Pestii, testul de toxicitate pe termen scurt in stadiile de embrion si de alevin

PESTII, TESTUL DE TOXICITATE PE TERMEN SCURT IN STADIILE DE EMBRION SI DE ALEVIN

METODA

Aceasta metoda de testare a toxicitatii pe termen scurt reproduce Linia directoare 212 a OCDE (1998).

INTRODUCERE

Prezentul test de toxicitate pe termen scurt in stadiile de embrion si de alevin ale pestilor este un test in care sunt expuse toxicitatii stadiile de dezvoltare intre inceputul stadiului de ou fertilizat si sfarsitul stadiului de alevin. In acest test nu se administreaza hrana si testul trebuie sa se incheie cand alevinii sunt inca hraniti din sacul vitelin.

Testul urmareste sa defineasca efectele letale si, in masura limitata, efectele subletale ale produselor chimice asupra stadiilor de dezvoltare ale speciilor testate. Acest test furnizeaza informatii utile, putand (a) sa formeze o punte intre testele letale si subletale, (b) sa fie fi folosit ca test preliminar fie pentru un test de toxicitate complet in stadiile de viata timpurii, fie pentru testele de toxicitate cronica si (c) sa fie folosit la testarea speciilor acolo unde tehnicile de crestere a animalelor de experienta nu sunt suficient de avansate pentru a acoperi perioada de trecere de la alimentatia endogena la cea exogena.

Trebuie stiut ca numai testele care acopera toate stadiile din ciclul de viata a pestelui sunt in general in masura sa prezinte o estimare corecta a toxicitatii cronice la peste a produselor chimice si orice expunere care omite vreunul din stadii poate reduce sensibilitatea si astfel poate subestima toxicitatea cronica. Prin urmare, este de asteptat ca testul pe embrioni si alevini sa fie mai putin sensibil decat un test complet in stadiile de viata timpurii, in special in privinta produselor chimice puternic lipofile (log P_oa > 4) si a celor avand un mod specific de actiune toxica. Cu toate acestea, este de asteptat ca diferentele de sensibilitate intre cele doua teste sa fie mai mici in cazul produselor cu mod de actiune nespecific, narcotic (1).

Inainte de publicarea acestui test, cea mai mare parte a experientei legate de testul pe embrioni si alevini s-a obtinut cu pestii de rau Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae - nume popular pestele-zebra). Mai multe indrumari detaliate asupra modului de lucru in cazul acestei specii sunt prezentate in apendicele 1. Aceasta nu exclude folosirea altor specii in cazul carora exista experienta acumulata (tabelele IA si IB).

DEFINITII

Concentratia minima cu efect observabil (CMEO, LOEC): este cea mai scazuta concentratie testata a substantei testate la care se constata un efect semnificativ (la p < 0,05) in comparatie cu lotul martor. Cu toate acestea, toate concentratiile mai mari decat CMEO trebuie sa aiba efect nociv egal sau mai mare decat cel observat la CMEO.

Concentratia fara efecte observabile (CFEO, NOEC): este concentratia testata imediat sub valoarea CMEO.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Embrionii si alevinii sunt expusi la o serie de concentratii ale substantei testate dizolvate in apa. Protocolul de testare permite alegerea intre regimul semistatic si cel dinamic. Alegerea depinde de natura substantei testate. Testul incepe prin asezarea oualor fertilizate in incintele experimentale si se incheie imediat inainte ca sacul vitelin al fiecarei larve din fiecare incinta sa fi fost complet absorbit sau inainte de a aparea moartea prin inanitie la loturile martor. Efectele letale si subletale sunt evaluate si comparate cu valorile din loturile martor, pentru a determina concentratia minima cu efect observabil si, de aici, concentratia fara efect observabil. O alta metoda este analiza folosind un model de regresie in scopul de a estima concentratia care ar provoca o variatie procentuala data (adica CL/CE_x, unde x este definit ca % variatie).

INFORMATII DESPRE SUBSTANTA TESTATA

Ar trebui sa fie disponibile rezultatele testului de toxicitate acuta (vezi metoda C.1), de preferinta efectuat pe specii alese pentru prezentul test. Rezultatele pot fi utile in alegerea intervalului adecvat de concentratii de lucru la testul in stadiile de viata timpurii. Ar trebui cunoscute solubilitatea in apa (inclusiv solubilitatea in apa folosita la test) si presiunea vaporilor substantei testate. Este oportun sa fie disponibila o metoda analitica fiabila de cuantificare a substantei in solutii testate, a carei precizie si ale carei limite de detectie sunt cunoscute si mentionate in raport.

Informatiile asupra substantei testate care sunt utile in fixarea conditiilor de lucru cuprind: formula structurala, puritatea substantei, stabilitatea la lumina, stabilitatea in conditiile testului, pK_a, P_oa si rezultatele unui test de biodegradabilitate rapida (vezi metoda de testare C.4).

