Biodegradare testul de inhibare a respiratiei namolului activ

BIODEGRADARE TESTUL DE INHIBARE A RESPIRATIEI NAMOLULUI ACTIV

1. METODA

1.1. Introducere

Metoda descrisa evalueaza efectul substantei de testat asupra microorganismelor prin masurarea vitezei de respiratie in conditii definite in prezenta unor concentratii diferite ale substantei de testat.

Scopul acestei metode este de a da o metoda de selectie rapida prin care se pot identifica substantele care pot sa afecteze negativ instalatiile de tratare microbiana aeroba si se pot indica concentratiile neinhibitoare adecvate ale substantelor de testat ce trebuie folosite in testele de biodegradabilitate.

Un test de stabilire a domeniului de concentratii poate precede testul definitiv. Acesta poate oferi informatii despre intervalul de concentratii ce trebuie folosite in testul principal.

Se includ doua controale fara substanta de testat in proiectul de testare, unul la inceputul si celalalt la sfarsitul seriilor de testare. Fiecare serie de namol activ trebuie apoi verificata folosind o substanta de referinta.

Aceasta metoda se aplica pentru substantele care, datorita solubilitatii in apa si volatilitatii reduse, pot ramane in apa.

Pentru substantele cu solubilitate limitata in mediul de testare nu se poate determina CE₅₀.

Rezultatele bazate pe absorbtia de oxigen pot duce la concluzii eronate cand substanta de testat are tendinta sa realizeze o fosforilare oxidanta necuplata.

Este util sa avem urmatoarele informatii pentru a efectua testul:

- solubilitatea in apa

- presiunea de vapori

- formula structurala

- puritatea substantei de testat

Recomandare

Namolul activ poate contine organisme potential patogene si trebuie manuit cu grija.

Definitii si unitati

Viteza de respiratie este consumul de oxigen al microorganismelor namolului aerob din apa reziduala exprimat in general, ca mg O₂ pe mg de namol pe ora.

Pentru a calcula efectul inhibitor al substantei de testat la o anumita concentratie, viteza de respiratie este exprimata ca procent al mediei celor doua viteze de control al respiratiei:

2R_s

(1 - ------------ ) x 100 = procent de inhibare

R_C1 + R_C2

unde:

R_s.= viteza consumului de oxigen la concentratia testata a substantei de testat

R_C1 = viteza consumului de oxigen, control 1

R_C2 = viteza consumului de oxigen, control 2

CE₅₀ in aceasta metoda este concentratia substantei de testat la care viteza de respiratie este de 50% din cea rezultata din controlul efectuat in conditiile descrise in aceasta metoda.

1.3. Substante de referinta

Se recomanda sa se foloseasca 3,5 diclorfenol cunoscut ca inhibitor al respiratiei , ca substanta de referinta si de testat pentru stabilirea CE₅₀ pe fiecare serie de namol activ ca un mijloc de verificare a faptului ca sensibilitatea namolului nu este anormala.

1.4. Principiul metodei de testare

Se masoara viteza de respiratie a namolului activ dupa un timp de contact de 30 minute sau 3 ore, sau ambele cu o cantitate standard de apa uzata sintetica. Viteza de respiratie a aceluiasi namol activ in prezenta diferitelor concentratii ale substantei de testat se masoara in conditii identice. Efectul inhibitor al substantei de testat la o anumita concentratie este exprimat ca procent al mediei celor doua viteze de control a respiratiei. Valoarea CE₅₀ se calculeaza din determinari la diferite concentratii.

1.5. Criterii de calitate

Rezultatele testului sunt validate daca :

- vitezele de respiratie ale celor doua controale sunt in limitele a 15% din fiecare

- CE₅₀ (30 minute si /sau 3 ore) a 3,5 - diclorfenol este in domeniul acceptat de
5-30 mg/l

1.6. Descrierea metodei de testare

1.6.1. Reactivi

1.6.1.1. Solutiile substantei de testat

Solutiile substantelor de testat sunt pregatite proaspat la inceputul studiului, folosind o solutie stoc. Este adecvata concentratia de solutie stoc de 0,5 g/l daca este urmata procedura recomandata mai jos.

1.6.1.2. Solutia substantei de control

De exemplu, se poate pregati o solutie de 3,5-diclorfenol astfel:

se dizolva 0,5 g de 3,5-diclorfenol in 10 ml NaOH 1M,

se adauga aproximativ 30 ml apa distilata,

se adauga sub agitare H₂SO₄ 0,5 M pana in punctul precipitarii incipiente (vor fi necesari aprox. 8 ml de 0,5 M H₂SO₄ 0,5 M)

se aduce amestecul la 1 l cu apa distilata.

pH-ul trebuie sa fie intre 7 si 8.

