 |
|
 |  |
|
|
| |
 | Biologie | Chimie | Didactica | Fizica | Geografie | Informatica |
| Istorie | Literatura | Matematica | Psihologie |
Biomonitorizarea poluarii apelor in Romania - o necesitate de viitor
cu dublǎ importantǎ
Abstract
In December 2000, European Union (EU) published
new directives in the field of water which impose to all member states to
assess the ecological situation of aquatic environment and to define their objectives
and strategies with the aim to achieve a good quality of water until
Romanian scientific community succeded in
creating a consortium reassembling national laboratories with ecotoxicological programs
and international partners from France, Germany,
Our own objective concerns the detection of aquatic environment pollution in Romania and more particularly in the Danube basin, the biomonitoring of the pollution degree and the appreciation of the sanitary quality of food products of aquatic origin by applying original ecotoxicologic methods based on the use of viability and apoptosis biomarkers of nucleated erythrocytes and of hepatocytes. The obtained results will be analyzed by statistical methods and mathematical modeling in view to prognose the evolution of aquatic ecosystem and to insure a durable management of aquatic environment and biological resources.
Uniunea europeana a publicat in decembrie 2000 o directiva cadru in domeniul apelor (Directive 2000/60/CE du Parlament Europeen) care modifica considerabil modul de control al mediului acvatic. Aceasta noua directiva impune statelor membre determinarea starii ecologice a mediilor acvatice, clasificarea lor pe categorii de calitate, obiectivele si strategiile pentru a se ajunge la o buna calitate a apelor pana in 2015. De asemeni se impune masurarea concentratiilor substantelor toxice, elaborarea listelor de substante si a concentratiile admise in functie de criteriile biologice. Aceasta directiva este revolutionara pentru ca ea recunoaste importanta caracterului biologic si ecologic in stabilirea criteriilor clasice de calitate a apei, impunand punerea la punct a metodelor de determinare a calitatii ecologice plecand de la diferite specii: nevertebrate benctonice, pesti, etc. si implicand o cooperare stiintifica transfrontariera intre toate statele membre ale UE pentru a standardiza aceste metode.
Politica de mediu a Uniunii Europene se bazeaza pe ideea ca asigurarea calitatii mediului la standarde inalte stimuleaza inovarea si oportunitatile in afaceri. Aplicarea directivei la scara europeana reprezinta o provocare pentru monitorizarea mediului acvatic. Cresterea complexitatii degradarii mediului inconjurator necesita o accentuare a capacitatilor de abordare stiintifica, a monitorizarii acestuia si o sesizare cat mai precoce a riscurilor.
În raport cu situatia pe plan national si international, comunitatea stiintifica romaneasca nu a ramas indiferenta si a reusit sa creeze un consortiu reprezentativ format din laboratoare cu preocupari de ecotoxicologie apartinand institutelor de cercetare (Institutul National de Cercetare -Dezvoltare pentru Stiinte Biologice - Bucuresti si Institutul de Statistica Matematica si Matematica aplicata "Gh. Mico-C. Jacob "al Academiei Romane) cat si ale mediului universitar (Facultatea de Biologie a Universitatii Bucuresti, Facultatea de Biologie a Universitatii din Pitesti, Facultatea de Stiinte ale Naturii apartinand Universitatii de Vest 'Vasile Goldis' din Arad, avand alaturi de noi si parteneri internationali din Universitatea de Stiinte si Tehnologii Lille 1, Franta, reprezentata prin Laboratorul de Chimie Biologica, Central de Biologie al Universitatii din Kiel si Oficiul Federal pentru Hidrologie din Koblenz, Germania, Universitatea din Novisad, Serbia si Asociatia Internationala pentru cercetarea Dunarii.
Scopul acestei retele este acela de a dezvolta o colaborare stiintificǎ existentǎ de mai multi ani si care are ca obiectiv comun detectarea poluarii mediului acvatic din Romania si in particular a Bazinului Dunarii, in vederea biomonitorizarii gradului sau de poluare si de apreciere a sanogenezei produselor alimentare de provenientǎ acvaticǎ. Cercetarile, finantate pentru inceput printr-un contract de excelenta pe perioada 2005-2008, se bazeaza pe metode noi, alternative sau substitutive, de ecotoxicologie modernǎ, pe biomarkeri de apoptozǎ si biosenzori celulari evidentiati in cercetarile noastre de laborator pentru biomonitorizarea mediului acvatic, in particular, al bazinului Dunarii (Sistemul Mures-Crisuri-Timis, Arges, Dambovita, Dunare si Delta Dunarii) si corelarea datelor obtinute cu teste clasice de ecotoxicologie, indicatori ecologici ai poluarii mediului si analize de apreciere a calitatii produselor alimentare de origine piscicola. Integrarea informatiilor ample si a rezultatelor cercetarii se va face prin analizǎ statisticǎ si modelare matematicǎ, in vederea prognozarii evolutiei ecosistemelor acvatice si evitarea unor dezastre ecologice, pentru managementul durabil al mediului acvatic si al resurselor biologice.