VALIDITATEA TESTULUI

Pentru ca testul sa fie valid, trebuie indeplinite urmatoarele conditii:

supravietuirea globala a oualor fertilizate in loturile martor si, unde este cazul, in incintele continand solvent, dar fara substanta testata, trebuie sa fie mai mare sau egala cu limitele definite in apendicele 2 si 3,

concentratia oxigenului dizolvat trebuie sa fie intre 60% si 100% din valoarea de saturatie in aer (VSA), pe toata durata testului,

temperatura apei nu trebuie sa difere cu mai mult de ±1,5⁰C intre incintele experimentale sau intre zile succesive in orice moment al testului si trebuie sa fie in intervalele de temperatura specificate pentru specia testata (apendicele 2 si 3).

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Incintele experimentale

Pot fi folosite orice recipiente de sticla sau din alt material chimic inert. Dimensiunile recipientelor trebuie sa fie suficient de mari pentru a permite respectarea ratei de incarcare (vezi pct. 1.7.1.2). Se recomanda pozitionarea aleatoare a incintelor in laborator. La dispunerea incintelor, o schema de randomizare a blocurilor de incinte, fiecare tratament fiind reprezentat in fiecare bloc, este preferabila unei scheme de randomizare integrala a incintelor, daca in laborator exista efecte sistematice care pot fi controlate folosind gruparea incintelor. Gruparea in blocuri, daca se foloseste, trebuie sa fie luata in considerare in analiza ulterioara a rezultatelor. Incintele experimentale trebuie protejate de orice perturbare nedorita.

Alegerea speciilor de pesti

Speciile de pesti recomandate sunt prezentate in tabelul 1A. Aceasta nu exclude folosirea altor specii (exemple sunt prezentate in tabelul 1B), dar modul de lucru trebuie adaptat pentru a asigura conditii corespunzatoare. In acest caz, justificarea alegerii speciei si a metodei experimentale trebuie specificata in raport.

Ingrijirea pestilor reproducatori

Detalii despre ingrijirea populatiei de pesti reproducatori in conditii satisfacatoare se gasesc in Linia directoare 210 a OCDE[1] si in referintele bibliografice (2) (3) (4) (5) (6).

Manipularea embrionilor si larvelor

Embrionii si larvele pot fi puse, in interiorul cuvei principale, in recipiente mai mici, cu laturile sau extremitatile din plasa, pentru a permite curgerea solutiei prin recipient. Curgerea neturbulenta prin aceste recipiente mici poate fi indusa prin atasarea lor la un brat mobil, care deplaseaza vertical recipientele, dar asa incat sa mentina organismele imersate; se poate folosi de asemenea un sistem sifon . Ouale fertilizate de salmonide pot fi puse pe suporturi sau site cu ochiul suficient de mare pentru a permite larvelor sa traverseze dupa eclozare. Folosirea pipetelor Pasteur este oportuna pentru indepartarea embrionilor si a larvelor in testele semistatice cu schimbarea zilnica si completa a apei (vezi pct. 1.6.6).

Cand au fost folosite recipiente, site sau plase pentru a pastra ouale in cuva principala, acestea trebuie indepartate dupa eclozarea larvelor¹, cu exceptia plaselor care sunt pastrate pentru a impiedica pestii sa scape. Daca este necesar sa se transfere larvele, acestea nu trebuie expuse la aer si nu trebuie folosite minciocuri pentru a scoate pestii din recipientele continand ouale (aceste precautii nu sunt necesare in cazul speciilor mai putin fragile, cum este crapul). Momentul transferului variaza in functie de specie si transferul nu este intotdeauna necesar. In regim semistatic se pot folosi pahare de laborator sau vase cu inaltimea redusa si, daca este necesar, echipate cu o sita la mica distanta de fundul paharului. Daca volumul acestor recipiente este suficient pentru a respecta cerintele de incarcare (vezi 1.7.1.2) nu este necesar transferul embrionilor si larvelor.

Apa

Este corespunzatoare pentru test orice apa care respecta caracteristicile chimice ale unei ape de diluare enumerate in apendicele 4 si in care supravietuirea loturilor martor din specia testata este cel putin la fel de buna ca aceea prezentata in apendicele 2 si 3. Apa trebuie sa isi mentina calitatea constanta pe durata testului. pH-ul trebuie sa ramana in intervalul de ±0,5 unitati. Pentru ca apa de diluare sa nu influenteze in mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin complexare cu substanta testata) sau sa afecteze negativ comportamentul pestilor reproducatori, trebuie luate probe la intervale egale pentru analiza. Acolo unde se cunoaste calitatea relativ constanta a apei de diluare, se masoara, de exemplu, la interval de trei luni continutul in metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd si Ni), anioni si cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl si SO₄), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale si pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide in suspensie. Daca s-a demonstrat ca apa are calitate constanta pe o perioada de cel putin un an, analizele se pot efectua la intervale mai mari (de exemplu la fiecare sase luni).