1.6.1.3. Apa uzata sintetica

O apa uzata sintetica de alimentare se prepara prin dizolvarea urmatoarelor cantitati de substante intr-un litru de apa:

- 16 g peptona

- 11 g extract de carne

- 3 g uree

- 0,7 g NaCl

- 0,4 g CaCl₂ . 2H₂O

- 0,2 g MgSO₄ . 7H₂O

- 2,8 g K₂HPO₄

Nota 1:Aceasta apa uzata sintetica este de 100 de ori mai concentrata decat cea descrisa in raportul tehnic propus de OECD ca metoda pentru determinarea biodegradabilitatii surfactantilor folositi la detergentii sintetici (11 iunie 1976) cu adaugarea hidrogen fosfatului de dipotasiu.

Nota 2: Daca mediul preparat nu se foloseste imediat, acesta trebuie pastrat la intuneric, la 0 - 4^oC nu mai mult de 1 saptamana, in conditii care nu produc nici o schimbare in compozitia acestuia. Mediul trebuie sterilizat inainte de depozitare sau peptona si extractul de carne pot fi adaugati la putin timp inainte de realizarea testului. Inainte de utilizare acestea trebuie amestecate bine si ajustat pH-ul.

1.6.2. Aparatura

Sunt necesare echipamente de laborator normale si in special urmatoarele:

- aparat de masura

- dispozitiv de aerare

- pH-metru

- oxigenometru

1.6.3. Pregatirea inoculului

Se foloseste namol activ dintr-o instalatie de tratare a apelor uzate in mod special menajera, ca inocul microbian pentru testare.

Daca este necesar, la revenirea in laborator, particulele mari pot fi inlaturate prin sedimentare dupa o scurta perioada de timp, de exemplu 15 minute, iar stratul superior de solide fine poate fi decantat pentru utilizare. Alternativ, namolul poate fi amestecat folosind un agitator timp de cateva secunde.

In plus, daca se considera ca sunt prezente substante inhibitoare, namolul trebuie spalat cu apa de la robinet sau cu o solutie izotonica. Dupa centrifugare, supernatantul este decantat (acest procedeu se repeta de 3 ori).

O cantitate mica de namol este cantarita si uscata. Din acest rezultat se poate calcula cantitatea de namol umed care trebuie suspendata in apa pentru a obtine o solutie cu namol activ ce contine materii in suspensie in intervalul de 2-4 g/l. Acest nivel da o concentratie intre 0,8 si 1,6 g/l in mediul de testare daca se urmeaza procedura recomandata mai jos.

Daca namolul nu poate fi folosit in ziua prelevarii se adauga 50 ml apa uzata sintetica la fiecare litru de namol activ pregatit conform descrierii de mai sus; acesta este apoi aerat peste noapte la 20 ± 2^oCsi in timpul zilei pana la utilizare. Inainte de utilizare se verifica si se ajusteaza pH-ul, daca e necesar, la pH 6-8. Materiile in suspensie din solutia amestecata trebuie determinate conform paragrafului precedent.

Daca este necesar, la aceeasi serie de namol ce trebuie folosita in zilele ulterioare (max. 4 zile), se adauga 50 ml de apa uzata sintetica la litru de namol, la sfarsitul fiecarei zile lucratoare.

1.6.4. Efectuarea testului

Durata / Timpul de contact: 30 minute si/sau 3 ore, in timpul caruia are loc aerarea

Apa: apa potabila (declorinata daca este necesar)

Alimentare cu aer aer curat fara ulei, debit de aer de la 0,5 l/min pana la
1 l/min.

Aparat de masura un vas cu fundul plat, ca cel pentru CBO

Aparat de masurare     electrod pt. Oxigen, legat la inregistrator

a oxigenului

Solutie nutritiva apa uzata sintetica (vezi mai sus)

Substanta de testat solutia de testare este pregatita proaspat la inceputul

testului

Substanta de referinta de exemplu, 3,5-diclorfenol (cel putin 3 concentratii)

Martori proba inoculata fara substanta de testat

Temperatura: 20 ± 2^oC

O procedura experimentala, care poate fi urmata atat pentru test cat si pentru substanta de referinta, pentru o perioada de contact de 3 ore, este data mai jos:

Se folosesc cateva vase (de exemplu, pahare de laborator de 1 l).

Trebuie folosite cel putin 5 concentratii distantate de un factor constant care sa nu depaseasca 3,2.

