile de semi-teren si teren (1). Pesticidele se pot testa sub forma de substante active (s.a.) sau de preparate.

Pentru verificarea sensibilitatii albinelor si a preciziei metodei de testare este necesara utilizarea unui etalon de toxicitate.

DEFINITII

Toxicitatea orala acuta: reprezinta efectele negative care apar in termen de maximum 96 ore (h) de la administrarea orala unei doze unice de substanta testata.

Doza: reprezinta cantitatea de substanta testata consumata. Doza se exprima ca masa (μg) de substanta testata per animal experimental (μg/albina). Nu se poate calcula doza reala pentru fiecare albina, deoarece albinele sunt hranite in colectiv, dar se poate estima o doza medie (substanta testata consumata in total/numarul de albine experimentale dintr-o cusca).

DL₅₀ (doza letala medie) orala: este o doza unica, obtinuta statistic, dintr-o substanta care poate provoca moartea a 50% din animale atunci cand se administreaza pe cale orala. Valoarea DL₅₀ se exprima in (μg) de substanta testata per albina. Pentru pesticide, substanta testata poate sa fie sub forma de substanta activa (s.a.) sau de preparat ce contine una sau mai multe substante active.

Mortalitatea: un animal se inregistreaza ca mort atunci cand este complet imobil.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se procedeaza la expunerea albinelor lucratoare adulte (Apis mellifera) la o serie de doze de substanta testata dispersata in solutie de zaharoza. Albinele primesc apoi aceeasi hrana, fara substanta testata. Mortalitatea se inregistreaza zilnic timp de cel putin 48 h si se compara cu valorile pentru proba martor. Daca rata mortalitatii creste in intervalul dintre 24 ore si 48 ore, in timp ce mortalitatea martorului ramane la un nivel acceptabil, adica ≤ 10%, este potrivit sa se prelungeasca durata testului pana la maximum 96 h. Se analizeaza rezultatele pentru a calcula valoarea DL₅₀ la 24 h si 48 h si, daca studiul se prelungeste, la 72 h si 96 h.

VALIDITATEA TESTULUI

Pentru ca un test sa fie valabil, trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

media mortalitatii pentru numarul total de martori trebuie sa fie mai mica sau egala cu 10% la sfarsitul testului,

DL₅₀ a etalonului de toxicitate sa se incadreze in intervalul specificat.

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Colectarea albinelor

Este necesar sa se utilizeze albinele lucratoare adulte tinere din acelasi roi, adica albinele de aceeasi varsta, modalitate de hrana etc. Albinele se obtin din colonii hranite in mod corespunzator, sanatoase, pe cat posibil fara boli si care provin din aceeasi regina, cu antecedente si stare fiziologica cunoscute. Acestea se pot colecta in dimineata in care se utilizeaza sau in seara de dinaintea testului si tinute in conditiile experimentale pana in ziua urmatoare. Sunt potrivite albinele colectate din rame fara progenituri. Se evita colectarea primavara devreme sau toamna tarziu, deoarece albinele au o fiziologie modificata in perioadele mentionate. Daca este necesara efectuarea testelor la inceputul primaverii sau sfarsitul toamnei, albinele se pot introduce intr-un incubator si se hranesc timp de o saptamana cu "painea albinelor" (polen recoltat din fagure) si solutie de zaharoza. Albinele tratate cu substante chimice, ca antibiotice, produse antivirale etc. nu se utilizeaza in testele de toxicitate timp de patru saptamani din momentul terminarii ultimului tratament.

Conditii de adapost si hrana

Se utilizeaza custi usor de curatat si cu ventilatie buna. Se poate utiliza orice material corespunzator, de ex. otel inoxidabil, plasa de sarma, custi din material plastic sau din lemn disponibile etc. Se prefera grupuri de 10 albine in fiecare cusca. Dimensiunile custilor experimentale trebuie sa corespunda numarului de albine, adica sa asigure spatiul corespunzator.

Albinele se tin la intuneric intr-o camera experimentala la o temperatura de 25 ± 2^oC. Pe toata durata testului, se inregistreaza umiditatea relativa, care este in mod normal de aproximativ 50-70%. Manipularea, care include tratamentul si observatiile se efectueaza la lumina (lumina zilei). Ca hrana se utilizeaza solutie apoasa de zaharoza cu o concentratie finala de 500g/l (50% greutate/volum). Dupa administrarea dozelor de testare, hrana se furnizeaza ad libitum. Este necesar ca sistemul de alimentare sa permita inregistrarea hranei consumate in fiecare cusca (1.6.3.1.). Se poate utiliza o eprubeta (cu lungimea de aproximativ 50 mm si diametrul de aproximativ 10 mm cu capatul deschis ingustat pana la un diametru de aproximativ 2mm).