În fata numeroaselor substante rezultate din activitatile tehnologice care se regasesc cotidian in mediul inconjurator, detectarea rapidǎ a unei prezente excesive de contaminanti, determinarea toxicitatii lor si o preventie a consecintelor acestora sunt absolut necesare pentru asigurarea protectiei ecosistemelor. Astazi se estimeaza cǎ existǎ mai mult de 100 000 produse chimice care sunt utilizate in mod regulat in industrie si care sunt contaminanti si potentiali poluanti ai ecosistemului global.
Aparuta din necesitate in anii
1950 in America de Nord datoritǎ substantelor chimice deversate din agriculturǎ,
industrie si aglomeratiile urbane, evaluarea toxicitatii
mediului, numitǎ 'ecotoxicologie' de Truhaut in
Dupa 1970, biotestele de laborator cu nevertebrate, alge si bacterii, apoi teste multi-specii precum si cele in situ au fost integrate in studii, permitand o predictibilitate mai largǎ a efectelor poluantilor pe termen scurt si lung, si pe mai multe nivele biologice din ecosistem.
Pentru a raspunde acestor nevoi, ecotoxicologia mediului acvatic s-a dezvoltat in toti acesti 30 de ani, atat la nivel stiintific cat si legislativ, bazandu-se pe analiza chimica a micropoluantilor cat si pe metodele biologice de evaluare, respectiv pe testele de ecotoxicologie (bioanalize sau bioteste). Pe de o parte tehnicile de analizǎ au devenit din ce in ce mai precise si mai sensibile, cum ar fi cromatografia in fazǎ gazoasǎ cu detector de masa pentru micropoluantii organici si spectrometria de masǎ in plasmǎ pentru metalele grele, ambele permitand analiza unui spectru larg de poluanti, iar pe de altǎ parte tipurile de bioteste ecotoxicologice s-au multiplicat inainte de a cunoaste o perioadǎ de standardizare la scarǎ internationala (norme ISO, CEN, linii directoare OCDE).
Cu ajutorul biotestelor au fost puse pe piata noi substante si produse chimice, conform prescriptiilor Organizatiei pentru Cooperare si Dezvoltare Economica (OCDE) si Uniunii Europene pentru evaluarea riscurilor fata de mediul inconjurator si pe de alta parte pentru supravegherea mediilor acvatice in cadrul programelor de actiune ale agentiilor de protectie impotriva poluarii.
Domeniile de aplicare a biotestelor ecotoxicologice sunt deci multiple: inregistrarea de noi substante chimice (fitosanitare, pesticide, detergenti, etc.), supravegherea apelor uzate menajere si industriale la intrarea si iesirea din statiile de epurare, stabilirea ecotoxicitatii deseurilor speciale si evaluarea riscului ecotoxicologic pentru siturile contaminate, controlul apelor de percolare si al namolurilor din statiile de epurare. Rezultatele biotestelor permit orientarea gestionarii poluantilor de o maniera adecvata deoarece capacitatea lor de predictie este un ajutor pretios pentru evaluarea cu titlu preventiv a riscului de degradare a unui ecosistem. Ele servesc drept complement datelor chimice pentru stabilirea criteriilor de calitate si concentratii maxime admise.
Mai multe tari au introdus deja programe de bio-supraveghere. Astfel in Franta se urmareste determinarea incarcaturii toxice a efluentilor deversati de statiile de epurare urbane pentru apele menajere si industriale, si de asemeni studiul ecotoxicitatii asociate sedimentelor Ronului (Agentia de apa Rhon-Mediterana-Corsica). În
Germania exista o retea de control a ecotoxicitatii efluentilor industriali, iar in Elvetia se realizeaza supravegherea potentialului ecotoxicologic al apelor uzate pentru mai multe cantoane (Vaud, Geneva Berna) si bazinul lemanique, precum si supravegherea deversarilor industriale intr-o canalizare legata la o statie de epurare pentru ape menajere (Argovie). În Canada sunt introduse diverse reglementari privind apele, substantele periculoase, imersarea deseurilor la mare adancime in mare, pesticidele si epurarea apelor uzate conform legilor "Canadian Environmental Protection Act, Pest Control Products Act si programul Municipal-Industrial Strategy for Abatement (Ontario)". USA si Canada, printr-o colaborare stransa folosesc criteriile de ecotoxicitate pentru definirea a 43 situri prioritare Areas of Concern of Great Lakes, urmata de elaborarea planurilor de restaurare specifica fiecarui sit (Remedial Action Plans/ Great Lakes Water Quality Program-International Joint Commission).
