TESTUL DE CRESTERE A PUIETULUI DE PESTE

METODA

Metoda de testare a influentei toxicitatii asupra cresterii reproduce Linia directoare 215 a OCDE (2000).

INTRODUCERE

Acest test urmareste sa evalueze efectele expunerii prelungite la produse chimice asupra cresterii puietului de peste. Are la baza o metoda, elaborata si intercalibrata (1) (3) in Uniunea Europeana, de evaluare a efectelor produselor chimice asupra puietului de pastrav-curcubeu (Oncorynchus mykiss) in regim dinamic. Pot fi folosite si alte specii, daca au fost bine studiate. De exemplu, s-a castigat experienta din testele de crestere cu pestele-zebra (Danio rerio) (2) (4) (5) si medaka (Oryzias latipes) (6) (7) (8).

Vezi si Introducerea generala, partea C.

DEFINITII

Concentratia minima cu efect observabil (CMEO): este cea mai scazuta concentratie testata a substantei testate la care se constata un efect semnificativ (la p < 0,05) in comparatie cu lotul martor. Toate concentratiile mai mari decat CMEO trebuie sa aiba efect nociv egal sau mai mare decat cel observat la CMEO.

Concentratia fara efecte observabile (CFEO): este concentratia testata imediat sub valoarea CMEO.

CE_x: in aceasta metoda de testare este concentratia substantei testate care provoaca o variatie de x% in rata de crestere a pestelui in comparatie cu lotul martor.

Rata de incarcare: este greutatea pestelui pe unitatea de volum de apa.

Densitatea populatiei: este numarul de pesti pe unitatea de volum de apa.

Rata de crestere specifica individuala: exprima rata de crestere a unui individ, prin raportare la greutatea sa initiala.

Rata de crestere specifica medie a bazinului: exprima rata de crestere medie a populatiei din bazin la o concentratie data.

Rata de crestere pseudospecifica: exprima rata de crestere individuala raportata la greutatea initiala medie a populatiei din bazin.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Puietul piscicol aflat in faza de crestere exponentiala este pus, dupa ce este cantarit, in incintele experimentale si expus la o gama de concentratii subletale din substanta testata, dizolvata in apa, de preferinta in regim dinamic sau, daca nu este posibil, in conditii semistatice adecvate (regim de curgere discontinua) Durata testului este de 28 de zile. Pestii sunt hraniti zilnic. Ratia alimentara este in functie de greutatile corporale initiale si poate fi recalculata dupa 14 zile. La sfarsitul testului, pestii sunt cantariti din nou. Efectele asupra ratelor de crestere sunt analizate folosind un model de regresie, pentru a estima acea concentratie care ar avea ca efect o variatie a ratei de crestere de x%, adica a CE_x (de exemplu CE₁₀, CE₂₀ sau CE₃₀). O alta varianta este ca datele sa fie comparate cu valorile lotului martor, in scopul de a determina concentratia minima cu efecte observabile (CMEO) si, de aici, concentratia fara efecte observabile (CFEO).

INFORMATII DESPRE SUBSTANTA TESTATA

Trebuie sa fie disponibile rezultatele unui test de toxicitate acuta (vezi metoda de testare C.1), de preferinta efectuat cu speciile alese pentru acest test. Aceasta inseamna ca se cunosc solubilitatea in apa si presiunea de vapori ale substantei testate, precum si ca exista o metoda analitica fiabila si disponibila pentru cuantificarea substantei in solutii, a carei precizie si ale carei limite de detectie sunt cunoscute si specificate in raport.

Informatiile utile cuprind: formula structurala, puritatea substantei, stabilitatea in apa si la lumina, pK_a, P_oa si rezultatele testului de biodegradabilitate rapida (vezi metoda de testare C.4).