Solutiile de lucru

Solutiile de lucru de concentratii date se prepara prin diluarea unei solutii de baza.

Solutia de baza se prepara de preferinta prin simpla amestecare sau agitare a substantei testate in apa de diluare, folosind mijloace mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru obtinerea unei solutii de baza cu o concentratie corespunzatoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate). Folosirea solventilor sau a agentilor de dispersie trebuie evitata pe cat posibil; totusi, in unele cazuri, astfel de compusi pot fi necesari pentru a produce o solutie de baza cu o concentratie corespunzatoare. Exemple de solventi adecvati sunt acetona, etanolul, metanolul, dimetilsulfoxidul, dimetilformamida si trietilenglicolul. Exemple de agenti de dispersie adecvati sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01% si HCO-40. Folosirea compusilor usor biodegradabili (de exemplu acetona) si/sau a compusilor foarte volatili trebuie sa se faca atent, deoarece acestia pot antrena proliferarea bacteriana in testele cu regim dinamic. Cand se foloseste un agent de dispersie, acesta trebuie, in demonstratia pe un lot martor tratat numai cu solventul, sa nu provoace efecte semnificative asupra supravietuirii si nici efecte adverse vizibile asupra stadiilor de viata timpurii.

La testele in regim semistatic, pot fi adoptate doua moduri de lucru diferite: fie (i) se prepara solutii de lucru noi in recipiente curate, iar ouale si larvele sunt transferate cu grija in noile recipiente, intr-un volum mic din vechea solutie evitand expunerea la aer fie (ii) organismele sunt pastrate in recipientele initiale in timp ce o fractiune (cel putin trei sferturi) din apa de testare este schimbata. Frecventa schimbarii apei depinde de stabilitatea substantei testate, dar se recomanda schimbarea zilnica. Daca testele de stabilitate preliminare (vezi pct. 1.4) arata o instabilitate a concentratiei substantei testate (adica in afara intervalului de 80 - 120% din concentratia nominala sau sub 80% din concentratia masurata initial) pe parcursul schimbarii apei, trebuie luata in considerare folosirea unui test in regim dinamic. In oricare dintre cazuri, trebuie evitata stresarea larvelor in timpul operatiunii de schimbare a apei.

La testele in regim dinamic este necesar un sistem care sa dozeze si sa dilueze continuu solutia de baza a substantei testate (de exemplu pompa dozatoare, diluator proportional, sistem de saturatie) pentru a asigura seria concentratiilor din incintele experimentale. Debitele solutiilor de baza si ale apei de diluare trebuie verificate la intervale definite, de preferinta zilnic, pe durata testului si trebuie sa nu varieze cu mai mult de 10% pe parcursul intregului test. Un debit echivalent cu cel putin cinci volume de incinta in 24 de ore s-a dovedit adecvat (2).

MODUL DE LUCRU

Informatii utile despre desfasurarea testelor pe embrioni de peste si alevini sunt disponibile in literatura, unele exemple fiind incluse in referintele bibliografice din prezentul text (7) (8) (9).

Conditiile de expunere

Durata

Testul este recomandabil sa inceapa in urmatoarele 30 de minute dupa fertilizarea oualor. Embrionii sunt imersati in solutia testata inainte sau cat de curand dupa inceperea fazei de segmentare a blastodiscului si in orice caz inainte de debutul fazei de gastrula. In cazul oualor obtinute de la furnizori comerciali, s-ar putea sa nu fie posibila inceperea testului imediat dupa fertilizare. Deoarece amanarea inceperii testului poate influenta puternic sensibilitatea acestuia, testul trebuie initiat in urmatoarele opt ore dupa fertilizare. Deoarece larvele nu sunt hranite pe durata expunerii, testul trebuie sa se incheie imediat inainte ca sacul vitelin al fiecarei larve din fiecare incinta sa fi fost complet absorbit sau inainte de a aparea moartea prin inanitie la loturile martor. Durata depinde de specia folosita. Cateva durate recomandate sunt prezentate in apendicele 2 si 3.

Incarcarea

Numarul de oua fertilizate la inceputul testului trebuie sa fie suficient pentru a indeplini conditiile statistice. Ele trebuie distribuite aleator intre tratamente si trebuie folosite la fiecare concentratie cel putin 30 de oua, impartite in loturi egale (sau cat mai uniforme numeric, deoarece poate fi dificil sa se obtina loturi egale cand se folosesc unele specii) in cel putin trei incinte identice. Rata de incarcare (biomasa pe volum de solutie de lucru) trebuie sa fie suficient de scazuta pentru ca o concentratie a oxigenului dizolvat de minimum 60% VSA sa se poata mentine fara aerare. La testele in regim dinamic a fost recomandata (2) o rata de incarcare nedepasind 0,5 g/l in 24 de ore si nedepasind 5 g/l de solutie in orice moment.