Un test ecotoxicologic este un test experimental care determina efectul unuia sau mai multor produse pe un grup de organisme selectionate, in conditii bine definite (Keddy et al., 1994). Testele de toxicitate au ca scop furnizarea de date asupra efectelor obtinute pe un esantion, in scopul aprecierii prin extrapolare a pericolului exercitat de ansamblul din care a fost prelevat esantionul asupra mediului inconjurator. Efectele toxice sunt masurate in laborator expunand organisme indicatoare actiunii esantionului de testat si prin compararea cu un esantion de control ca martor (fara contaminant) bazandu-se pe principiul de cauzalitate intre doza si raspuns. Ele utilizeaza diferite mijloace pentru masurarea toxicitatii produsului. Maniera cea mai comuna utilizata este masurarea mortalitatii sau reproducerii, dar exista un interes crescut in utilizarea de parametri mult mai sensibili. Efectele biochimice, fiziologice, de reproducere si comportament pot de asemeni sa dea masura toxicitatii. Cea mai mare parte din testele de toxicitate dau o estimare a dozei care afecteaza 50% din populatie. În cadrul bio-supravegherii apelor uzate, cele mai des utilizate teste sunt testele cu daphnii, bacterii luminescente si alge verzi de apa dulce, motiv pentru care ele au fost retinute pentru comparare intre diverse laboratoare, existand numeroase norme la scara internationala sau nationala pentru fiecare test in vederea standardizarii acestora, norme ISO emise de Organizatia internationala de normalizare, Comitetul european de normalizare (CEN), Organizatia de cooperare si de dezvoltare economica (OCDE ), Association francaise de normalisation (AFNOR), Deutsches Institut fűr Normung (DIN), United States of America Environmental Protection Agency (USEPA), Environnement Canada (EC).
Testele ecotoxicologice pot fi de 2 tipuri, teste de toxicitate acuta care se realizeaza pe o durata foarte scurta (raportat la durata de viata a unei generatii de organisme ) si avantajul lor consta in rapiditatea si costul scazut, dar aceste teste implica in general concentratii crescute de poluanti iar efectul pe termen lung al concentratiilor scazute nu sunt puse in evidenta (ex: testul de imobilizare al Daphniilor care dureaza 24 de ore), si teste de toxicitate cronica care se deruleaza pe o durata relativ lunga de timp in raport cu durata de viata a unei generatii de organisme, ele sunt lungi si mai costisitoare, dar permit evidentierea efectelor unui poluant pe termen lung (ex: testele asupra reproducerii unor organisme).
Scopurile unui studiu ecotoxicologic trebuie sa fie clar definite in prealabil: testele si in consecinta rezultatele nu sunt alese si utilizate de o maniera identica daca este vorba de o supraveghere de rutina, de un studiu specific, de un depistaj preliminar, de un program de cercetare sau de omologarea unei substante. Criteriile alegerii sunt legate de: obiectivul studiului, tipul de toxicitate determinata (acuta sau cronica), simplicitatea manipularii, reproductibilitatea, sensibilitatea fata de micropoluanti, puterea de discriminare, rapiditatea, reprezentativitatea ecologica, normalizarea protocoalelor operatorii, si nu in ultimul rand, costul (Fenske et al., 2006).
Parametrii considerati sunt mai mult sau mai putin reprezentati in functie de nivelul biologic conservat
Poluantii pot fi de natura foarte diversa: substante chimice (pesticide, titei, gaze, metale, substante organice, etc.), factori fizici (caldura, zgomote, radiatii ionizante, etc.) sau biologici (germeni patogeni), si in plus ei se pot potenta reciproc, existand un sinergism de actiune incat stabilirea unor concentratii limita admise, este uneori insuficienta, daca nu chiar periculos de eronata in interpretarea datelor.
Dat fiind faptul ca nu este posibil sa tragem concluzii definitive asupra toxicitatii unui poluant asupra organismelor pornind de la concentratia sa in mediu, in plus de masuratorile fizico-chimice ale poluantului se utilizeaza bioindicatori. Bioindicatorii pot fi exponentii unui ansamblu de poluanti care actioneaza asupra organismului, ceea ce permite observarea efectelor sinergice. Ca definitie, termenul de bioindicator desemneaza speciile biologice sau animale care, datorita particularitatilor ecologice, reactioneaza la un poluant printr-o modificare neta si specifica asupra functiilor vitale .
