Determinarea biodegradabilitatii "usoare"

DETERMINAREA BIODEGRADABILITATII "USOARE"

Partea 1. Consideratii Generale

Introducere

Sunt descrise sase metode de testare care permit trierea substantelor chimice pentru biodegradabilitate usoara in mediul apos aerob:

a)       Epuizarea Carbonului Organic Dizolvat (COD) (Metoda C4-A)

b)       Trierea modificata a OECD - Epuizarea COD (Metoda C4-B)

c)       Degajarea bioxidului de carbon (CO₂) (Testul modificat Sturm) (Metoda C4-C)

d)       Respirometrie manometrica ( Metoda C4-D)

e)       Flacon inchis (Metoda C4-E)

f)        MITI (Ministerul Comertului si Industriei Internationale - Japonia)

(Metoda C4-F)

Consideratiile generale si comune fata de cele sase teste sunt prezentate in Partea I a metodei. Problemele specifice metodelor individuale sunt prezentate in partile II - VII. Anexele contin definitiile, formulele si materialul orientativ.

Un exercitiu de intercomparare OECD, efectuat in 1988 a aratat ca metodele dau rezultate compatibile. Totusi, in functie de caracteristicile fizice ale substantei ce urmeaza a fi testata, poate fi preferata o metoda sau alta.

ALEGEREA METODEI ADECVATE

Pentru a alege cea mai adecvata metoda, sunt necesare informatiile legate de solubilitatea substantei chimice, presiunea de vapori si caracteristicile de adsorbtie. Structura chimica sau formula trebuie cunoscute pentru a calcula valorile teoretice si /sau verifica valorile determinate ale parametrilor, de exemplu, ThOD, ThCO₂, COD, TOC, CCO (a se vedea Anexa I si II).

Substantele chimice de testat care sunt solubile in apa pana la cel putin 100 mg/l pot fi estimate prin toate metodele, cu conditia ca ele sa fie nevolatile si

neadsorbabile.

Pentru acele substante chimice care sunt greu solubile in apa, volatile sau adsorbabile, metodele adecvate sunt indicate in tabelul 1 si descrise in Anexa III. Substantele chimice cu o volatilitate moderata pot fi testate prin metoda epuizarii COD, daca exista destul spatiu pentru gaz in vasele de testare (care trebuie sa fie astupate adecvat). In acest caz, trebuie sa se asigure un control abiotic care sa permita determinarea oricarei pierderi fizice.

Tabel 1: Aplicabilitatea metodelor de testare

Sunt necesare informatii legate de puritatea sau proportiile relative ale componentelor majore ale compusului de testat pentru a interpreta rezultatele obtinute, in special cand rezultatele sunt scazute sau marginale.

Informatiile legate de toxicitatea substantelor chimice de testat fata de bacterii (Anexa IV) pot fi foarte folositoare pentru alegerea concentratiilor de testat si pot fi esentiale pentru interpetarea corecta a valorilor scazute de biodegradare.

1.3.SUBSTANTE DE REFERINTA

Pentru a verifica metoda, se utilizeaza un vas ce contine substantele chimice de referinta care intrunesc criteriile pentru biodegradabilitate usoara in paralel cu testele propriu-zise.

Substantele chimice adecvate sunt anilina (proaspat distilata), acetatul de sodiu si benzoatul de sodiu. Aceste substante chimice de referinta se degradeaza in aceste metode chiar si cand nu se adauga deliberat inocul.

S-a sugerat faptul ca trebuie sa se caute o substanta chimica de referinta usor degradabila, dar care necesita adaugarea unui inocul. S-a propus ftalatul acid de potasiu, dar este nevoie de obtinerea mai multor dovezi in cazul acestei substante inainte ca ea sa fie acceptata ca substanta de referinta.

La testele respirometrice, compusii care contin azot pot afecta absobtia oxigenului din cauza nitrificarii (a se vedea anexele II si V).