Lumina si temperatura

Perioada de expunere la lumina si temperatura apei trebuie sa fie adecvate pentru specia testata (apendicele 2 si 3). In scopul monitorizarii temperaturii, poate fi adecvata folosirea unui recipient martor suplimentar.

Concentratiile de lucru

In mod normal, sunt necesare cinci valori de concentratii ale substantei testate, aflate in progresie geometrica cu o ratie care sa nu depaseasca 3,2. La alegerea intervalului de concentratii trebuie luata in considerare curba reprezentand CL₅₀ in functie de expunere, rezultata din studiul de toxicitate acuta. Folosirea a mai putin de cinci concentratii, de exemplu in testele la valori limita, si un interval mai ingust se pot dovedi adecvate in unele cazuri. Trebuie justificata folosirea a mai putin de cinci concentratii. Nu este necesara testarea concentratiilor mai ridicate fie de CL₅₀ la 96 de ore, fie mai ridicate de 100 mg/l (care valoare este mai scazuta dintre acestea) Concentratia maxima testata nu trebuie sa depaseasca limita de solubilitate a substantei in apa.

Cand se foloseste un agent de dispersie la prepararea solutiilor (vezi pct. 1.6.6), concentratia finala a acestuia in recipiente trebuie sa nu depaseasca
0,1 ml/l si este de preferat sa fie aceeasi in toate recipientele.

Loturile martor

In paralel cu loturile tratate trebuie sa fie studiate si loturile dintr-o incinta cu apa de diluare (cu dublura, daca este cazul) si, daca prezinta relevanta, dintr-o incinta cu agent de dispersie (cu dublura, daca este cazul).

Frecventa masuratorilor si a determinarilor analitice

Pe durata testului concentratiile substantei testate se determina cu regularitate.

La testele in regim semistatic in care concentratia substantei testate este de asteptat sa ramana in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala (adica in intervalul 80 - 120%; vezi pct. 1.4 si 1.6.6), se recomanda ca, minimal, concentratia cea mai ridicata si cea mai scazuta sa fie analizate imediat dupa preparare si la schimbarea apei de cel putin trei ori, la intervale egale pe durata testului (adica analizele trebuie efectuate pe o proba din aceeasi solutie, o data cand este proaspat preparata si o data inainte de schimbarea apei).

La testele in care concentratiile nu este de asteptat sa ramana in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala (pe baza datelor referitoare la stabilitatea substantei), trebuie analizate toate concentratiile imediat dupa preparare si imediat inainte de schimbarea apei, dar urmand aceeasi metoda (adica de cel putin trei ori la intervale egale pe durata testului. Determinarea concentratiilor substantei testate inainte de schimbarea apei este suficient sa fie facuta numai la un singur recipient la fiecare concentratie. Determinarile trebuie sa nu fie facute la intervale mai lungi de sapte zile. Se recomanda ca rezultatele sa fie fundamentate pe concentratii masurate. Cu toate acestea, atunci cand, in mod demonstrabil, concentratia substantei testate in solutie a fost mentinuta pe parcursul intregului test in intervalul ±20% fata de concentratia nominala sau concentratia masurata initial, rezultatele pot fi fundamentate pe valorile nominale sau masurate initial.

La testele in regim dinamic este adecvat un sistem de prelevare a probelor similar cu acela prescris pentru regimul semistatic (dar masurarea solutiilor "vechi" nu se aplica in acest caz). Cu toate acestea, daca durata testului este mai mare de sapte zile, este recomandabila cresterea numarului de prelevari in prima saptamana (de exemplu trei seturi de masuratori) pentru a se asigura stabilitatea concentratiilor.

Se poate dovedi necesara centrifugarea probelor sau filtrarea lor (de exemplu cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm). Cu toate acestea, deoarece se pare ca nici centrifugarea nici filtrarea nu separa intotdeauna fractia non-biodisponibila a substantei testate de fractiunea biodisponibila, se poate dovedi inutila supunerea probelor la aceste tratamente.

In timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul si temperatura se masoara in toate bazinele. Duritatea totala, si salinitatea (daca are relevanta) se masoara in incintele martor si in incinta cu cea mai ridicata concentratie. Minimal, oxigenul dizolvat si salinitatea (daca are relevanta) se masoara de trei ori (la inceputul, la jumatatea si la sfarsitul testului). In testele in regim semistatic, se recomanda ca oxigenul dizolvat sa se masoare mai frecvent, de preferinta inainte si dupa schimbarea apei sau cel putin o data pe saptamana. pH-ul trebuie masurat la inceputul si la sfarsitul fiecarei schimbari a apei la testele in regim semistatic si cel putin saptamanal la testele in regim dinamic. Duritatea trebuie masurata o data la fiecare test. Temperatura se masoara zilnic si este de preferat sa fie monitorizata continuu cel putin intr-una din incinte.

