Testul de inhibare al algelor

TESTUL DE INHIBARE AL ALGELOR

METODA

INTRODUCERE

Scopul acestui test este de a determina efectele unei substante asupra cresterii speciilor de alge verzi unicelulare. Testele de durata relativ scurta (72 ore) pot estima efectele asupra catorva generatii. Aceasta metoda poate fi adaptata pentru a fi utilizata in cazul catorva specii de alge unicelulare, caz in care trebuie furnizata o descriere a metodei impreuna cu raportul privind testarea.

Aceasta metoda este cel mai usor de aplicat in cazul substantelor solubile in apa, pentru care in conditiile de testare, exista probabilitatea de a ramane in apa.

Metoda poate fi utilizata pentru substantele care nu interfera direct cu masuratorile de crestere a algelor.

Este de dorit sa avem, pe cat este posibil, informatii legate de solubilitatea in apa, presiunea de vapori, stabilitatea chimica, constantele de disociere si biodegradabilitatea substantei inainte de inceperea testului

Trebuie luate in considerare atat la planificarea testului cat si la interpretarea rezultatelor, informatiile suplimentare (de exemplu, formula structurala, gradul de puritate, natura si procentul de impuritati semnificative, prezenta si cantitatea aditivilor si coeficientul de distributie n-octanol/apa).

1.2. DEFINITII SI UNITATI DE MASURA

Densitatea celulara: numarul de celule/mililitru.

Crestere: cresterea densitatii celulare in perioada de testare.

Rata de crestere: cresterea densitatii celulare in unitatea de timpCE₅₀: in aceasta metoda, acea concentratie a substantei de testat care determina o reducere cu 50 % fie a cresterii (CE_{b 50}), fie a ratei de crestere (CE_{r 50}) in comparatie cu testul de control.

NOEC: (concentratia pentru care nu se observa nici un efect): in aceasta metoda, cea mai mare concentratie testata pentru care nu se observa nici un efect semnificativ de inhibare a cresterii in comparatie cu testul de control.

Toate concentratiile substantei de testat sunt exprimate in greutate/volum (mg/l). Ele pot fi exprimate de asemenea ca greutate pe greutate (mg.kg^-1).

1.3.SUBSTANTE DE REFERINTA

O substanta de referinta poate fi testata ca un mijloc de a demonstra ca in conditiile de testare din laborator raspunsul speciilor testate nu s-a schimbat semnificativ.

Daca se utilizeaza o substanta de referinta, rezultatele trebuie prezentate intr-un raport de testare. Dicromatul de potasiu poate fi utilizat ca substanta de referinta, dar culoarea sa poate afecta calitatea si intensitatea luminii accesibile celulelor, precum si determinarile spectrofotometrice, daca se fac. Dicromatul de potasiu s-a utilizat intr-un test international interlaboratoare [a se vedea referinta (3) si Anexa (2)].

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CE₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Culturile cu crestere exponentiala de alge verzi selectionate sunt expuse actiunii diverselor concentratii de substanta de testat, pe cateva generatii, in conditii definite.

Solutiile de testat sunt incubate timp de 72 ore, pe durata carora densitatea celulara din fiecare solutie este masurata cel putin la fiecare 24 ore. Se determina inhibarea cresterii prin comparatie cu o cultura de control.

1.5.CRITERII DE CALITATE

Criteriile de calitate se aplica testului limita si metodei testului complet.

Densitatea celulara din culturile de control trebuie sa creasca cu un factor de cel putin 16 in decurs de 3 zile.

Concentratiile substantei de testat se mentin in limita a 80 % din concentratiile initiale pe toata perioada testului.

Pentru substantele care se dizolva usor in mediul de testare, rezultand solutii stabile, adica acelea care nu se volatilizeaza, degradeaza, hidrolizeaza sau adsorb intr-o masura considerabila, concentratia initiala poate fi considerata echivalenta cu concentratia nominala. Se va face dovada ca, concentratiile au fost mentinute pe toata durata testului si ca criteriile de calitate au fost satisfacute.