Pregatirea albinelor

Albinele colectate se repartizeaza in mod aleatoriu in custile experimentale, care se aranjeaza in mod aleatoriu in camera experimentala.

Albinele se pot infometa timp de pana la 2 ore inaintea inceperii testului. Se recomanda ca albinele sa fie lipsite de hrana inaintea tratamentului, astfel incat, la inceputul testului, intestinele tuturor albinelor sa aiba acelasi continut. Albinele muribunde se resping si se inlocuiesc cu albine sanatoase inaintea inceperii testului.

Pregatirea dozelor

Daca substanta testata este un compus miscibil cu apa, se poate dispersa direct in solutia de zaharoza 50%. Pentru produsele si substantele tehnice cu solubilitate mica in apa, se pot utiliza purtatori care pot sa fie solventi organici, emulgatori sau agenti de dispersie cu toxicitate mica pentru albine (de ex. acetone, dimetilformamida, dimetilsulfoxid). Concentratia purtatorului depinde de solubilitatea substantei testate si ar trebui sa fie aceeasi pentru toate concentratiile experimentate ale substantei. Cu toate acestea, in general, este potrivita o concentratie a purtatorului de 1% care nu trebuie sa fie depasita.

Se prepara solutiile etalon corespunzatoare, adica, daca se utilizeaza un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substantei incercate, trebuie sa se utilizeze doua grupe etalon separate: o solutie in apa si o solutie de zaharoza cu solventul/purtatorul la concentratia utilizata in solutiile de dozare.

MODUL DE LUCRU

Grupele experimentale si cele martor

Numarul de doze si probe identice trebuie sa satisfaca conditiile statistice pentru determinarea DL₅₀ cu limite de incredere de 95%. In mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze in serie geometrica, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 si care sa cuprinda valorile pentru DL₅₀. Cu toate acestea, factorul de dilutie si numarul de concentratii pentru dozare trebuie sa se determine in functie de panta curbei de toxicitate (doza functie de mortalitate) si tinand cont de metoda statistica aleasa pentru analiza rezultatelor. O proba pentru determinarea domeniului permite alegerea concentratiilor potrivite pentru dozare.

La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, se administreaza doze cu fiecare concentratie experimentata. In afara de seriile tratate cu concentratiile experimentate, se urmaresc minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Sunt prevazute serii martor si pentru solventii/purtatorii utilizati (1.5.4.).

Etalonul de toxicitate

In seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selecteaza cel putin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL₅₀. Pentru fiecare doza testata se utilizeaza minimum trei custi identice, fiecare continand 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat este dimetoatul, pentru care DL₅₀ - 24 h semnalata se situeaza intre valorile 0,10-0,35 μg s.a./albina (2). Cu toate acestea, daca se pot furniza suficiente date pentru verificarea raspunsului preconizat la doza, se pot accepta alte etaloane de toxicitate (de ex. parationul).

Expunerea

Administrarea dozelor

Fiecarei grupe de albine i se administreaza 100-200 μl solutie apoasa 50% de zaharoza, ce contine substanta testata la concentratia corespunzatoare. Pentru produsele cu solubilitate mica, toxicitate mica sau concentratie mica in preparat este necesar un volum mare, deoarece trebuie sa se utilizeze proportii mai mari din solutia de zaharoza. Se monitorizeaza cantitatea de hrana tratata consumata per grupa. Dupa consumarea hranei (de obicei in 3-4 h), vasul de alimentare se scoate din cusca si se inlocuieste cu unul care contine numai solutie de zaharoza. Solutiile de zaharoza se furnizeaza apoi ad libitum. Pentru unii compusi, la concentratii mai mari, respingerea dozei incercate poate sa genereze un consum mic sau inexistent de hrana. Dupa maximum 6 h, hrana tratata neconsumata se inlocuieste numai cu solutia de zaharoza. Se evalueaza cantitatea de hrana tratata consumata (de ex. prin masurarea raportului volum/greutate pentru hrana tratata neconsumata).