1.4. PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE

O solutie, sau suspensie, a substantei de testat intr-un mediu mineral este inoculata si incubata in conditii aerobe la intuneric sau lumina difuza. Cantitatea de COD din solutia de testat datorata inoculului trebuie sa fie mentinuta la valori cat mai mici posibile in comparatie cu cantitatea de COD datorata substantei de testat. Toleranta se face pentru activitatea endogena a inoculului prin testarea in paralel a unui martor, care contine inocul, dar nu si substanta de testat, desi activitatea endogena a celulelor in prezenta substantei nu se va potrivi exact cu cea a controlului endogen. O substanta de referinta este testata in paralel pentru a controla procedura de operare.

In general, degradarea este urmata de determinarea parametrilor, cum ar fi COD, producerea CO₂ si absorbtia oxigenului, iar masuratorile se fac la intervale destul de frecvente pentru a permite identificarea inceperii si terminarii biodegradarii. Cu ajutorul respirometrelor automate masurarea este continua. COD se masoara cateodata suplimentar fata de un alt parametru, dar acest lucru se face in mod obisnuit numai la inceputul si sfarsitul testarii. De asemenea, se poate folosi analiza chimica specifica

pentru a estima degradarea primara a substantei de testat si pentu a determina concentratia substantelor intermediare formate (obligatoriu in testul MITI).

In mod normal testul dureaza 28 zile. Testele se pot totusi termina inainte de 28 zile, adica de indata ce curba biodegradarii a atins un platou pentru cel putin 3 determinari. Testele se pot de asemenea prelungi peste 28 zile, cand curba arata ca biodegradarea a inceput, dar ca platoul nu a fost atins in a 28-a zi.

1.5. CRITERII DE CALITATE

1.5.1. Reproductibilitate

Din cauza naturii biodegradarii si a culturilor bacteriene mixte folosite ca inocul, determinarile trebuie facute cel putin in duplicat.

Experienta spune ca, cu cat este mai mare concentratia de microorganisme adaugate initial in mediul de testare, cu atat mai mici vor fi variatiile intre replici. Testarile de intercomparare de asemenea au aratat ca pot fi mari variatii intre rezultatele obtinute de diferite laboratoare, dar s-a obtinut in mod normal o concluzie comuna buna in cazul compusilor usor biodegradabili.

1.5.2. Validarea testului

Testul este considerat validat daca diferenta extremelor valorilor repetate ale indepartarii substantei chimice de proba la platou, la sfarsitul testului sau la inceputul ferestrei de 10 zile, dupa cum este cazul, este mai mica de 20% si daca degradarea procentuala a substantei de referinta a atins nivelul de biodegradabilitate usoara in 14 zile. Daca nu este intrunita vreuna din aceste conditii testul trebuie repetat.

Din cauza astringentei metodelor, valorile scazute nu sugereaza in mod necesar ca substanta de testat nu este biodegradabila in conditiile de mediu, ci indica necesitatea analizarii pentru a stabili biodegradabilitatea.

Daca intr-un test de toxicitate, care contine atat substanta de testat, cat si o substanta chimica de referinta, are loc mai putin de 35% degradare (bazat pe COD) sau mai putin de 25% (bazat pe ThOD sau ThCO₂) in 14 zile, se poate presupune ca substantele chimice de testat sunt inhibitoare (vezi si Anexa IV). Seriile de testare trebuie repetate, daca este posibil folosind o concentratie mai scazuta a substantei de testat si/sau o concentratie mai ridicata a inoculului, dar nu mai mult de 30 mg solide/litru.

1.6. PROCEDURI GENERALE SI PREPARARI

Conditiile generale ce se aplica testelor sunt rezumate in tabelul 2. Aparatura si alte conditii experimentale ce apartin in mod specific unui test individual sunt descrise mai tarziu pentru fiecare test.

Tabelul 2: Conditii de testare

1.6.1. Apa de dilutie

Se foloseste apa deionizata sau distilata fara concentratii inhibitoare de substante toxice (de exemplu, ioni de Cu ⁺⁺). Compusul de testat introdus nu trebuie sa contina mai mult de 10% carbon organic. Pentru a elimina valorile ridicate ale martorului este necesar ca apa de testare sa aiba o puritate ridicata. Contaminarea poate rezulta din impuritatile inerente si din rasinile schimbatoare de ioni si materialul lizat din bacterii si alge. Pentru fiecare serie de teste se foloseste numai o sarja de apa, verificata inainte prin analiza COD. O astfel de verificare nu este necesara pentru testul cu flacon inchis, dar consumul de oxigen al apei trebuie sa fie scazut.