În prezent se incearca gasirea unor biomarkeri moleculari capabili sa masoare riscul adus de starea de poluare a apelor, in ansamblul actiunii sinergice a agentilor poluanti fata de organismele acvatice, respectiv fondul piscicol. În ecotoxicologie, biomarker-ul este o schimbare observabila si/sau masurabila la nivel molecular, biochimic, celular, fiziologic sau comportamental, care releva expunerea prezenta sau trecuta a unui individ la cel putin o substanta chimica cu caracter poluant.
Un biomarker, masurat la nivel individual, nu isi gaseste semnificatia ecotoxicologica decat daca descrie, explica si prezice efectele poluante asupra populatiilor si comunitatii care evolueaza in mediul lor natural. Se disting 3 tipuri de biomarkeri: 1) biomarkeri de expunere la un xenobiotic, indicand ca poluantul prezent in mediu a patruns in organism, ei fiind rezultatul interactiei poluantului cu moleculele biologice in tesuturi si /sau lichidele corpului, 2) biomarkeri ai efectelor de expunere permit demonstrarea faptului ca un xenobiotic a intrat in organism si a exercitat un efect toxic sau nu pe o tinta critica ( proteine de stres de exemplu) si 3) biomarkeri de sensibilitate la efectele provocate de expunere percep fenomenul de variatie de origine genetica a raspunsului la contaminarea cu poluanti si se traduce printr-o variatie a sensibilitatii (cresterea cantitatii de glutation S-transferaze sau diminuarea sensibilitatii acetilcolinesterazei, a caror utilizare ca biomarkeri poate sa fie preconizata).
Societatea umana in prezent se confrunta cu probleme care vizeaza direct calitatea vietii si a sanatatii oamenilor: poluarea mediului si calitatea alimentatiei, si care de altfel se gasesc intr-o dependenta directa.
În acest context,
evaluarea poluarii mediului acvatic natural si a celui din fermele
piscicole in particular ca si aprecierea gradului de risc pe care
il are asupra calitatii viitorului produs alimentar se impun cu
mare necesitate. În prezent, cercetatorii incearca
imaginarea continua de noi teste biologice si de identificare a noi
biomarkeri sensibili pentru necesitatea imaginarii continue de noi teste
biologice, gasirii de biomarkeri
sensibili pentru cunoasterea
efectelor imediate si a celor
indepartate ale diverselor substante asupra vietii
acvatice in general si asupra sanatatii omului
in particular. Criteeriile de evaluare ale testelor
ecotoxicologice Nivelul biologic vizat Ecosistem Ecosistem model Populatie Organisme Organe Celule Molecule
Biomarkerii prezinta avantajul de a fi specifici pentru o anumita familie de compusi toxici ceea ce ii face extrem de utili in epidemiologie. De fapt, epidemiologia pune in evidenta corelarile intre contaminarile diferite ale mediului si patologiile prezente la oameni sau perturbarile ecosistemelor. Aceste corelari sunt adesea dificil de interpretat in termeni de relatie cauza - efect datorita numerosilor factori ce pot fi confundati. Un astfel de exemplu il reprezinta un ansamblu de factori poluanti, legat de zonele urbane, unde nu se poate distinge printre cauze utilizarea domestica a produsilor chimici. Tinand cont de impactul specific asupra speciilor prezente in mediu, utilizarea biomarkerilor permite eliminarea acestor ambiguitati si determina relatiile cauza-efect in cazul contaminarilor mediului. Cercetatorii propun utilizarea unor baterii de biomarkeri si a unor programe statistice variate pentru a intelege mai bine fenomenele ce apar in cazul poluarii mediului si pentru monitorizarea acesteia ( Machala et al., 2001; Van der Oost et al, 1997; Cocker et al., 2002; Fenske et al, 2006).
Unul din mecanismele biochimice cele mai des utilizate ca biomaker este inducerea monooxigenazelor legate de citocromul P 450 (Vindimian et al., 1989; Nebert et al., 1991; Flammarion et al., 1999; Sturm et al., 2001). Citocromul P 450 este prezent la mamifere dar si la pesti ceea ce face din acesta un bun biomarker utilizat in biosupravegherea ecosistemelor acvatice, existand kit-uri de dozare a citocromului P 450 prin imunodetectie si in prezent propus pentru standarizare ca norma ISO.