VALIDITATEA TESTULUI

Pentru ca testul sa fie valid, trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

mortalitatea in lotul (loturile) martor nu trebuie sa depaseasca 10% la sfarsitul testului,

greutatea medie a pestilor in lotul (loturile) martor trebuie sa fi crescut suficient pentru a permite detectarea variatiei minime a ratei de crestere considerata ca semnificativa. Un test de intercalibrare (3) a aratat ca in cazul pastravului-curcubeu greutatea medie a pestelui in lotul martor trebuie sa fi crescut in 28 de zile cu cel putin jumatate (adica 50%) din greutatea initiala; de exemplu, greutatea initiala: 1g/peste (=100%), greutatea finala, dupa 28 de zile: > 1,5 g/peste (> 150 %),

concentratia de oxigen dizolvat trebuie sa fi fost pe toata durata testului de cel putin 60% din valoarea de saturatie din aer (VSA),

temperatura apei trebuie sa nu difere cu mai mult de ± 1^oC intre bazine in nici un moment pe durata testului si sa fie mentinuta intr-un interval de 2^oC in intervalele de temperatura specificate pentru speciile de pesti (anexa 1).

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Aparatura:

Echipamentul obisnuit de laborator si in special urmatoarele:

(a)        pH-metru si aparat de masurare a oxigenului;

(b)        echipament pentru determinarea duritatii si alcalinitatii apei;

(c)        aparatura adecvata pentru controlul temperaturii, de preferat cu supraveghere continua;

(d)        bazine din material chimic inert si de capacitate adaptata la incarcarea si densitatea populatiei recomandate (vezi pct. 1.8.5 si anexa 1);

(e)        balanta de precizie adecvata (adica pana la ±0,5%).

Apa

In test poate fi folosita orice apa in care specia testata prezinta o rata de supravietuire si de crestere pe termen lung corespunzatoare. Trebuie sa fie de calitate constanta pe durata testului. Apa trebuie sa aiba un pH in intervalul 6,5 - 8,5, dar pe durata unui test dat trebuie sa se incadreze intr-un interval de ±0,5 unitati de pH. Se recomanda o duritate (in CaCO₃) de peste 140 mg/l. Pentru ca apa de diluare sa nu influenteze in mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin complexare cu substanta testata), trebuie luate probe la intervale egale pentru analiza. Acolo unde se cunoaste calitatea relativ constanta a apei de diluare, se masoara la interval de trei luni continutul in metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd si Ni), anioni si cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl si SO₄), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale si pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide in suspensie. Daca s-a demonstrat ca apa are calitate constanta pe o perioada de cel putin un an, analizele se pot face la intervale mai mari (de exemplu la fiecare sase luni). Cateva caracteristici chimice ale unei ape de diluare acceptabile sunt enumerate in anexa 2.

Solutiile de lucru

Solutiile de lucru de concentratii date se prepara prin diluarea unei solutii de baza.

Solutia de baza se prepara de preferinta prin simpla amestecare sau agitare a substantei testate in apa de diluare, folosind mijloace mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru obtinerea unei solutii de baza cu o concentratie corespunzatoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate).

In unele cazuri, folosirea solventilor sau a agentilor de dispersie poate fi necesara pentru a realiza solutia de baza de concentratie corespunzatoare. Exemple de solventi adecvati sunt acetona, etanolul, metanolul, dimetilsulfoxidul, dimetilformamida si trietilenglicolul. Exemple de agenti de dispersie adecvati sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01% si HCO-40. Folosirea compusilor usor biodegradabili (de exemplu acetona) si/sau a compusilor foarte volatili trebuie sa se faca atent, deoarece acestia pot antrena proliferarea bacteriana in testele cu regim dinamic. Cand se foloseste agent de dispersie, acesta trebuie, in demonstratia pe un lot martor tratat numai cu solventul, sa nu provoace efecte semnificative asupra cresterii pestilor si nici efecte adverse vizibile asupra puietului.

La testele in regim dinamic este necesar un sistem care sa distribuie si sa dilueze continuu solutia de baza a substantei testate (de exemplu pompa dozatoare, diluator proportional, sistem de saturatie) pentru a asigura seria concentratiilor din incintele experimentale. Debitele solutiilor de baza si ale apei de diluare se verifica la intervale definite, de preferinta zilnic, pe durata testului si trebuie sa nu varieze cu mai mult de 10% pe parcursul intregului test. Un test de intercalibrare (3) a demonstrat ca, in cazul pastravului-curcubeu, o frecventa a schimbarii apei de 6 litri/g de peste/ zi este acceptabila (vezi pct. 1.8.2.2).