La momentul '0' 16 ml apa de alimentare sintetica sunt adusi la 300 ml cu apa. Se adauga 200 ml inocul microbian si amestecul total (500 ml) este turnat intr-un prim vas (primul control C1).

Vasele de testare trebuie aerate continuu pentru ca O₂ dizolvat sa nu scada sub 2,5 mg/l si imediat inainte de masurarea vitezei de respiratie concentratia de O₂ trebuie sa fie de aprox. 6,5 mg/l.

La momentul '15 minute' (15 minute este un interval arbitrar, dar convenabil) cele de mai sus se repeta, exceptand faptul ca se adauga 100 ml din solutia stoc a substantei de testat la 16 ml apa uzata sintetica inainte de a adauga apa pana la 300 ml si inocul microbian, pentru a obtine un volum de 500 ml. Acest amestec este apoi turnat in al doilea vas si aerat ca mai sus. Acest proces se repeta la intervale de 15 minute cu adaugare de volume diferite de solutie stoc a substantei de testat pentru a obtine o serie de vase ce contin concentratii diferite ale substantei de testat. In final, se pregateste al doilea control (C2).

Dupa 3 ore, se inregistreaza pH-ul si la o proba bine amestecata din continutul primului vas se masoara viteza de respiratie pe o perioada de pana la 10 minute cu ajutorul oxigenometrului.

Aceasta determinare se repeta pentru continutul fiecarui vas la intervale de 15 minute, astfel incat timpul de contact in fiecare vas sa fie de 3 ore.

Substanta de referinta este testata pe fiecare lot de inocul microbian in acelasi fel.

Va fi necesar un regim diferit (de exemplu, mai mult de un oxigenometru) cand masuratorile trebuie sa se faca dupa 30 minute de contact.

Daca se cere masurarea consumului chimic de oxigen, se pregatesc alte vase ce contin substanta de testat, apa uzata sintetica de alimentare si apa, dar nu si namol activ. Se masoara consumul de oxigen si se inregistreaza dupa un timp de aerare de 30 minute si/sau 3 ore (timp de contact).

2. DATE SI EVALUARE

Viteza de respiratie se calculeaza dupa o curba de inregistrari cuprinsa intre aprox.
6,5 mg O₂ /l si 2,5 mg O₂/l sau dupa o perioada de 10 minute, cand viteza respiratiei este redusa. Portiunea curbei de respiratie pe care se masoara viteza respiratiei trebuie sa fie liniara.

Daca vitezele de respiratie ale celor doua controale nu sunt intre 15% din fiecare sau CE₅₀ (30 minute si/sau 3 ore) a substantei de referinta nu este in intervalul acceptat (5-30 mg/l pentru 3,5 -diclorfenol) testul nu este validat si trebuie repetat.

Procentul de inhibare se calculeaza la fiecare concentratie de testat (vezi 1.2). Procentul de inhibare este reprezentat grafic fata de concentratie pe hartie logaritmica normala (sau probabilitate logaritmica) si se obtine valoarea CE₅₀. Limitele de confidenta 95% pentru valorile CE₅₀ se pot determina folosind procedurile standard.

3. RAPORTARE

3.1. Raport de testare

Daca se poate, raportul de testare trebuie sa contina urmatoarele:

- substanta de testat: datele de identificare chimica

- sistemul de testare: sursa, concentratia si orice pretratare a namolului activ

- conditii de testare:

- pH-ul amestecului de reactie inainte de masurarea respiratiei

- temperatura de testare

- durata testului

- substanta de referinta si CE₅₀ masurat

- absorbtia abiotica de oxigen (daca este cazul)

- rezultate :

- toate datele masurate

- curba de inhibare si metoda de calcul a CE₅₀

- CE₅₀ si daca se poate, limitele de confidenta 95%, CE₂₀ si CE₃₀

- toate observatiile si abaterile de la aceasta metoda care ar putea influenta rezultatul.

3.2. Interpretarea datelor

Valoarea CE₅₀ trebuie privita ca un ghid referitor la toxicitatea posibila a substantei de testat asupra namolului activ la tratarea apei uzate sau asupra microorganismele din apa uzata, deoarece interactiunile complexe care au loc in mediu nu pot fi simulate precis in testul de laborator. In plus, substantele de testat care pot avea un efect inhibitor asupra oxidarii amoniacului pot produce si curbe de inhibare atipice. De aceea, aceste curbe trebuie interpretate cu grija.

4. BIBLIOGRAFIE

International Standard ISO 8192-1986.

Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.

Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.

ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also described by:

Robra, B., Wasser/ Abwasser 117, 1976, p.80.

Schefer, w., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C (81) 30 final.