Observatiile

Stadiul dezvoltarii embrionare

Stadiul embrionar (adica stadiul de gastrula) la inceputul expunerii la substanta testata trebuie verificat cat mai exact posibil. Aceasta se poate face folosind un esantion reprezentativ de oua pastrate corespunzator si curatate pana devin translucide. Pentru descrierea si ilustrarea stadiilor embrionare se poate consulta si literatura (2) (5) (10) (11).

Eclozarea si supravietuirea

Observatiile referitoare la eclozare si supravietuire trebuie sa fie facute cel putin o data pe zi si numarul oualor eclozate si al supravietuitorilor trebuie inregistrat. La inceputul testului este de dorit ca observatiile sa fie mai frecvente (de exemplu la fiecare 30 de minute in primele trei ore), deoarece in unele cazuri timpul de supravietuire este mai relevant decat numarul deceselor (de exemplu cand exista efecte toxice acute). Embrionii si larvele moarte trebuie indepartate imediat ce sunt observate, fiindca se pot descompune rapid. La indepartarea exemplarelor moarte trebuie sa se manifeste o grija extrema pentru a nu rani sau leza ouale/larvele din vecinatate, acestea fiind extrem de delicate si de sensibile. Simptomele care indica moartea organismului variaza in functie de stadiul de viata:

pentru oua: in special in stadiile timpurii, o pierdere accentuata a transluciditatii si schimbarea coloratiei, provocata de coagularea si/sau precipitarea proteinelor, conducand la un aspect alb-opac;

pentru embrioni: absenta miscarilor corpului si/sau absenta batailor inimii si/sau decolorarea opaca la speciile ai caror embrioni sunt in mod normal translucizi;

pentru larve: imobilitatea si/sau absenta miscarilor respiratorii si/sau absenta batailor inimii si/sau coloratia alb-opaca a sistemului nervos central si/sau absenta reactiei la stimuli mecanici.

Aspectul anormal

Numarul larvelor prezentand anomalii ale formei corpului si/sau pigmentare, precum si stadiul absorbtiei sacului vitelin trebuie inregistrate la intervale adecvate, in functie de durata testului si de natura anomaliei in cauza. Trebuie spus ca embrioni si larve anormale apar in mod natural si numarul lor poate reprezenta cateva procente in loturile martor ale unor specii. Animalele anormale nu trebuie indepartate din recipiente decat atunci cand mor.

Comportamentul anormal

Anomaliile, de exemplu hiperventilarea, inotul necoordonat si imobilitatea neobisnuita, trebuie inregistrate la intervale adecvate, in functie de durata testului. Aceste efecte, desi dificil de cuantificat, pot, atunci cand sunt tinute sub observatie, sa ajute la interpretarea datelor privind mortalitatea, adica pot furniza informatii despre modul de actiune toxica a substantei.

Lungimea

La sfarsitul testului se recomanda masurarea lungimilor individuale; poate fi folosita oricare din lungimile standard, pana la scobitura caudala sau totala. Cu toate acestea, daca se constata o putrefactie sau o rosatura la inotatoarea caudala, se folosesc lungimile standard. In general, intr-un test efectuat corect, coeficientul de variatie a lungimii in lotul martor este ≤ 20%.

Greutatea

La incheierea testului poate fi masurata greutatea corporala individuala; greutatea organismului uscat (24 de ore la 60⁰C) este preferata greutatii in vivo (peste zvantat). In general, intr-un test efectuat corect, coeficientul de variatie a lungimii in lotul martor este ≤ 20%.

Aceste observatii pun la dispozitia analizei statistice totalitatea datelor urmatoare sau unele dintre acestea:

mortalitatea cumulata,

numarul larvelor sanatoase la incheierea testului,

momentele de inceput si sfarsit al eclozarii (adica 90% oua eclozate in fiecare incinta de la acelasi nivel al concentratiei),

numarul larvelor eclozate in fiecare zi,

lungimea (si greutatea) animalelor supravietuitoare la incheierea testului,

numarul larvelor cu diformitati sau cu aspect anormal,

numarul larvelor prezentand comportament anormal.

REZULTATELE SI RAPORTAREA

PRELUCRAREA REZULTATELOR

Se recomanda implicarea unui statistician atat in structurarea cat si in analiza testului, deoarece aceasta metoda de testare permite variatii considerabile in modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, variatii in numarul de incinte experimentale si de concentratii folosite, in numarul initial de oua fertilizate si in parametrii masurati. Luand in considerare optiunile disponibile in structurarea testului, nu sunt prezentate aici indrumarile specifice referitoare la metoda statistica.