La testele in regim semistatic (regim dinamic discontinuu), frecventa schimbarii apei depinde de stabilitatea substantei testate, dar se recomanda schimbarea zilnica. Daca testele de stabilitate preliminare (vezi pct. 1.4) arata o instabilitate a concentratiei substantei testate (adica in afara intervalului de 80 - 120% din concentratia nominala sau sub 80% din concentratia masurata initial) pe parcursul schimbarii apei, trebuie luata in considerare folosirea unui test in regim dinamic.

Alegerea speciilor

Pastravul-curcubeu (Oncorynchus mykiss) este specia recomandata pentru acest test deoarece de aceasta specie se leaga cea mai mare parte a experientei castigate in testele de intercalibrare (1) (3). Cu toate acestea, pot fi folosite si alte specii, bine studiate, dar metoda experimentala s-ar putea sa necesite adaptari, pentru a asigura conditii de testare adecvate. De exemplu, exista experienta disponibila si cu pestele-zebra (Danio rerio) (4) (5) si cu medaka (Oryzias latipes) (6) (7) (8). In acest caz, justificarea alegerii speciei si a metodei experimentale trebuie specificata in raport.

Ingrijirea pestilor

Pestii de laborator trebuie alesi din aceeasi populatie, de preferinta din aceleasi icre, care a fost ingrijita pentru cel putin doua saptamani inainte de test in conditii de calitate a apei si de expunere la lumina similare cu acelea folosite la test. Pestii trebuie hraniti cu o ratie minima zilnica reprezentand 2% din greutatea corporala, de preferinta 4%, pe intreaga durata de ingrijire si testare.

Dupa o perioada de acomodare de 48 de ore, se inregistreaza mortalitatea si se aplica urmatoarele criterii:

mortalitate mai ridicata de 10% din populatie in sapte zile: se respinge intregul lot,

mortalitate intre 5% si 10% din populatie: acomodare pentru inca sapte zile; daca mortalitatea este peste 5% in a doua perioada de sapte zile, se respinge intregul lot,

mortalitate mai scazuta de 5% din populatie in sapte zile: se accepta lotul.

Pestii nu trebuie sa primeasca tratament pentru boala in cele doua saptamani anterioare testului sau in timpul testului.

STRUCTURAREA TESTULUI

"Structurarea testului" se refera la alegerea numarului si a intervalelor de concentratii testate, la numarul de bazine pentru fiecare nivel al concentratiei si la numarul de pesti pe bazin. In mod ideal, structurarea testului ia in considerare:

(a)   obiectivul studiului;

(b)  metoda de analiza statistica urmand a fi folosita;

(c)   disponibilitatea si costul resurselor alocate.

Enuntul obiectivului ar trebui, daca este posibil, sa specifice puterea statistica la care se cere sa fie detectata marimea unei diferente date (de exemplu in rata cresterii) sau, alternativ, precizia cu care se cere estimarea CE_x (de exemplu cu x = 10, 20 sau 30 si de preferinta nu mai mic decat 10). In absenta acestor informatii, nu se poate indica in mod precis scara de desfasurare a studiului.

Este important sa se accepte ideea ca structurarea optima (care foloseste cel mai bine resursele) in raport cu o metoda de analiza statistica nu este in mod necesar optima in raport cu alta metoda. Structurarea recomandata pentru estimarea DMEO/DFEO nu va fi aceeasi cu cea recomandata pentru analiza prin regresie.

In cele mai multe cazuri, analiza de regresie este preferabila analizei de varianta, din motivele discutate de Stephan si Rogers (9). Cu toate acestea, atunci cand nu se gaseste un model de regresie corespunzator (r² < 0,9), ar trebui sa se recurga la DFEO/DMEO.

Structurarea pentru analiza de regresie

La structurarea unui test care urmeaza sa fie interpretat cu ajutorul analizei de regresie, considerentele importante sunt:

(a)        concentratiile cu efect (de exemplu CE_10,20,30) si intervalul de concentratii in care efectul substantei testate prezinta interes trebuie cu necesitate sa fie cuprinse in test. Precizia cu care pot fi facute estimarile concentratiilor cu efect va fi mai buna atunci cand concentratia cu efect este la jumatatea intervalului de concentratii testate. In alegerea concentratiilor adecvate pentru test este util un test preliminar de stabilire a intervalului;