Durata

Durata testului este de preferinta de 48 ore dupa ce solutia de substanta testata este inlocuita cu solutia de zaharoza singura. Daca mortalitatea continua sa creasca cu mai mult de 10% dupa primele 24 h, durata testului se prelungeste la maximum 96 ore, cu conditia ca mortalitatea martorului sa fie mai mica sau egala cu 10%.

Observatiile

Mortalitatea se inregistreaza la 4 h dupa inceperea testului si apoi la 24 h si 48 h (adica dupa administrarea dozei). Daca este necesara o perioada prelungita de observare, se fac alte evaluari la intervale de 24 h, pana la maximum 96 h, cu conditia ca mortalitatea martorului sa fie mai mica sau egala cu 10%.

Se estimeaza cantitatea de hrana consumata per grupa. Compararea cantitatilor consumate din hrana tratata si netratata in 6 ore de administrare poate furniza date referitoare la gustul placut al hranei tratate.

Se consemneaza toate manifestarile anormale observate in timpul desfasurarii testului.

Testul la valori limita

In unele cazuri (de ex. cand se preconizeaza ca o substanta testata are o toxicitate mica) se poate efectua un test la valori limita, utilizand 100 μg s.a./albina pentru a demonstra ca DL₅₀ este mai mare decat valoarea respectiva. Se utilizeaza acelasi mod de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevanti, evaluarea cantitatii de hrana consumata si utilizarea etalonului de toxicitate. Daca apar mortalitati, se efectueaza un studiu complet. Daca se observa efecte subletale (1.6.4), se consemneaza.

REZULTATELE SI RAPORTAREA

REZULTATELE

Rezultatele se sistematizeaza in tabele, care prezinta pentru fiecare grupa supusa tratamentului, precum si pentru grupele martor si cele tratate cu etalon de toxicitate, numarul de albine utilizate, mortalitatea in fiecare moment de observare si numarul de albine cu un comportament negativ. Datele privind mortalitatea se analizeaza prin metode statistice corespunzatoare (de ex. analiza probit, media mobila, probabilitatea binominala) (3( (4). Se traseaza curbele doza-raspuns pentru fiecare observare recomandata si se calculeaza pantele curbelor si dozele letale medii (DL₅₀) cu limite de incredere de 95%. Sunt posibile corectii pentru mortalitatea martorului cu ajutorul corectiei lui Abbott (4) (5). Daca hrana tratata nu se consuma in intregime, se determina doza de substanta testata per grupa. DL₅₀ se exprima in μg de substanta testata per albina.

RAPORT DE TESTARE

Raportul de testare trebuie sa contina urmatoarele date:

Substanta testata

natura fizica si proprietatile fizico-chimice relevante (de ex. stabilitatea in apa, presiunea vaporilor),

datele de identificare chimica, care includ formula structurala, puritatea [adica pentru pesticide, identitatea si concentratia substantei(substantelor) activa(active)].

Speciile experimentale

denumirea stiintifica, roiul, varsta aproximativa (in saptamani), metoda de colectare, data colectarii,

datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experimentale, care includ starea de sanatate, eventuale boli ale adultilor, tratamente prealabile, etc.

Conditii experimentale

temperatura si umiditatea relativa in camera experimentala,

conditiile de adapost care includ tipul, dimensiunea si materialul custilor,

metodele de preparare a solutiilor mama si experimentate (se specifica solventul si concentratiile acestuia, daca se utilizeaza),

metoda de preparare a solutiilor mama si frecventa reinnoirii (trebuie sa se specifice agentul de solubilizare si concentratiile acestuia, daca se utilizeaza),

protocolul testului, de ex. numarul de incercari si concentratiile experimentate, numarul de martori; pentru fiecare concentratie experimentata si martor, numarul de custi identice, si numarul de albine per cusca,

data efectuarii testului.

Rezultatele

rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, daca s-a efectuat,

datele brute: mortalitatea la fiecare doza experimentata si fiecare moment de observare,

trasarea curbelor doza-raspuns la sfarsitul testului,

valorile DL₅₀ cu limite de incredere de 95%, la fiecare din momentele de observare recomandate, pentru substanta testata si etalonul de toxicitate,

metodele statistice utilizate pentru determinarea DL₅₀,

mortalitatea la martori,

alte efecte biologice observate sau masurate, de ex. comportamentul anormal al albinelor (inclusiv respingerea dozei cu substanta testata), rata consumului de hrana la grupele tratate si netratate,

orice abatere de la modul de lucru descris si orice alte date relevante.

BIBLIOGRAFIE

EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products ó Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.

Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp. 119-125.

Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.

Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.