1.6.2. Solutiile stoc ale componentelor minerale

Pentru a prepara solutiile de testat se prepara solutiile stoc ale componentelor minerale cu concentratiile adecvate.

Se pot folosi urmatoarele solutii stoc (cu factori de dilutie diferiti) pentru metodele: epuizare COD, triere modificata OECD, eliminare CO₂, respirometrie manometrica, testul cu flacon inchis.

Factorii de dilutie si, pentru testul MITI, prepararea specifica a mediului mineral, sunt prezentate in capitolele pentru testarile specifice.

Solutiile stoc

Se prepara urmatoarele solutii stoc folosind reactivi de calitate analitica:

(a) ortofosfat diacid de potasiu, KH₂PO₄ 8,50 g

ortofosfat acid de potasiu, K₂HPO₄ 21,75 g

ortofosfat acid de sodiu dihidrat, Na₂HPO₄ . 2H₂O 33,40 g

clorura de amoniu NH₄Cl 0,50 g

Se dizolva in apa si se completeaza pana la 1 litru. PH-ul solutiei trebuie sa fie 7,4

(b) Clorura de calciu, anhidra, CaCl₂ 27,50 g

sau Clorura de calciu dihidrat, CaCl₂.2H₂O 36,40 g

Se dizolva in apa si se completeaza pana la 1 litru.

(c) Sulfat de magneziu heptahidrat, MgSO₄ . 7H₂O 22,50 g

Se dizolva in apa si se completeaza pana la 1 litru

(d) Clorura ferica (III) hexahidrat FeCl₃ . 6H₂O 0,25 g

Se dizolva in apa si se completeaza pana la 1 litru

Nota: Pentru a evita prepararea acestei solutii imediat inainte de folosire, se adauga o picatura de HCl concentrat sau 0,4 g sare disodica a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) per litru.

1.6.3. Solutii stoc ale substantelor chimice

De exemplu, 1-10g de substanta chimica de testat sau de referinta se dizolva in apa deionizata si se completeaza pana la 1 litru, cand solubilitatea depaseste 1 g /l. Altfel, se prepara solutii stoc in mediu mineral sau se adauga substanta chimica direct in mediul mineral.

Pentru manevrarea substantelor chimice mai putin solubile, a se vedea Anexa III, dar in testul MITI (Metoda C.4 -F), nu se vor folosi nici solventi si nici agenti de emulsionare.

1.6.4. Inocul

Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: namol activ, efluenti uzati (neclorinati), ape de suprafata si soluri sau dintr-un amestec al acestora. Pentru testele de epuizare COD, eliminarea CO₂ si respirometrie manometrica, daca se foloseste namol activ, acesta trebuie luat dintr-o instalatie de tratare sau o instalatie de laborator care primesc predominant ape reziduale menajere. Inoculi din alte surse s-a constatat ca dau rezultate foarte difuze. Pentru testele de triere modificata OECD si flacon inchis, este nevoie de un inocul mai diluat, fara flocoane de namol, iar sursa preferata este un efluent secundar dintr-o instalatie de tratare a apei reziduale menajere sau o instalatie de laborator. Pentru testele MITI inoculul provine dintr-un amestec de surse si este descris in capitolul testului specific.

1.6.4.1. Inocul din namoluri active

Se preleveaza o proba de namol activ proaspat din bazinul de aerare al unei instalatii de tratare ape reziduale sau dintr-o instalatie de laborator care trateaza in special apele reziduale menajere. Se indeparteaza particulele grosiere daca este necesar, prin filtrate printr-o sita fina, apoi namolul se mentine sub aerare.