Numerosi alti biomarkeri sunt utilizati pentru a caracteriza prezenta in concentratii neletale a compusilor toxici prezenti in mediu, precum dozarea acetilcolinesterazei care este inhibata specific de anumite pesticide organofosforice prezente in ape (Mason et al., 1989, Mason et al., 2000), dozarea de etoxiresorufina-O-di etilaza ( ethoxyresorufine-O-deethylase) cunoscuta ca metoda EROD ce este echivalentul reactiei de hidroxilare a hidrocaburilor ( Vindimian et al., 1989, Maria et al., 2005 În Franta metoda EROD este utilizata pentru a demonstra capacitatea acestui biomaker de evidentiere a poluarii apelor reziduale industriale si de biomonitorizare a raurilor cu acest biomarker (Flammarion and Garric,1997; Guenguerich et al., 1999; Gauthier et al., 2004; Vindimian et al.,
Alte mecanisme biochimice pot fi de asemeni utilizate in scopul identificarii rapide a unei substante toxice prezente intr-un amestec. Este cazul utilizarii mitocondriilor (Blondin, G.et al., 2001) si veziculelor submitocondriale (Argese et al., ), capabile de a mentine in stare functionala enzimele lantului de fosforilare oxidativa. O perturbare a lipidelor datorita prezentei unei substante hidrofobe va determina o perturbare a transferului de electroni ceea ce pune in evidenta toxicitatea unei substante dintr-un amestec. O alta metoda promitatoare este utilizarea constructiilor genetice ce permit evidentierea unei activitati biologice prin intermediul expresiei unui sistem "raportor". De exemplu, constructia unei bacterii ce contine gena Lux ce codifica o proteina luminescenta, permite astfel evidentierea prezentei in situ a compusilor chimici. (Laberge et al., 1999)
Recent s-a propus utilizarea biosenzorilor pentru biosupravegherea calitatii apelor si a contaminantilor alimentari (Baeumner, 2003).
"Biosenzorul", ca o definitie generala, reprezinta orice sistem care detecteaza prezenta unui substrat, prin utilizarea unei componente biologice care furnizeaza un semnal ce poate fi cuantificat. Biosenzorii celulari sunt sisteme ce combina dispozitivele analitice si celulele pentru a obtine semnale biologice ca elemente de recunoastere. Biosenzorii prezinta doua caracteristici intrinseci: 1) prezinta o selectivitate naturala la compusii biologic activi si 2) au capacitatea de a raspunde la acesti compusi intr-o maniera fiziologic relevanta. Datorita caracteristicilor lor, acesti biosenzori pot detecta variatiile din mediul inconjurator si pot fi astfel utilizati in testele de ecotoxicologie si in monitorizarea mediului inconjurator, acolo unde sursa de poluare si natura substantelor toxice nu pot fi cunoscute (Krőger and Low , 2005
În acest context, si in Romania evaluarea poluarii mediului acvatic natural si a celui din fermele piscicole in particular ca si aprecierea gradului de risc pe care il are asupra calitatii viitorului produs alimentar se impun cu mare necesitate. În prezent, cercetatorii incearca imaginarea continua de noi teste biologice de identificare de noi biomarkeri sensibili pentru necesitatea imaginarii continue de noi teste biologice, gasirii de biomarkeri sensibili pentru cunoasterea efectelor imediate si a celor indepartate ale diverselor substante asupra vietii acvatice in general si asupra sanatatii omului in particular. Identificarea lor poate conduce la imaginarea de biosenzori celulari capabili sa asigure o biomonitorizare eficienta a mediului acvatic, in perfecta armonizare cu legislatia in vigoare.
Toxicologistii (ecotoxicologistii) au considerat mult timp ca celulele pot fi omorate de o mare varietate de substante toxice care, in functie de concentratie, cauzau leziuni celulare majore sau o perturbare majora a mediului celular, conducand la necroza (explozie celulara). Acum se cunoaste ca apoptoza este forma majora de moarte patofiziologica (sinucidere celulara) si ca necroza intervine numai atunci cand agresiunea substantelor toxice este puternica. Apoptoza este astazi de un interes major in toxicologia moleculara, jucand un rol central in actiunea multor substante toxice, ceea ce ii confera un rol important in studiul potentialului lor toxicologic si genotoxic (Knopper et al., 2005
În ultimii 10 ani noi ne-am concentrat atentia pe studiul mecanismelor mortii celulare programate ale eritrocitelor vertebratelor si am demonstrat ca moartea programata a eritrocitelor poate fi indusa rapid atat in eritrocitele umane lipsite de nucleu si alte organite celulare( Bratosin et al, 2001) cat si in cele de batracian (Rana sp.) care prezinta o cascada tipica de evenimente, asemenea apoptozei celulare din alte tipuri celulare. Aceasta moarte celulara programata (PCD) implica diminuarea potentialului membranar mitocondrial (DYm), activarea caspazei-3 efectoare, condensarea si fragmentarea cromatinei (Bratosin et al, 2004). Eritrocitele animalelor acvatice, in particular cele de peste, sunt direct expuse poluantilor absorbiti prin diferite cai (in special la nivel de branhii), ca si celulele hepatice, cunoscute pentru functia lor de detoxifiere. În prezent se cunoaste foarte putin despre efectul substantelor toxice din mediul inconjurator asupra posibilitatii de inducere a apoptozei. În aceste conditii noi consideram ca utilizarea acestor celule poate furniza biomarkeri sensibili de apreciere a poluarii si ulterior conceperea de teste si biosenzori de apreciere a gradului de toxicitate si poluare a mediului acvatic, sau aprecierea calitatii produselor alimentare, in contextul problemelor majore ridicate de civilizatia moderna, cu atat mai mult cu cat analiza se face prin citometrie de flux, metoda moderna si rapida ce permite si o analiza statistica a datelor.