(b)       pentru a permite o modelare statistica satisfacatoare, testul trebuie sa includa cel putin un bazin martor si alte cinci bazine la concentratii diferite. Unde este cazul, atunci cand se foloseste un agent de dispersie, se studiaza, in afara de lotul testat, un lot martor dintr-un bazin continand agentul de dispersie la concentratia maxima testata (vezi pct. 1.8.3 si 1.8.4);

(c)        se poate folosi o serie geometrica sau una logaritmica adecvata (10) (vezi anexa 3). Este de preferat seria logaritmica in definirea intervalelor intre nivelurile concentratiilor testate;

(d)       daca sunt disponibile mai mult de sase bazine, bazinele suplimentare ar trebui folosite fie la dublarea probelor, fie la distribuirea lor in intervalele de concentratii, in scopul ingustarii acestora. Ambele masuri sunt oportune in egala masura.

Structurarea pentru DFEO/DMEO folosind analiza de varianta

Ar fi de preferat sa existe bazine-dublura la fiecare concentratie, iar analiza statistica sa se faca la nivelul fiecarui bazin (11). Fara bazine-dublura nu poate fi luata in considerare variabilitatea intre bazine separat de variabilitatea de la un peste la altul. Cu toate acestea, experienta a aratat (12) ca, in cazul examinat, variabilitatea intre bazine a fost foarte scazuta comparativ cu cea din interiorul aceluiasi bazin (adica intre pesti). Prin urmare, o alternativa relativ acceptabila este efectuarea analizei statistice la nivelul fiecarui exemplar.

In mod conventional, se folosesc cel putin cinci concentratii dispuse in serie geometrica, cu o ratie care de preferinta nu depaseste 3,2.

In general, atunci cand testele se fac cu bazine-dublura, numarul bazinelor martor, si prin urmare cel al pestilor, reprezinta dublul numarului de bazine testate la fiecare concentratie, iar acesta din urma este acelasi la toate concentratiile (13) (14) (15). Dimpotriva, in absenta bazinelor-dublura, numarul pestilor din lotul martor este egal cu numarul pestilor folositi la fiecare concentratie.

Daca analiza de varianta urmeaza sa porneasca de la bazin si nu de la fiecare peste [ceea ce ar presupune fie marcarea individuala a pestilor, fie folosirea ratelor de crestere pseudospecifice (vezi pct. 2.1.2)], apare necesitatea folosirii unui numar suficient de dubluri pentru a se putea determina deviatia standard a "bazinelor cu aceeasi concentratie". Aceasta inseamna ca gradele de libertate pentru erorile din analiza de varianta trebuie sa fie de minimum 5 (11). Daca sunt dublate numai bazinele martor, exista pericolul ca variabilitatea erorilor sa fie falsificata, deoarece ea poate creste odata cu valoarea medie a ratei de crestere in cauza. Deoarece este probabil ca rata de crestere sa scada odata cu cresterea concentratiei, se poate ajunge la o variabilitate supraestimata.

MODUL DE LUCRU

Selectarea si cantarirea pestilor

Este important ca variatia in cantarirea pestilor sa fie redusa la minimum la inceputul testului. In apendicele 1 se dau intervalele corespunzatoare pentru marimea diferitelor specii recomandate in acest test. Pentru intregul lot de pesti folosit, limitele greutatilor corporale individuale la inceputul testului sunt, in mod ideal, cuprinse in intervalul de ±10% din media aritmetica a greutatilor si, in orice caz, trebuie sa nu depaseasca 25%. Se recomanda cantarirea unui sub-esantion de pesti inainte de testare, pentru a estima greutatea medie.

Pestii nu trebuie hraniti timp de 24 de ore inainte de inceperea testului. Apoi sunt alesi la intamplare. Folosind un anestezic general [de exemplu o solutie apoasa de 100 mg/l de metansulfonat de tricaina (MS 222) neutralizata prin adaugarea a doua parti bicarbonat de sodiu la o parte de MS 222], pestii sunt cantariti individual ca greutate in vivo zvantati, la precizia indicata in apendicele 1. Se retin pestii a caror greutate se afla in intervalul dorit si apoi sunt distribuiti aleator in bazine. Trebuie inregistrata greutatea totala a pestilor din fiecare bazin. Folosirea anestezicului, precum si manipularea pestilor (inclusiv zvantarea si cantarirea) pot sa streseze si sa raneasca puietul, in special pe cel din speciile de talie mica. Prin urmare, manipularea puietului trebuie facuta cu cea mai mare grija pentru a evita stresarea si ranirea animalelor de experienta.