Pentru substantele care sunt:

i)        putin solubile in mediul de testare, sau

ii)      capabile sa formeze emulsii stabile sau dispersii, sau

iii)            instabile in solutii apoase,

concentratia initiala va fi considerata drept concentratia determinata analitic la inceputul testului. Concentratia se determina dupa o perioada de echilibrare.

In oricare din aceste cazuri, trebuie sa se efectueze determinari suplimentare in timpul testarii pentru a confirma concentratiile reale de expunere sau respectarea criteriilor de calitate.

Cantitati semnificative de substanta de testat pot fi incorporate in biomasa de alge pe durata testului. De aceea, in scopul demonstrarii respectarii criteriilor de calitate de mai sus, trebuie luate in consideratie atat cantitatea de substanta incorporata in biomasa de alge, cat si substanta din solutie (sau, daca nu este tehnic posibil, masurata in coloana de apa).

Totusi, intrucat determinarea concentratiei substantei in biomasa de alge poate pune probleme tehnice serioase, respectarea criteriilor de calitate poate fi demonstrata folosind un vas de testare cu cea mai mare concentratie a substantei, dar fara alge si masurand concentratiile in solutie (sau, daca nu este tehnic posibil, in coloana de apa) la inceputul si la sfarsitul perioadei de testare.

1.6.DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.1.Reactivi

1.6.1.1.Solutiile substantelor de testat

Solutiile stoc de concentratia necesara sunt preparate prin dizolvarea substantei in apa deionizata sau in apa conform pct.1.6.1.2.

Concentratiile de testat alese sunt preparate prin adaugarea unor cantitati adecvate la preculturile de alge (a se vedea Anexa 1). Substantele trebuie in mod normal sa fie testate numai pana la limita solubilitatii. Pentru unele substante (de exemplu, substantele putin solubile in apa sau cu P_ow ridicat, sau cele care formeaza dispersie stabila mai degraba decat o solutie reala in apa), se accepta sa se foloseasca o concentratie de testat deasupra limitei de solubilitate a substantei pentru a fi siguri ca s-a obtinut concentratia maxima solubila/stabila. Este totusi important ca aceasta concentratie sa nu perturbe in alt fel sistemul de testare (de exemplu, o pelicula de substanta pe suprafata apei care sa impiedice oxigenarea apei,etc).

Dispersia cu ultrasunete, solventii organici, emulgatorii sau agentii de dispersie se pot folosi pentru a prepara solutiile stoc ale substantelor cu solubilitate scazuta in apa sau pentru a facilita dispersia acestor substante in apa de dilutie. Cand se folosesc astfel de substante auxiliare, toate solutiile de testat trebuie sa contina aceleasi cantitati de substante auxiliare si solutiile utilizate in testele de control trebuie sa contina aceleasi concentratii de substante auxiliare ca cele folosite in seriile de testare. Concentratia unor astfel de substante auxiliare trebuie minimalizata si in nici un caz nu trebuie sa depaseasca 100 mg/l.

Testul trebuie efectuat fara ajustarea pH-ului. Daca exista dovada unei schimbari pronuntate a pH-ului se recomanda ca testarea sa se repete dupa ajustarea pH-ului, iar rezultatele trebuie raportate. In acest caz, valoarea pH-ului solutiei stoc trebuie ajustata la valoarea pH-ului apei de dilutie daca nu exista motive speciale pentru a nu face acest lucru. HCl si NaOH sunt preferate in acest scop. Aceasta ajustare a pH-ului trebuie sa fie facuta astfel incat concentratia substantei de testat din solutia stoc sa nu se schimbe in mod semnificativ. Daca in urma acestei ajustari apare o reactie chimica sau precipitarea fizica a substantei de testat, acest lucru trebuie raportat.