Testul de ecotoxicologie imaginat de noi se bazeaza pe fenomenul de apoptoza, respectiv pe inducerea acestui fenomen in vitro sub actiunea factorilor poluanti, fenomen ce poate fi cuantificat cu ajutorul unui kit de apoptoza continand Annexina V-FITC si Iodura de propidiu (Figura 2 B).
Sub actiunea factorilor poluanti, chiar micropoluanti care actioneaza in sinergism, eritrocitul nucleat va intra in apoptoza si va externaliza pe suprafata sa resturi de fosfatidilserina ce sunt recunoscute specific de Annexina V ce se leaga de acestea in prezenta ionilor de Ca2+. Annexina V putand fi marcata cu un fluorocrom precum FITC sau PE se poate cuantifica numarul celulelor in apoptoza, prin citometrie in flux. Faza tardiva, finala, a fenomenului de apoptoza se caracterizeaza prin pierderea integritatii membranare, fenomen ce poate fi de asemeni vizualizat cu ajutorul Iodurii de
Propidiu, colorant vital ce se fixeaza in celulele moarte cu bariera membranara distrusa pe structura nucleului. În consecinta, externalizarea de fosfatidilserina poate fi considerata un biomarker de poluare, acest fenomen fiind debutul unei morti celulare provocata de un anumit nivel toxic de poluare.
Evaluarea rezultatelor pentru biotest se bazeaza pe examenul citogramelor FL1/FL2 (AnnexinaV-FITC/PI) din Figura 2, conform cu datele statistice furnizate de programul CellProQuest al citometrului in corelare cu dilutiile facute. Trasarea curbelor "concentratie-raspuns" celular in vederea calcularii valorii CE50 se face conform figurilor prezentate in continuare, unde se calculeaza CE 50 atat pentru martor cat si pentru esantioanele de testat. Curbele concentratie-raspuns" au pe abscisa concentratiile de poluant iar pe ordonata % efectului toxic urmarit (Figura 3 ), care in cazul nostru este reprezentat de % celule moarte rezultate din statisticile analizei prin citometrie in flux a esantioanelor. Acest test original va putea fi aplicat si imbunatatit pentru utilizarea lui ca test original in biosupravegherea poluarii acvatice.
Evaluarea rezultatelor pentru biotest se bazeaza pe examenul citogramelor FL1/FL2 (AnnexinaV-FITC/PI) din Figura 2, conform cu datele statistice furnizate de programul CellProQuest al citometrului in corelare cu dilutiile facute.Trasarea curbelor "concentratie-raspuns" celular in vederea calcularii valorii CE50 se face conform figurilor prezentate in continuare, unde se calculeaza CE 50 atat pentru martor cat si pentru esantioanele de testat. Curbele "concentratie-raspuns" au pe abscisa concentratiile de poluant iar pe ordonata % efectului toxic urmarit (Figura 3 ), care in cazul nostru este reprezentat de % celule moarte rezultate din statisticile analizei prin citometrie in flux a esantioanelor. Acest test original va putea fi aplicat si imbunatatit pentru utilizarea lui ca test original in biosupravegherea poluarii acvatice.
Cel mai frecvent, pentru testele ecotoxicologice, rezultatele sunt exprimate condensat prin concentratia care induce un efect toxic de 50 % asupra indivizilor (mortalitate celulara sau a organismelor) sau o inhibitie de 50 % a activitatii organismelor (luminescenta, crestere) in comparatie cu martorul.
Figura 3. Graficul curbei concentratie-raspuns pentru calculul CE50 si CL
Concentratie
Aceasta concentratie, numita si concentratie eficienta 50 = CE50, este mediana calculata dupa relatia doza-raspuns:
Ø CE50 : concentratia eficace care antreneaza un efect (ex. Imobilizarea pentru testul cu Daphnia)
Ø CL50 : concentratia letala pentru testele de mortalitate (ex. Testul pe pesti sau testele celulare)
Ø CI50 : concentratia de inhibitie pentru testele de activitate (ex. Luminescenta bacteriana, cresterea algelor, reproducerea Daphniilor)
Pragurile de toxicitate pot fi exprimate fie printr-o valoare particular calculata precum CEx, cu x cuprins intre 1 si 20 %, fie prin CSEO (concentration sans effet observé) numita si NOEC (no observed effect concentration), care este prima concentratie fara efect observabil sau LOEC (lowest observed effect concentration ) prima concentratie cu efect vizibil. Aceste 2 valori, NOEC si LOEC depind direct de gama de concentratii alese de experimentator in efectuarea biotestului iar rezultatele pot fi mai putin reproductibile. Numeroase soft-uri permit in general calculul pentru CE50 , dar aceasta valoare poate fi calculata pe simplu pe curba concentratie-raspuns.