Daca urmeaza sa fie estimate DMEO/DFEO, este necesar ca variatiile sa fie estimate in cadrul fiecarui set de incinte de la aceeasi concentratie, folosind analiza de variatie sau metodele tabelelor de contingenta. Metoda Dunnett se poate dovedi folositoare (12) (13). pentru a realiza o comparatie multipla intre rezultatele obtinute la concentratii individuale si rezultatele obtinute in legatura cu loturile martor. De asemenea sunt disponibile si alte exemple utile (14) (15). Marimea efectului detectabil folosind analiza de varianta sau alte metode (adica puterea testului) trebuie calculata si mentionata in raport. Trebuie spus ca nu toate observatiile enumerate la pct. 1.7.5.6. sunt adecvate pentru analiza statistica de varianta. De exemplu, mortalitatea cumulata si numarul larvelor sanatoase la incheierea testului pot fi analizate folosind metode probit)

Daca urmeaza sa fie estimate CL/CE_x, una sau mai multe curbe, cum ar fi curba logistica, trebuie ajustate la datele studiate folosind o metoda precum metoda celor mai mici patrate sau metoda celor mai mici patrate neliniare. Curba (curbele) trebuie parametrizate astfel incat CL/CE_x studiate si eroarea standard respectiva sa poata fi estimate direct. Aceasta va usura mult calculul intervalului de incredere din jurul CL/CE_x. Daca nu sunt motive intemeiate sa fie preferate alte niveluri de incredere, ar trebui alese nivelurile de 95% la ambele capete ale intervalului. Este de preferat ca metoda de ajustare sa asigure un mijloc de a evalua semnificatia neajustarii. Pot fi folosite metode grafice de ajustare a curbelor. Analiza prin regresie este adecvata pentru toate observatiile enumerate la pct. 1.7.5.6.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Rezultatele se interpreteaza cu precautie atunci cand concentratiile masurate ale substantelor toxice ajung la niveluri apropiate de limitele de detectie ale metodei analitice. Rezultatele se interpreteaza de asemenea cu precautie in cazul concentratiilor mai mari decat solubilitatea in apa a substantei.

RAPORT DE TESTARE

Raportul de testare trebuie sa cuprinda urmatoarele informatii:

Substanta testata:

natura fizica si proprietatile fizico-chimice relevante,

datele de identificare chimica, inclusiv puritatea si metoda analitica de cuantificare a substantei, dupa caz.

Specia testata:

numele stiintific, susa numarul pestilor parentali (cate femele au fost folosite pentru a asigura numarul necesar de oua), sursa si metoda de colectare a oualor fertilizate si manipularea ulterioara.

Conditiile de lucru:

metoda folosita (de exemplu: regim semistatic, regim dinamic, timpul scurs de la fertilizare pana la inceperea testului, incarcare etc.),

perioada(perioadele) de expunere la lumina,

structurarea testului (de exemplu: numar de incinte si de dubluri, numar de embrioni pe incinta),

metoda de preparare a solutiilor de baza si frecventa schimbarii apei (trebuie specificat agentul de solubilizare si concentratia acestuia, daca se foloseste),

concentratiile de lucru nominale, valorile masurate, mediile lor si deviatiile lor standard in recipiente si metoda prin care au fost obtinute, precum si, daca substanta testata este solubila in apa la concentratii mai reduse decat cele testate, date care sa demonstreze ca masuratorile se refera la concentratiile substantei testate in solutie reala,

caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, temperatura, concentratia oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (daca se masoara), carbon organic total, solide in suspensie, salinitatea mediului de lucru (daca se masoara) si orice alte masuratori efectuate,

calitatea apei din recipiente: pH, duritate, temperatura si concentratia oxigenului dizolvat.

Rezultatele:

rezultatele oricaror studii preliminare referitoare la stabilitatea substantei testate,

date demonstrand ca loturile din incintele martor au indeplinit standardul de supravietuire globala acceptabila al speciei testate (apendicele 2 si 3),

rezultate despre mortalitate/supravietuire in stadiile de embrion si larva si mortalitatea/supravietuirea globala,

zilele de eclozare si numarul eclozarilor,

lungimea (si greutatea) corporala ,

incidenta si descrierea anomaliilor morfologice, daca exista,

incidenta si descrierea efectelor comportamentale, daca exista,

analiza statistica si prelucrarea datelor,

la testele analizate folosind analiza de varianta, concentratia minima cu efecte observabile (DMEO) la p = 0,05 si concentratia fara efecte observabile (DFEO) pentru fiecare raspuns evaluat, inclusiv descrierea metodelor statistice folosite si indicarea marimii efectului care poate fi detectat,

la testele analizate folosind analiza prin regresie, CL/CE_x si intervalele de incredere, precum si un grafic al modelului ajustat folosit in calcule,

explicatii pentru orice abatere de la aceasta metoda de testare.

BIBLIOGRAFIE

Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.

ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.

Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, pp. 121-173.

Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.

Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, pp. 61-71.

Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821.

Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.

Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.

Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.

Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.

Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.

Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126-134.

Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology - an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 231-236.

Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, pp. 19-28.

US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.

Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht,
280 pp.

Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.