Pestii sunt cantariti din nou in a 28-a zi a testului (vezi pct. 1.8.6). Cu toate acestea, daca se considera necesar sa fie recalculata ratia alimentara, pestii pot fi cantariti din nou in ziua a 14-a a testului (vezi pct. 1.8.2.3). Alta metoda, cum ar fi metoda fotografica, poate fi folosita pentru a determina schimbarile in dimensiunile pestilor pe baza carora se pot ajusta ratiile alimentare.

Conditiile de expunere

Durata

Durata testului este de 28 de zile.

Rata de incarcare si densitatea populatiei

Este important ca rata de incarcare si densitatea populatiei sa fie adecvate pentru specia folosita (vezi apendicele 1). Daca densitatea populatiei este prea mare, apare stresul de supraaglomeratie, conducand la reducerea ratei de crestere si, posibil, la boli. Daca densitatea este prea mica, poate aparea un comportament teritorial care de asemenea sa afecteze cresterea. In orice caz, rata de incarcare trebuie sa fie suficient de redusa pentru ca o concentratie de oxigen dizolvat de cel putin 60% VSA sa poata fi mentinuta fara aerare. Un test de intercalibrare (3) a aratat ca, pentru pastravul-curcubeu, o rata de incarcare de 16 pastravi de 3 - 5 g intr-un volum de 40 l este acceptabila. Frecventa recomandata de schimbare a apei pe durata testului este de 6 l/g de peste/zi.

Hranirea

Pestelui i se administreaza o alimentatie corespunzatoare (anexa 1) intr-o cantitate suficienta pentru a induce o rata de crestere acceptabila. Se vegheaza la evitarea proliferarii microbilor si a turbiditatii apei. Pentru pastravul-curcubeu, o ratie zilnica reprezentand 4% din greutatea corporala satisface aceste conditii (3) (16) (17) (18). Ratia zilnica poate fi impartita in doua portii egale si data in doua etape, la interval de cel putin 5 ore. Ratia se calculeaza pornind de la greutatea totala a pestilor din fiecare bazin. Daca pestii sunt cantariti din nou in ziua a 14-a, ratia se recalculeaza in acea zi. Pestii nu sunt hraniti timp de 24 de ore inainte de cantarire.

Alimentele neconsumate si materiile fecale trebuie indepartate zilnic din bazine, prin curatarea atenta a fundului fiecarui bazin folosind o teava aspiratoare.

Lumina si temperatura

Perioada in care bazinul este expus la lumina si temperatura apei trebuie sa fie adecvate speciei testate (anexa 1).

Concentratiile de lucru

In mod normal, sunt necesare cinci concentratii ale substantei testate, indiferent de structurarea testului (vezi pct. 1.7.2). Cunoasterea prealabila a toxicitatii substantei testate (de exemplu dintr-un test de toxicitate acuta si/sau din studii de determinare a intervalelor) ajuta la alegerea concentratiilor adecvate. Trebuie justificata folosirea a mai putin de cinci concentratii. Concentratia maxima testata nu trebuie sa depaseasca limita de solubilitate a substantei in apa.

Cand se foloseste un agent de dispersie la prepararea solutiei de baza, concentratia finala a acestuia nu trebuie sa depaseasca 0,1 ml/l si este de preferat sa fie aceeasi in toate bazinele (vezi pct. 1.6.3). Recurgerea la astfel de produse trebuie totusi evitata pe cat posibil.

Bazinele martor

Numarul bazinelor martor cu apa de diluare depinde de structurarea testului (vezi pct. 1.7 - 1.7.2). Daca se foloseste agent de dispersie, trebuie cuprins in test si un numar de bazine martor cu agent de dispersie egal cu numarul bazinelor martor cu apa de diluare.

Frecventa masuratorilor si determinarilor analitice

Pe durata testului concentratiile substantei testate se determina cu regularitate (vezi in continuare).