In mod alternativ, se lasa sa se depuna sau se centrifugheaza (de exemplu, la 1100 rot./min timp de 10 minute) dupa indepartarea tuturor particulelor grosiere. Se indeparteaza stratul de supernatant. Namolul poate fi spalat in mediu mineral. Se face o suspensie de namol concentrat in mediu mineral pentru a obtine o concentratie de 3-5 g materii in suspensie/l si se aereaza pana in momentul folosirii.

Namolul trebuie prelevat dintr-o instalatie conventionala care functioneaza corespunzator.

Daca namolul provine dintr-o instalatie de tratare cu viteza mare sau se presupune ca contine inhibitori, trebuie spalat. Spalarea se face astfel:

dupa o amestecare puternica, se lasa la decantat sau se centrifugheaza namolul in resuspensie, apoi se indeparteaza supernatantul;

namolul spalat se resuspenda iarasi intr-un alt volum de mediu mineral;

se repeta aceasta procedura pana cand se considera ca namolul nu mai contine substrat in exces sau inhibitori.

Inaintea efectuarii testului propriu-zis se determina concentratia de materii in suspensie din namolul netratat sau din namolul spalat.

O alternativa de obtinere a inoculului este de a omogeniza namolul activ (3-5g materii in suspensie/l) intr-un amestecator mecanic 2 minute la viteza medie; se lasa apoi timp de 30 minute, sau mai mult daca este nevoie, la decantat si se preleveaza supernatantul pentru a fi folosit ca inocul intr-un raport de 10 ml/l de mediu mineral.

1.6.4.2. Alte surse de inocul

Poate fi obtinut din efluentul secundar al unei instalatii de tratare sau al unei instalatii de laborator care se alimenteaza mai ales cu apa uzata menajera astfel:

se preleveaza o proba proaspata de apa uzata; se transporta in conditii aerobe;

se lasa sa se decanteze timp de o ora sau se filtreaza prin hartie de filtru;

se mentine efluentul decantat sau filtrat sub aerare pana in momentul folosirii.

Pana la 100 ml din acest tip de inocul se poate folosi per litru de mediu.

O alta sursa de inocul este apa de suprafata. In acest caz, se preleveaza o proba de apa de suprafata adecvata (de exemplu, rau, lac) si se mentine sub aerare pana in momentul folosirii. Daca este nevoie, se concentreaza inoculul prin filtrare sau centrifugare.

1.6.5. Preadaptarea inoculului

Inoculul poate fi preadaptat la conditiile experimentale, dar nu si la substanta chimica de testat. Preadaptarea consta in aerarea namolului activ in mediu mineral sau efluent secundar timp de 5-7 zile, la temperatura de testare. Aceasta preadaptare imbunatateste uneori precizia metodelor de testare, prin reducerea valorilor testelor martor. Nu se considera necesara preadaptarea inoculului la testul MITI.

1.6.6. Controluri abiotice

Atunci cand este necesar, se verifica posibila degradare abiotica a substantei de testat prin determinarea indepartarii COD, absorbtiei oxigenului sau eliminarii bioxidului de carbon in probe de control sterile, ce nu contin inocul.

Se sterilizeaza prin filtrare cu membrana filtranta (0,2-0,45 micrometri), sau prin adaugarea unei substante toxice adecvate intr-o concentratie corespunzatoare.

Daca se foloseste filtrarea prin membrana se iau probe aseptice pentru a mentine
sterilitatea.

Daca nu s-a realizat inainte adsorbtia substantei chimice de testat, testele care
masoara biodegradarea ca indepartare a COD, in special cele care folosesc ca
inocul namolui activ, trebuie sa includa un control abiotic care este inoculat
si otravit.

1.6.7. Numar de vase

Numarul de vase intr-un experiment tipic este dat la capitolul fiecarui test.

Se pot folosi urmatoarele tipuri de vase:

- vas-suspensie de testat (contine substanta de testat si inocul);

vas -martor cu inocul (contine numai inocul);

vas -controlul procedurii (contine substanta de referinta si inocul);

vas -controlul steril abiotic (contine substanta de testat, steril) (vezi 1.6.6.);

vas -controlul adsorbtiei (contine substanta de testat, inocul si agentul de sterilizare);

vas -controlul toxicitatii (contine substanta de testat, substanta de referinta si inocul).