TABEL 1A: Specii de pesti recomandate pentru testare

TABEL 1B: Exemple de alte specii de pesti bine studiate care au fost folosite

ANEXA 1

GHID PENTRU EFECTUAREA UNUI TEST DE TOXICITATE LA EMBRIONI SI ALEVINI DE PESTE ZEBRA (BRACHYDANIO RERIO)

INTRODUCERE

Pestele zebra provine de pe coasta Coromandel din India unde traieste in apele repezi. Este un peste obisnuit de acvariu din familia crapului si datele referitoare la cresterea si ingrijirea acestuia se pot gasi in cartile de specialitate privind pestii tropicali. Laale descrie biologia si utilizarea acestuia in studiul privind pestii (1).

Acest peste are rareori o lungime mai mare de 45 mm. Corpul este cilindric cu 7 - 9 dungi argintii orizontale de culoare albastru inchis. Aceste dungi ajung pana la inotatoarele caudale si anale. Spatele este de culoare verde-masliniu. Masculii sunt mai subtiri decat femelele. Femelele sunt mai argintii si abdomenul este umflat, in special inainte de depunerea icrelor.

Pestii adulti pot sa suporte fluctuatii mari de temperatura, pH si duritate a apei. Cu toate acestea, pentru a obtine pesti sanatosi care sa produca icre de buna calitate, trebuie asigurate conditii optime.

In timpul depunerii icrelor, masculii urmaresc si lovesc cu capul femelele si astfel se produce fecundarea icrelor atunci cand sunt expulzate. Icrele, care sunt transparente si nelipicioase, cad la fund unde pot fi mancate de parinti. Depunerea icrelor este influentata de lumina. Daca lumina diminetii este corespunzatoare, pestele depune icrele de obicei in primele ore din zori.

O femela poate sa produca loturi de cateva sute de icre saptamanal.

CONDITII PENTRU PESTII PARINTI, REPRODUCERE SI PRIMELE STADII DE VIATA

Se selecteaza un numar potrivit de pesti sanatosi care se pastreaza in apa corespunzatoare (de ex. anexa 4) cu cel putin doua saptamani inainte de data preconizata pentru depunerea icrelor. Este necesar ca grupul de pesti sa fie lasat sa se reproduca cel putin o data inaintea producerii lotului de icre utilizate in test. Densitatea pestelui in perioada respectiva nu trebuie sa depaseasca 1 gram de peste per litru. Schimbarile regulate de apa sau utilizarea sistemelor de purificare permit o densitate mai mare. Temperatura din acvarii se mentine la 25 ± 2^oC. Pestelui trebuie sa i se asigure o alimentatie variata, care poate sa contina, de exemplu hrana uscata specifica comercializata, Arthemia, chironomide, dafnia vii proaspat iesiti din ou, viermi albi (Enchytraeide).

In continuare, sunt prezentate doua procedee, prin care s-a obtinut in practica un lot suficient de icre fecundate, sanatoase pentru efectuarea unui test:

(i)         8 femele si 16 masculi se introduc intr-un acvariu cu 50 litri apa de dilutie, ecranat de lumina directa si se lasa cat se poate de linistiti timp de 48 ore. La fundul vasului se aseaza o tava pentru depunerea icrelor in dupa-amiaza zilei de dinaintea initierii testului. Tava pentru depunerea icrelor este alcatuita dintr-un cadru (plexiglas sau alt material potrivit) inalt de 5-7 cm, prevazut cu o plasa cu ochiuri mari, de 2-5 mm, fixata la partea superioara si o plasa fina, cu ochiuri de 10-30 μm, la partea inferioara. La plasele cu ochiuri mari ale cadrului, se ataseaza un numar de "pomi pentru depunerea icrelor" dintr-o franghie de nylon nerasucita. Dupa ce pestii au fost lasati in intuneric timp de 12 ore, se aprinde o lumina slaba care va initia depunerea icrelor. La 2-4 ore dupa depunerea icrelor, se scoate tava pentru depunerea icrelor si se colecteaza icrele. Cu tava pentru depunerea icrelor se evita mancarea icrelor de catre pesti si se faciliteaza colectarea icrelor. Este necesar ca grupul de pesti sa fi depus icre cel putin o data inaintea depunerii din care se iau icre pentru efectuarea testului.

(ii)       Un numar de 5-10 masculi si femele se adapostesc individual cu cel putin doua saptamani inaintea depunerii icrelor. Dupa 5-10 zile, abdomenele femelelor se umfla si papila genitala a acestora devine vizibila. Masculii nu au papila. Depunerea icrelor se realizeaza in acvarii de depunere a icrelor prevazute cu un fund fals din plasa (cum s-a descris anterior). Acvariul este umplut cu apa de dilutie, astfel incat, deasupra plasei apa sa fie de 5-10 cm. O femela si doi masculi se introduc in acvariu cu o zi inaintea datei preconizate pentru depunerea icrelor. Temperatura apei se creste treptat la o valoare cu un grad mai mare decat temperatura de aclimatizare. Se stinge lumina si acvariul se lasa cat se poate de linistit. Dimineata, se aprinde o lumina slaba care va initia depunerea icrelor. Dupa 2-4 ore, pestele se scoate si se colecteaza icrele. Daca sunt necesare loturi mai mari de icre decat se pot obtine de la o femela, se pot instala, in paralel, mai multe acvarii de depunere a icrelor. Prin inregistrarea rezultatului fiecarei femele inaintea testului (dimensiunea lotului si calitatea), se selecteaza pentru reproducere femelele cu cele mai bune rezultate la reproducere.