La testele in regim dinamic, debitele diluantului si al solutiei de baza continand substanta toxica trebuie verificate cu regularitate, de preferinta zilnic, si nu trebuie sa varieze cu mai mult de 10% pe intreaga durata a testului. Atunci cand concentratiile substantei testate se asteapta sa ramana in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala (adica in intervalul 80-120%; vezi pct. 1.6.2 si 1.6.3), se recomanda minimal analiza celei mai ridicate si a celei mai scazute concentratii la inceputul testului, iar apoi la intervale de o saptamana. In cazul testului la care concentratia substantei testate nu se asteapta a ramane in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala (pe baza datelor de stabilitate privind substanta testata), este necesara analizarea tuturor concentratiilor, dar urmand acelasi procedeu.

La testele in regim semistatic (cu schimbarea apei) unde concentratia substantei testate este de asteptat sa ramana in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala, se recomanda ca, minimal, concentratia cea mai ridicata si cea mai scazuta sa fie analizate imediat dupa preparare si imediat inainte de schimbarea apei la inceputul studiului si saptamanal dupa aceea. La testele unde concentratia substantei testate nu este de asteptat sa ramana in intervalul ± 20% fata de valoarea nominala, trebuie analizate toate concentratiile urmand aceeasi metoda ca si pentru substantele mai stabile.

Se recomanda ca rezultatele sa fie fundamentate pe concentratii masurate. Cu toate acestea, atunci cand, in mod demonstrabil, concentratia substantei testate in solutie a fost mentinuta pe parcursul intregului test in intervalul
± 20% fata de concentratia nominala sau concentratia masurata initial, rezultatele pot fi fundamentate pe valorile nominale sau masurate.

Poate fi necesara filtrarea probelor (de exemplu cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm) sau centrifugarea lor. Centrifugarea este metoda recomandata. Cu toate acestea, daca mediul de lucru nu se adsoarbe pe filtru, filtrarea este in egala masura acceptabila.

In timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul si temperatura se masoara in toate bazinele. Duritatea totala, alcalinitatea si salinitatea se masoara (daca are relevanta) in bazinele martor si in bazinul cu cea mai ridicata concentratie. Minimal, oxigenul dizolvat si salinitatea (daca are relevanta) se masoara de trei ori (la inceput, la jumatate si la sfarsitul testului). In testele in regim semistatic, se recomanda ca oxigenul dizolvat sa se masoare mai frecvent, de preferinta inainte si dupa schimbarea apei sau cel putin o data pe saptamana. pH-ul se masoara la inceputul si la sfarsitul fiecarei schimbari a apei la testele in regim semistatic si cel putin saptamanal la testele in regim dinamic. Duritatea si alcalinitatea se masoara o data la fiecare test. Este de preferat ca temperatura sa fie monitorizata continuu cel putin intr-unul din bazine.

Observatiile

Greutatea: la sfarsitul testului toti pestii supravietuitori trebuie cantariti in vivo zvantati (blotted dry), fie in grupuri pe fiecare bazin, fie individual. Cantarirea in grup este preferata cantaririlor individuale, care necesita marcarea individuala a pestilor. In cazul masurarii greutatii individuale in scopul determinarii ratei de crestere specifice individuale, tehnica de marcare aleasa trebuie sa evite stresarea animalelor (se poate folosi o metoda diferita de metoda crio-marcajului, de exemplu un fir de undita subtire, colorat).

Pestii sunt examinati zilnic pe durata testului si se observa orice anomalii exterioare (cum ar fi hemoragia, decolorarea) si comportamente anormale. Se inregistreaza cazurile de deces si se indeparteaza pestii morti cat mai repede posibil. Pestii morti nu sunt inlocuiti, rata de incarcare si densitatea populatiei fiind suficiente pentru a evita efectele asupra cresterii provocate de schimbarea numarului de pesti din bazin. Este necesar totusi sa se ajusteze ratia alimentara.

REZULTATELE SI RAPORTAREA

PRELUCRAREA REZULTATELOR

Se recomanda implicarea unui statistician atat in structurarea cat si in analiza testului, deoarece aceasta metoda de testare permite variatii considerabile in modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, variatii in numarul de bazine, de concentratii folosite, de pesti etc. Luand in considerare optiunile disponibile in structurarea testului, nu sunt prezentate aici indrumarile specifice referitoare la metoda statistica.

Ratele de crestere nu se calculeaza pentru bazinele in care mortalitatea depaseste 10%. Cu toate acestea, rata mortalitatii trebuie indicata la toate concentratiile folosite.