1.6.1.2 Mediul de testare

Se poate utiliza apa distilata de buna calitate sau apa deionizata cu o conductibilitate mai mica de 5 S.cm^-1. Aparatul pentru distilarea apei nu trebuie sa contina nici o componenta din cupru.

Se recomanda urmatorul mediu:

Se prepara patru solutii stoc conform urmatorului tabel. Solutiile stoc se sterilizeaza prin filtrare prin membrana sau prin autoclavare si se depoziteaza la intuneric la 4˚C. Solutia stoc numarul patru trebuie sterilizata numai prin filtrare prin membrana.

PH-ul mediului dupa aerare este aproximativ 8.

1.6.2. Aparatura

Echipament normal de laborator

Vase de testare cu un volum adecvat (de exemplu, vase conice de 250 ml sunt adecvate cand volumul solutiei de testare este de 100 ml). Toate vasele de testare trebuie sa fie identice in ceea ce priveste materialul si dimensiunile

Aparatura pentru cultura: laboratorul sau camera in care se poate mentine o temperatura in limita de 21-25sC, ±2 sC, si o iluminare continua uniforma in gama spectrala 400-700 nm. Daca algele din culturile de control au atins ratele recomandate de crestere se poate presupune ca conditiile de crestere, inclusiv intensitatea luminii, au fost adecvate.

Se recomanda sa se foloseasca o intensitate a luminii care variaza in domeniul
60 - 120 μE.m^-2 . s^-1(35 la 70 x 10¹⁸ fotoni . m^-2.s^-1) cand este masurata in domeniul 400 -700 nm folosind un receptor adecvat.

Pentru instrumentele de masurare a luminii calibrate in luxi, se accepta un domeniu echivalent de 6000-10000 lx.

Intensitatea luminii se poate obtine folosind 4-7 lampi fluorescente de 30 W de tip universal alb ,la o distanta de 0,35 m de cultura de alge.

masuratorile densitatii celulare trebuie facute folosind metoda directa de numarare a celulelor vii, de exemplu, un microscop cu camere de numarare. Totusi, se pot folosi si alte procedee (fotometrie, turbidimetrie, . ) daca sunt suficient de sensibile si daca se demonstreaza ca sunt suficient de bine corelate cu densitatea celulara.

1.6.3.Organismele test

Se sugereaza ca speciile de alge verzi folosite ca specii cu crestere rapida sunt convenabile pentru cultura si testare. Se prefera urmatoarele specii:

Selenastrum capricornutum, de exemplu, ATCC 22662 sau CCAP 278/4,

Scenedesmus subspicatus, de exemplu, 86.81 SAG,

Nota

ATCC = Colectie de culturi tip American ( SUA)

CCAP = Centrul de cultura al algelor si protozoarelor ( Marea Britanie)

SAG    = Colectie de culturi de alge ( Güottingen Germania)

Daca se folosesc alte specii trebuie sa se comunice specia.

1.6.4.Procedeul de testare

Domeniul concentratiilor in care pot aparea efectele se determina pe baza rezultatelor testelor pentru aflarea domeniului.

Pentru masurarea inhibitiei cresterii se utilizeaza biomasa si rata de crestere; ambele trebuie folosite pentru testul de aflare a domeniului pentru a ne asigura ca progresia geometrica a concentratiilor va permite estimarea ambelor CE_{b 50} si CE_{r 50}.

Densitatea celulara initiala

Se recomanda ca densitatea celulara initiala din culturile de testat sa fie de circa 10⁴ celule/ml pentru Selenastrum capricornutum si Scenedesmus subspicatus. Cand se folosesc alte specii biomasa trebuie sa fie comparabila.

Concentratiile substantei de testat

Pentru testare, se aleg cel putin cinci concentratii in serie geometrica intr-un raport care nu depaseste 2,2. La cele mai mici concentratii testate trebuie sa nu se observe nici un efect asupra cresterii algelor. Cele mai ridicate concentratii de testat trebuie sa inhibe cresterea cu cel putin 50 % fata de testul control si de preferinta sa opreasca complet cresterea.