Este necesar ca icrele sa fie transferate in vasele pentru efectuarea testului cu ajutorul unor tuburi de sticla (diametrul interior de minimum 4 mm) prevazute cu un bulb de aspiratie flexibil. Cantitatea de apa care se transfera odata cu icrele trebuie sa fie cat mai mica posibila. Icrele sunt mai grele decat apa si ies pe la fundul tubului. Trebuie avut grija pentru a preveni ca icrele (si larvele) sa vina in contact cu aerul. Proba(Probele) din lot(uri) se examineaza la microscop pentru a se asigura ca nu exista anomalii in primele etape de dezvoltare a embrionului. Nu este permisa dezinfectia icrelor.

Rata mortalitatii icrelor atinge apogeul in primele 24 de ore dupa fecundare. In aceasta perioada, se intalneste adesea o mortalitate de 5-40%. Icrele degenereaza ca urmare a unei fecundari nereusite sau a dezvoltarii insuficiente a embrionului. Calitatea lotului de icre se pare ca depinde de pestele femela, deoarece unele femele produc in mod constant icre de buna calitate, iar altele niciodata. De asemenea, rata de dezvoltare a embrionului si rata de iesire din ou variaza de la un lot la altul. Icrele fecundate cu succes si larvele din sacul vitelin supravietuiesc bine, in mod normal peste 90%. La 25^oC, iesirea din ou se produce la 3-5 zile de la fertilizare si sacul vitelin se absoarbe in aproximativ 13 zile dupa fecundare.

Hisaoka si Battle au descris bine dezvoltarea embrionului (2). Datorita transparentei icrelor si larvelor dupa iesirea din ou, se poate urmari dezvoltarea pestelui si este posibila observarea malformatiilor. La aproximativ patru ore dupa depunerea icrelor, icrele nefecundate se pot distinge de cele fecundate (3). Pentru a efectua aceasta examinare, icrele si larvele se aseaza pe vase de laborator de volum mic si se studiaza la microscop.

Conditiile de desfasurare a testului, care se aplica in primele etape de viata, sunt prezentate in lista din apendicele 2. Valorile optime ale pH-ului si duritatii apei de dilutie sunt 7, 8 si respectiv 250 mg CaCO₃/l.

CALCULE SI STATISTICA

Se propune un procedeu in doua etape. Mai intai, se analizeaza statistic datele privind mortalitatea, dezvoltarea anormala si momentul iesirii din ou. Apoi, pentru acele concentratii la care nu s-au observat efecte negative asupra oricaruia din parametrii mentionati, se evalueaza statistic lungimea corpului. Aceasta abordare este recomandabila deoarece toxicul poate sa ucida selectiv pestii mai mici, sa intarzie momentul iesirii din ou si sa induca malformatii majore, obtinandu-se astfel masuratori viciate ale lungimii. In plus, pentru fiecare tratament, va exista acelasi numar de pesti ce urmeaza sa se masoare, asigurandu-se validitatea statisticii testului.

DETERMINAREA LC₅₀ SI EC₅₀

Se calculeaza procentul de icre si larve supravietuitoare si se corecteaza cu mortalitatea din probele martor conform formulei lui Abbott (4):

unde,

P = supravietuirea corectata, %

P' = supravietuirea observata la concentratiile experimentate, %

C = supravietuirea in cazul martorului

Daca este posibil, LC₅₀ se determina printr-o metoda corespunzatoare la sfarsitul testului.

Daca se doreste introducerea anomaliilor morfologice in statistica CE₅₀, se poate folosi lucrarea lui Stephan (5) pentru orientare.

ESTIMAREA CMEO SI CFEO

Un obiectiv al testului efectuat pe icre si alevini este compararea concentratiilor non-zero cu proba martor, adica determinarea CMEO. Pentru aceasta se utilizeaza multiple procedee de comparare (6) (7) (8) (9) (10).

BIBLIOGRAFIE

Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121-173.

Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.

Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173-181.

Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp. 1-333.

Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.

Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.

Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.

Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.

ANEXA 2

CONDITIILE, DURATA TESTULUI SI CRITERIILE DE SUPRAVIETUIRE PENTRU SPECIILE RECOMANDATE

ANEXA 3

CONDITIILE, DURATA TESTULUI SI CRITERIILE DE SUPRAVIETUIRE PENTRU ALTE SPECII BINE STUDIATE

ANEXA 4

CATEVA CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUTIE ADMISE