Este obligatoriu ca testul propriu-zis si testul martor cu inocul sa se faca in paralel. Este de dorit sa se faca determinari si in alte vase, in paralel.

Acest lucru s-ar putea totusi, sa nu fie posibil intotdeauna. Asigurati-va ca sunt prelevate suficiente probe sau ca s-au facut suficiente citiri care sa permita estimarea indepartarii, in procente, intr-o perioada de 10 zile.

1.7. Date si evaluare

Pentru calcularea lui D_t, degradare in procente, se folosesc valorile medii ale masuratorilor duplicate ale parametrilor determinati atat in testul propriu-zis, cat si in testul martor cu inocul. Formulele matematice pentru calcularea D_t sunt prezentate in capitolele de mai jos pe teste specifice. Evolutia degradari este ilustrata grafic si se indica fereastra de 10 zile. Se calculeaza si se raporteaza indepartarea procentuala obtinuta la sfarsitul ferestrei de 10 zile si valoarea la platou, sau la sfarsitul testarii, oricare valoare este adecvata.

La testele respirometrice compusii ce contin azot pot afecta absorbtia oxigenului din cauza nitrificarii (vezi anexele II si V).

1.7.1. Masurarea degradarii prin intermediul determinarii COD

C_t-C_bt

D_t = ( 1 - -------- ) x 100

C₀-C_bo

unde:

D_t = % degradare pentru timpul t

C₀ = concentratia medie de pornire a COD in mediu de cultura inoculat ce contine substanta de testat (mg COD/l)

C_t = concentratia medie de COD in mediu de cultura inoculat ce contine substanta de testat la un timp t (mg COD/l)

C_b = concentratia medie de testat a COD in martorul cu mediu mineral inoculat
(mg COD/l)

C_bt = concentratia medie a COD in martorul cu mediu mineral inoculat la un timp t
(mg COD/l)

Toate concentratiile sunt masurate experimental.

1.7.2. Masurarea degradarii prin intermediul analizei specifice

Cand sunt disponibile date analitice specifice se calculeaza biodegradarea primara din:

S_b-S_a

D_t = -------- x 100

S_b

Unde:

D_t = % degradare la un timp t, in mod normal 28 zile

S_a = cantitatea reziduala de substanta de testat in mediu inoculat la sfarsitul testarii (mg)

S_b =cantitatea reziduala de substanta de testat in proba martor, cu apa/mediu, la care s-a adaugat numai substanta de testat (mg)

1.7.3. Degradarea abiotica

Cand se foloseste un martor steril, abiotic, se calculeaza degradarea abiotica in procente folosind formula:

C_s(0)-C_s(t)

% degradare abiotica = -------- x 100

C_a(o)

Unde:

C_a(0) = concentratia COD in martorul steril la ziua 0

C_a(t) = concentratia COD in martorul steril la ziua t

1.8. RAPORTAREA REZULTATELOR

Raportul de testare va contine urmatoarele date, daca este posibil:

substantele chimice de testat si de referinta si puritatea lor;

conditiile de testare;

inocul natura, locul de prelevare, concentratia si orice tratament de preadaptare;

proportia si natura incarcarii industriale prezente in namol, daca se cunoaste;

durata testului si temperatura;

in cazul substantelor chimice de testat greu solubile, tratamentul aplicat;

metoda de testare aplicata; pentru orice schimbare a procedeului trebuie date motivele stiintifice si explicatia;

fisa de date;

alte fenomene de inhibitie observate;

orice degradare abiotica observata;

date analitice specifice, daca sunt diponibile;

date analitice referitoare la produsele intermediare, daca exista;

graficul degradarii in procente in functie de timp pentru substantele de testat si de referinta;

faza de latenta (lag), faza de degradare, fereastra de 10 zile si panta trebuie indicate clar (Anexa I). Daca testul este conform criteriilor de validare se poate folosi pentru trasarea graficului media procentelor de degradare ale vaselor ce contin substanta de testat;

indepartarea procentuala dupa perioada de 10 zile si la platou, sau la sfarsitul testarii.