Replici si controale

Proiectul de testare trebuie sa includa trei replici la fiecare concentratie de testat. Se efectueaza trei teste de control fara substanta de testat si, daca este relevant, se

fac de asemenea trei teste de control cu substanta auxiliara. Daca se justifica, proiectul de testare poate fi modificat astfel incat sa se mareasca numarul de concentratii si sa se reduca numarul de replici pe concentratie .

Efectuarea testarii

Culturile de testat ce contin concentratiile dorite ale substantei de testat si cantitatea adecvata de alge sunt preparate adaugand cantitati din solutiile stoc ale substantei de testat cantitatilor adecvate de preculturi de alge (vezi Anexa 1).

Vasele de cultura sunt agitate si introduse in aparatul de cultura. Celulele algelor sunt mentinute in suspensie prin agitare, amestecare sau barbotare cu aer, pentru a imbunatatii schimbul de gaz si a reduce variatia pH-ului in solutiile de testat. Culturile trebuie mentinute la o temperatura in domeniul de 21-25 sC ± 2 sC.

Densitatea celulara in fiecare vas de testare se determina la cel putin 24, 48 si 72 ore dupa inceperea testarii. Mediul de alge filtrat ce contine concentratia adecvata de substanta chimica de testat se foloseste pentru a determina fondul.Cand se efectueaza masuratori de densitate celulara, altele decat metodele de numarare directa, se utilizeaza un mediu de alge filtrat cu concentratia adecvata de substanta chimica de testat.

PH-ul se masoara la inceputul testarii si la 72 ore.

PH-ul testelor de control in mod normal nu trebuie sa varieze cu mai mult de 1,5 unitati in timpul testarii.

Testarea substantelor volatile

Nu exista date pentru o modalitate acceptata in general de testare a substantelor volatile. Cand se stie ca o substanta are tendinta de evaporare se pot folosi vase de testare cu spatiul de deasupra liber, de siguranta. Posibilitatea lipsei CO₂ trebuie luata in considerare cand se calculeaza spatiul liber de deasupra. S-au propus variante ale acestei metode (vezi referinta 4).

Trebuie facute incercari pentru a determina cantitatea de substanta care ramane in solutie si se recomanda atentie deosebita pentru interpretarea rezultatelor testelor cu substante chimice volatile folosind sisteme inchise.

Test limita

Folosind procedurile descrise in aceasta metoda de testare, se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CE₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Daca natura substantei nu permite atingerea concentratiei de 100 mg/l in solutia de testat, testul limita trebuie sa fie efectuat la o concentratie egala cu solubilitatea substantei (sau concentratia maxima pentru formarea unei dispersii stabile) in mediul folosit (vezi si punctul 1.6.1.1.).

Testul limita trebuie efectuat cel putin in trei replici, cu acelasi numar de teste de control. Cele doua masuratori ale cresterii (biomasa si rata de crestere) trebuie folosite pentru testul limita.

Daca intr-un test limita, se intalneste o descrestere minima de 25% sau mai mult, atat a biomasei cat si a ratei de crestere fata de testul de control, trebuie sa se efectueze o testare completa.

DATE SI EVALUARE

Densitatea celulara masurata in culturile de testat si control este trecuta in tabel impreuna cu concentratiile substantei de testat si timpii de masurare. Valoarea medie a densitatii celulare pentru fiecare concentratie a substantei de testat si pentru testele de control este trasata in functie de timp (0-72 ore) pentru a obtine curbele de crestere.

Pentru a determina relatia concentratie/efect trebuie sa se foloseasca urmatoarele 2 metode. Unele substante pot stimula cresterea la concentratii scazute. Trebuie luate in considerare numai punctele datelor care indica inhibarea intre 0 si 100%.