Cu cat concentratia eficienta CE50, respectiv CL50 sau CI50 este mai scazuta, cu atat esantionul este mai toxic.
Cercetarile noastre se focalizeaza in acest moment cu prioritate pe identificarea agentilor cauzali, incluzand contaminanti al caror risc si periculozitate nu poate fi determinata prin testele actuale, pe mecanismele fiziologice si mai ales pe estimarea dozelor mici de factori de risc si pe aprecierea efectelor cumulative si de expunere combinata la factori de risc, dar si la efectul de lunga durata. Eritrocitele nucleate de pesti si batracieni, alaturi de celulele hepatice, pot fi considerate pe de o parte, adevarati biosenzori celulari pentru studiul ecotoxicologic al amestecurilor complexe de poluanti, iar pe de altǎ parte, un sistem alternativ pentru monitorizarea ecologicǎ a mediului acvatic, in perfecta armonizare cu legislatia in vigoare. Aceste teste vor putea asigura pe de o parte bio-supravegherea mediului acvatic pentru detectarea gradului de poluare, dar in acelasi timp si aprecierea calitatii produsului piscicol deoarece populatia globului nu mai este astazi indiferenta la ceea ce consuma, iar alimentatia "techno" devine din ce in ce mai putin apreciata daca nu chiar refuzata, in favoarea a tot ce este bio sanatos si proaspat
Bibliografie:
Argese E., Betiol C., Agnoli F., Zambon A., Mazzola M. A., Volpi-Ghirardi A., Assessment of chloroaniline toxicity by the submitochondrial particle assay, Environ. Toxicol. Chem., 20, 826- 832, 2001
Baeumner A. J., Biosensors for environmental pollutants and food contaminants, Anal Bioanal. Chem ., 377 , 434-445, 2003
Blondin, G.A., Knobeloch, L.M., Read, H.W., Harkin, J.M., Mammalian mitochondria as in vitro monitors of water quality. Bull.Environ.Contam.Toxicol., 38, 467-474, 1987
Bratosin D., Estaquier J., Slomianny C., Tissier J-P, Quatannes B., Bulai T., Mitrofan L., Marinescu Al., Trandaburu I., Ameisen J-C, Montreuil J., On the evolution of erythrocyte programmed cell death: apoptosis of Rana esculenta nucleated red blood cells involves cysteine proteinase activation and mitochondrion permeabilization, Biochimie, 86, 3, 183-193,
Bratosin D., Estaquier J., Petit F., Arnoult D., Quatannens B., Tissier J-P, Slomianny C., Sartiaux C., Alonso C., Huar J.J., Montreuil J., Ameisen J.C., Programed cell death in mature erytrocytes: a model for investigating death effector pathways operating in the absence of mitochondria, Cell Death and Differentiation, 8 , 1143-1156, 2001
Cocker J., Mason H.J., Garfitt S.J., Jones K., Biological monitoring of exposure to organophosphate pesticides, Toxicology Letters, 134, 97-103, 2002
Fenske C., Daeschlein G., Gunther B., Knauer A., Rudolph P., Schwahn C., Adrian V., Woedtke Th., Rossberg H., Julich W-D., Kramer A., Comparison of different biological methods for the assessment of ecotoxicological risks, Int. J. Hyg. Environ. Health, 209, 275-284, 2006
Flammarion P., Fortier V., Migeon B., Morfin P., Garric J., Cytocrome P 450 1A induction in gudgeon ( Gobio gobio): laboratory and field studies. Biomarkers, 4, 59-71, 1999
Flammarion, P., Garric, J., Cyprinds EROD activities in low contaminated rivers: a relevant statistical approach to estimate reference levels for EROD biomarker? Chemosphere, 35, 2375-2388, 1997
Gauthier L., Tardy E., Mouchet F., Marty J., Biomonitoring of the genotoxic potential (micronucleus assay) and detoxifying activity (EROD induction) in the River Dadou (France), using the amphibian Xenopus laevis, Science of the Total Environment, 323, 47-61, 2004
Guenguerich F.J., Gunsalus F.P., Johnson I.C., Loper E.F., Sato J.C., Waterman M.R., Flammarion P., Garric J., A statistical approach for classifying the extent of EROD induction of fish sampled in clean and contaminated waters.Water Res.,33, 2683-2689, 1999