Oricare din metode este folosita la analizarea rezultatelor, conceptul central este rata r de crestere specifica intre momentul t₁ si momentul t₂. Aceasta poate fi definita in cateva moduri, in functie de prezenta sau absenta marcajului individual al pestilor sau in functie de necesitatea aflarii unei medii pe bazin.

unde:

r₁ = rata de crestere specifica individuala

r₂ = rata de crestere specifica medie a bazinului

r₃ = rata de crestere pseudospecifica

w_1, w₂ = greutatile corporale ale unui anumit peste la momentele t₁ si respectiv t₂

log_ew₁    = logaritmul greutatii corporale a unui anumit peste la inceputul perioadei de studiu

log_ew₂    = logaritmul greutatii corporale a unui anumit peste la sfarsitul perioadei de studiu

log_ew₁    = media logaritmilor valorilor w₁ pentru pestii din bazin la inceputul perioadei de studiu

log_ew₂    = media logaritmilor valorilor w₂ pentru pestii din bazin la sfarsitul perioadei de studiu

r₁, r₂, r₃ pot fi calculate pentru perioada cuprinsa intre ziua 0 si ziua 28 si acolo unde este cazul ( adica atunci cand s-a facut o masuratoare in ziua 14) pentru perioadele dintre ziua 0 si ziua 14 si ziua 14 si ziua 28.

Analiza rezultatelor prin regresie (modelarea concentratie - raspuns)

Aceasta metoda de analiza stabileste o relatie matematica adecvata intre ratele de crestere specifice si concentratie, ceea ce permite estimarea marimii "CE_x", adica orice valoare CE necesara. Folosind aceasta metoda nu mai este necesar calculul marimii r pentru fiecare peste (r₁) si in schimb analiza porneste de la valoarea medie pe bazin a lui r (r₂). Aceasta ultima metoda este preferabila. In plus, este si mai adecvata in cazul speciilor de talie mica.

Pentru a studia relatia concentratie-raspuns, ratele de crestere specifice medii ale bazinelor (r₂) se aseaza pe un grafic ca functie de valorile concentratiilor.

Pentru exprimarea relatiei dintre r₂ si concentratie trebuie ales modelul adecvat, iar alegerea trebuie sustinuta de o justificare pertinenta.

Daca pestii supravietuitori sunt in numar diferit de la un bazin la altul, atunci procesul de ajustare a modelului, fie acesta simplu sau nelinear, se pondereaza pentru a lua in considerare marimile diferite ale grupurilor.

Metoda de ajustare a modelului trebuie sa faca posibila estimarea, de exemplu, a valorii CE₂₀ si a dispersiei sale (fie eroare standard, fie interval de incredere). Graficul modelului ajustat este prezentat in relatie cu rezultatele, asa incat sa poata fi apreciat gradul de adecvare a modelului (9) (19) (20) (21).

Analiza rezultatelor pentru estimarea DMEO

Daca testul a cuprins bazine-dublura la toate nivelurile de concentratie, estimarea DMEO poate fi facuta pe baza analizei de varianta a ratei de crestere specifice medii a bazinului (vezi pct. 2.1), urmata de o metoda pertinenta [de exemplu testul Dunnett sau testul William (13) (14) (15) (22)] de comparare a r medii corespunzatoare fiecarei concentratii cu r medie din bazinele martor, pentru a identifica valoarea cea mai scazuta a concentratiei pentru care diferenta este semnificativa la nivelul de probabilitate de 0,05. Daca nu sunt indeplinite conditiile impuse pentru metodele parametrice - distributie nenormala (de exemplu testul Shapiro-Wilk) sau varianta heterogena (testul Barlett) - trebuie luata in considerare transformarea datelor, in scopul omogenizarii variantelor inainte de efectuarea analizei de varianta, sau efectuarea unei analize de varianta ponderate.