2.1.Compararea ariilor dintre curbele de crestere

Aria dintre curbele de crestere si linia orizontala N=N₀ se poate calcula conform formulei:

A = (N₁ - N₀) / 1 x t₁ + (N₁+N₂) - 2N₀) / 2 x (t₂-t₁)t..t(N_n-1 + N_n - 2N₀) / 2(t_n - t_n-1)

Unde:

A = aria

N₀= numar de celule /ml la timpul t₀ (inceputul testarii)_,0,

N₁= numar de celule/ml masurat la t₁

N_n= numar de celule/ml masurat la t_n,

t₁= timpul primei masuratori dupa inceperea testului

t_n= timpul a n-a masuratori dupa inceperea testului

n= numarul de masuratori efectuate dupa inceperea testului

Procentul de inhibitie a cresterii celulare la fiecare concentratie a substantei de testat (I_A) se calculeaza conform formulei:

(A_c - A_t) / A_c x 100

Unde:

A_c= aria dintre curba de crestere a testului de control si linia orizontala N = N₀

A_t= aria dintre curba de crestere la concentratia t si linia orizontala N = N₀

Valorile I_A sunt trasate pe hartie semilogaritmica sau pe hartie probit semilogaritmica fata de concentratiile corespunzatoare. Daca se traseaza pe hartie probit, punctele se unesc printr-o linie dreapta, fie cu ochiul fie printr-o regresie calculata.

Valoarea CE₅₀ se estimeaza din linia de regresie prin citirea concentratiei care este echivalenta inhibitiei de 50 % ( I_A = 50 %). Pentru a nota aceasta valoare fara ambiguitate se propune folosirea simbolului CE_b50. Este esential ca CE_{b 50} sa se citeze impreuna cu perioada adecvata de expunere, de exemplu, CE_{b 50} (0 -72 ore).

2.2.Compararea ratelor de crestere

Rata medie specifica de crestere (μ) pentru culturile cu o crestere exponentiala se poate calcula ca:

μ = (lnN_n - lnN₀) / (t_n - t₀)

Unde:

t₀= este timpul de la inceputul testarii

In mod alternativ, rata medie specifica de crestere se poate deriva din panta dreptei de regresie a diagramei In N functie de timp.

Procentul de inhibitie a ratei specifice de crestere la fiecare concentratie a substantei de testat (I_μt) se calculeaza cu formula:

I_mt = (μ _c - μ _t ) / μ _c x 100

Unde:

μ_c= rata medie specifica de crestere pentru proba de control

μ_t= rata medie specifica de crestere pentru concentratia de testat t

Scaderea procentuala a ratei medii specifice de crestere la fiecare concentratie a substantei de testat in comparatie cu valoarea testului de control este trasata fata de logaritmul concentratiei. Valoarea CE₅₀ se poate citi din graficul ce rezulta. Se propune sa se foloseasca simbolul CE_{b 50} pentru a nu denumi ambiguu valoarea CE₅₀ derivata prin aceasta metoda. Trebuie sa se indice timpii de masurare, de exemplu, daca valoarea se refera la timpii 0 si 72 ore, simbolul devine CE_{r 50} ( 0-72 ore.).

Nota: rata specifica de crestere este un termen logaritmic si micile modificari ale ratei de crestere pot duce la modificari mari ale biomasei. Prin urmare valorile CE_b si CE_t nu sunt comparabile numeric.

2.3.Calculul NOEC (Concentratia pentru care nu se observa nici un efect)

NOEC se determina printr-un procedeu statistic adecvat pentru compararea multi-probelor (de exemplu, analiza variantei si testul Dunnett), folosind valorile individuale ale replicilor ariilor dintre curbele de crestere A (a se vedea pct. 1.2.1.) sau ratele specifice de crestere μ ( vezi pct. 2.2.)