Laberge, D., Chartrand, J., Rouillon, R. And Carpentier, R., In vitro phytoxicity screenig test using immobilized spinach thylakoids. Environ.Toxicol.Chem. 1999, 18, 2851-2858
Keddy C.J., Greene J.C., Bonnell M.A., Review of whole-organism bioassays: soil, freshwater sediment, and freshwater assessment in Canada, 21-51,
Knopperld L.D., Mineau P., Mc Namee J. P., Lean D. R. S., Use of Comet and Micronucleus Assays to Measure Genotoxicity in Meadow Voles (Microtus pennsylvanicus) Living in Golf Course Ecosystems Exposed to Pesticides, Ecotoxicology, 14, 323-335, 2005
Krőger S., Low R.J., Biosensors for marine applications. We all need the sea, but does the sea need biosensors?, Biosensors and Bioelectronics, 20, 1903 -1913, 2005
Laberge, D., Chartrand, J., Rouillon, R. And Carpentier, R., In vitro phytoxicity screenig test using immobilized spinach thylakoids. Environ.Toxicol.Chem.,18, 2851-2858, 1999
Machala M., Duek L., Hilscherova K., Kubinova R., Jurajda P., Nea J., Ulrich R., Gelnar M., Monitors of water quality, Bull.Environ.Contam.Toxicol. 38, 467-474, 1987
Maria V.L., Correia A.C., Santos M.A.., Anguilla anguilla L. liver EROD induction and genotoxic responses after retene exposure, Ecotoxicology and Environmental Safety, 61 230-238, 2005
Mason H.J., Lewis P., Intra-individual variation in plasma and erythrocyte cholinesterase activities and the monitoring of uptake of organophosphorus pesticides, J. Soc. Occup. Med, 39, 121-124, 1989
Mason H.J., Sams C., Stevenson A.J. Rawbone R., Rates of spontaneous reactivation of acetylcholinesterase in human erythrocytes after inhibition of pesticides, Human Exp. Toxicol., 19, 511-516
Nebert D.W., Nelson D.R., Coon, Estabrook R.W., Feyereisen R., Furji-Kuriyama Y., Gonzalez F.J., Guenguerich F.P., Gunsalus I.C., Johnson E.F., Loper J.C., Sato R., Waterman M.R., Waxmann D.J., The P 450 superfamily; update of new sequences, gene mapping and recommended nomenclature. DNA Cell Biol., 10,1-14, 1991
Machala M., Duek L., Hilscherova K., Kubinova R., Jurajda P., Nea J., Ulrich R., Gelnar M., Studnikova Z., Holoubek, I., Determination and multivariate statistical analysis of biochemical responses to environmental contaminants in feral freshwater fish Leuciscus cephalus L. Environ.Toxicol.Chem., 20, 1141-1148, 2001
Sturm A., Cravedi J.P., Perdu E., Baradat M., Segner H., Effects of prochloraz and nonylphenol diethoxylate on hepatic biotransformation enzymes in trout: a comparative in vitro/in vivo-assessment using cultured hepatocytes, Aquatic Toxicology 53, 229-245, 2001
Truhaut R., Ecotoxicology: objectives, principles and perspectives. Ecotox. Envir. Saf.
Union europeenne, directive 2000/60/CE du Parlament Europeen et du Conseil du 23 octobre 2000 instituant un cadre politique communautaire dans le domaine de l'eau. J.Off.Com.Eur.2000, 22 Dec.L327/1-72
Van der Oost, R., Vindimian, E., Van den Brink, P.J., Satumalay, K., Heida, H., Vermeulen, N., Biomonitoring aquatic pollution with feral eel (Anguilla anguilla): III. Statistical analyses of relationships between cantaminant exposure and biomarkers. Aquatic Toxicol. 1997, 39:45-75.
Vindimian E., Garric J., Freshwater fish cytochrome P450 dependent enzymatic activities: a chemical pollution indicator, Ecotoxicol. Environ. Saf., 18, 277-285, 1989
Vindimian, E., Namour, P., Migeon, B. and Garric, J., In situ-pollution-induced cytochrome P 450 ativity of freshwater fish:Barbus barbus, Leuciscus cephalus and Chondrostoma nasus. Aquatic Toxicol. 1991,21:255-266.
Vindimian, E., Namour, P., Munoz, J.F., Grill, J.J., Migeon, B. and Garric, J., ethoxyresorufin-O-deethylase induction in fish from a watershed exposed to non point source pollution of agricultural origin. Wat.Res.1993, 27:449-455
Copyright © 2024 - Toate drepturile rezervate