Daca testul nu a cuprins bazine-dublura la fiecare concentratie, o analiza de varianta pe baza rezultatelor pe bazin va fi insensibila sau imposibila. In aceasta situatie, un compromis acceptabil este sa se efectueze analiza pornind de la rata de crestere pseudospecifica r₃ pentru fiecare peste.

r₃ medie de la fiecare nivel de concentratie se compara cu r₃ medie din cazul bazinelor martor. DMEO poate fi identificata ca mai sus. Trebuie admis ca aceasta metoda nu ia in considerare variabilitatea intre bazine in afara de ce se poate explica prin variabilitatea intre pesti, tratati individual, si nici nu ofera protectie in acest sens. Cu toate acestea, experienta a aratat (9) ca variabilitatea intre bazine a fost foarte mica in comparatie cu variabilitatea in interiorul aceluiasi bazin (adica intre pesti). Daca analiza nu cuprinde fiecare peste, trebuie sa se prezinte metoda de identificare a valorilor aberante si justificarea folosirii ei.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Rezultatele se interpreteaza cu precautie atunci cand concentratiile masurate ale substantelor toxice ajung la niveluri apropiate de limitele de detectie ale metodei analitice sau, la testele in regim semistatic, atunci cand concentratia substantei testate scade intre momentul prepararii solutiei si momentul schimbarii apei.

RAPORT DE TESTARE

Raportul de testare trebuie sa cuprinda urmatoarele informatii:

Substanta testata:

natura fizica si proprietatile fizico-chimice relevante,

datele de identificare chimica, inclusiv puritatea si metoda analitica de cuantificare a substantei testate, dupa caz.

Specii testate

numele stiintific, daca este posibil,

susa, marimea, furnizorul, eventuale tratamente prealabile etc.

Conditiile de lucru:

metoda folosita (de exemplu: regim semistatic/schimbarea apei, regim dinamic, incarcare, densitatea populatiei etc.),

structurarea testului (de exemplu: numar de bazine, concentratii folosite si dubluri, numar de pesti pe bazin),

metoda de preparare a solutiilor de baza si frecventa schimbarii apei (se specifica agentul de solubilizare si concentratia sa, atunci cand este folosit) ,

concentratiile nominale, mediile valorilor masurate si deviatiile lor standard in bazine si metoda prin care au fost obtinute, precum si date care sa demonstreze ca masuratorile se refera la concentratia substantei testate in solutia reala,

caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, alcalinitate, temperatura, concentratia oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (daca se masoara), carbon organic total, solide in suspensie, salinitatea mediului de lucru (daca se masoara) si orice alte masuratori efectuate,

calitatea apei din bazine: pH, duritate, temperatura si concentratia oxigenului dizolvat,

informatii detaliate despre alimentatie [de exemplu tipul alimentului (alimentelor), sursa, cantitatea administrata si frecventa].

Rezultatele

date demonstrand ca loturile din bazinele martor au indeplinit criteriile de validitate referitoare la supravietuire si date privind mortalitatea de la fiecare nivel de concentratie,

tehnicile de analiza statistica folosite, statistici intemeiate pe bazine-dublura sau pe fiecare peste, prelucrarea datelor si justificarea tehnicilor folosite,

date tabelare privind greutatile corporale individuale si medii din zilele 0, 14 (daca se masoara) si 28, valorile ratelor de crestere specifice medii ale bazinelor sau pseudospecifice (dupa caz) pentru perioadele dintre ziua 0 si ziua 28 sau, posibil, ziua 0 si ziua 14 si dintre ziua 14 si ziua 28,

rezultatele analizei statistice (adica analiza prin regresie sau de varianta), de preferat in forma tabelara si grafica si DMEO (p=0,05) si DFEO sau Cex cu erori standard cand este posibil, dupa caz,

incidenta oricaror reactii neobisnuite a pestilor si orice efecte vizibile provocate de substanta testata.

BIBLIOGRAFIE

Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, pp. 231-236.

Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855-1870.

Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157-164.

Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.

Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287-297.

Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Seriese PA-600/3-91-063. USE nvironmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328-338.

Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 pp.

Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.

Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.

Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 123-133.

Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, pp. 33-41.

Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.

Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, pp. 1485-1494.

DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the Icp approach. USE nvironmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.

Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero
dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.

ANEXA 1

SPECIILE DE PESTI RECOMANDATE PENTRU TESTARE SI CONDITIILE DE LUCRU ADECVATE

ANEXA 2

UNELE CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUARE ACCEPTABILE

ANEXA 3

SERIILE LOGARITMICE ALE CONCENTRATIILOR ADECVATE PENTRU TESTUL DE TOXICITATE (9)