RAPORTAREA

Raportul de testare va include, daca este posibil, urmatoarele informatii:

substanta de testat: date de identificare a substantei chimice

organismele test: origine, cultura de laborator, numar, specie, metoda de cultivare

conditii de testare:

data testarii si sfarsitul testarii precum si durata

temperatura

compozitia mediului

aparatul de cultura

pH-ul solutiei la pornirea si sfarsitul testarii (trebuie sa se dea o explicatie daca se observa modificarile pH-ului de mai mult de 1,5 unitati)

substanta si metoda folosita pentru solubilizarea substantei de testat si concentratia substantei in solutiile de testat

Intensitatea si calitatea luminii

Concentratiile testate ( determinate sau nominale)

Rezultate:

densitatea celulara pentru fiecare vas de testare la fiecare timp de masurare si metoda pentru masurarea densitatii celulare

valorile medii ale densitatii celulare

curbele cresterii

prezentarea grafica a relatiei concentratie -efect

valorile CE si metoda de calcul

NOEC

alte efecte observate

BIBLIOGRAFIE

OECD, Paris 1981, Test Guideline Decision of the Council C (81) 30 Final

Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Varfahrensvorschlag " Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus", in : Rudolph/Boje:

ISO 8692 - Water qualiti - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum

S. Galassi and M. Vighi - Chemosphere,1981, vol.10,1123-1126

Anexa 1

Exemplu de procedeu pentru cultura algelor

Observatii generale

Scopul cultivarii pe baza urmatorului procedeu este de a obtine culturi de alge pentru testele de toxicitate.

Trebuie sa se foloseasca metode adecvate pentru a ne asigura ca culturile de alge nu sunt infectate cu bacterii ( ISO 4833).

Culturile necontaminate sunt de dorit, dar culturile cu un singur tip de alge sunt esentiale.

Toate operatiile trebuie executate in conditii sterile pentru a evita contaminarea cu bacterii sau alte alge. Culturile contaminate trebuie indepartate.

Procedee pentru obtinerea culturilor de alge

Prepararea solutiilor de nutrient (mediu):

Mediul se poate prepara prin diluarea solutiilor stoc concentrate de nutrienti. Pentru mediul solid se adauga 0,8% agar. Mediul trebuie sa fie steril.

Sterilizarea in autoclava poate duce la o pierdere de NH₃.

Cultura stoc

Culturile stoc sunt culturi mici de alge care sunt transferate in mod regulat intr-un mediu proaspat pentru a actiona ca material initial de testare. Daca culturile nu sunt folosite cu regularitate, ele se depun sub forma de dara pe tuburile inclinate de agar. Acestea sunt transferate intr-un mediu proaspat cel putin o data la 2 luni.

Culturile stoc sunt formate in vase conice ce contin mediul adecvat (volum cca.
100 ml). Cand algele sunt incubate la 20sC cu iluminare continua este necesar un transfer saptamanal.

In timpul transferului o cantitate din cultura "veche" este transferata cu pipete sterile intr-un recipient cu mediu proaspat, astfel incat in cazul speciilor cu crestere rapida concentratia initiala sa fie de cca. 100 ori mai mica decat in culturile vechi.

Rata de crestere a speciei se poate determina din curba de crestere. Daca se cunoaste acest lucru este posibil sa se estimeze densitatea la care cultura trebuie transferata intr-un mediu nou. Acest lucru trebuie sa se faca inainte ca cultura sa atinga faza mortii.

Precultura

Precultura are ca scop obtinerea unei cantitati de alge adecvata pentru inocularea culturilor de testat. Precultura este incubata in conditiile testarii si folosita in timpul cresterii exponentiale, in mod normal dupa o perioada de incubare de cca. 3 zile. Cand culturile de alge contin celule deformate sau anormale ele trebuie inlaturate.

Anexa 2

ISO 8692 - Calitatea Apei - testul de inhibare a cresterii algelor in apa proaspata cu Selenastrum capricornutum si Scenedesmus subspicatus raporteaza urmatoarele rezultate pentru testare interlaboratoare intre 16 laboratoare, testand bicromatul de potasiu.