TESTUL VASULUI INCHIS (Metoda C.4-E)

1. PRINCIPIUL METODEI TEST

Solutia de substanta de testat in mediu mineral, uzual 2-5 mg/litru, este inoculata cu un numar relativ mic de microorganisme dintr-o populatie bacteriana mixta, in vase de testare complet pline, inchise, tinute la intuneric, la temperatura constanta. Degradarea este urmata de analiza oxigenului dizolvat dupa o perioada de 28 zile. Cantitatea de oxigen consumata de catre substanta de testat, corectata cu consumul din martorul cu inocul, testat in paralel, este exprimata ca procent de ThOD sau CCO.

2. DESCRIEREA METODEI

2.1. Aparatura

a) Vase CBO, cu dopuri de sticla, de exemplu de 250-300 ml;

b) Baie de apa sau incubator, pentru tinerea vaselor la temperatura constanta ( 1⁰ sau mai precis) si la intuneric;

c) Vase mari (2-5 litri) pentru prepararea mediului si pentru umplerea vaselor CBO;

d) Oxigenometru sau echipament si reactivi pentru titrarea Winkler.

2.2. Prepararea mediului mineral

Pentru prepararea solutiilor stoc, vezi 1.6.2.

Se amesteca cate 1 ml din solutiile (a) - (d) si se aduce la 1 litru cu apa de dilutie.

2.3. Prepararea inoculului

Inoculul este in mod normal provenit din efluentul secundar al instalatiei de epurare sau din sedimentul provenit predominant de la apa uzata menajera. O sursa alternativa de inocul este apa de suprafata. In mod normal se foloseste de la o picatura (0,05 ml) pana la 5 ml de filtrat pe litru de mediu; pot fi necesare experimentari pentru a determina volumul optim pentru un efluent dat (Vezi 1.6.4.2. si 1.6.5.).

2.4. Pregatirea vaselor

Se aereaza puternic mediul mineral timp de cel putin 20 min. Fiecare serie de teste se efectueaza cu mediu mineral provenit din acelasi lot. In general, mediul este gata pentru folosire dupa pastrarea sa la temperatura de testare timp de 20 ore. Se determina concentratia oxigenului dizolvat pentru control; valoarea va fi de aproximativ 9 mg/litru la 20⁰C. Toate operatiile de transfer si umplere se efectueaza intr-un mediu saturat cu oxigen, fara bule, prin folosirea sifoanelor.

Se prepara grupuri paralele de vase CBO cu substanta de testat si de referinta pentru determinari in serii experimentale simultane. Se monteaza un numar suficient de vase CBO, inclusiv martorul cu inocul, pentru a permite ca masuratorile duplicate ale consumului de oxigen sa fie facute la intervalele de timp dorite, de exemplu, dupa 0, 7,

14, 21 si 28 zile. Pentru a fi posibila identificarea ferestrei de 10 zile, se folosesc mai multe vase.

Vasele mari se umplu o treime cu mediu mineral aerat. Apoi se adauga solutii stoc de substanta de testat si de referinta in vase mari separate,in cantitati suficiente pentru a rezulta o concentratie finala a substantelor nu mai mare de 10 mg/litru. Nu se adauga nici o substanta la mediul martorului cu inocul, continut intr-un alt vas mare.

Pentru a se asigura ca activitatea inoculului nu este limitata, concentratia oxigenului dizolvat nu trebuie sa scada sub 0,5 mg/litru in vasele CBO. Aceasta limiteaza concentratia substantei de testat la aproximativ 2 mg/litru. Totusi, pentru compusii putin degradabili si pentru aceia cu un ThOD mic, se pot folosi 5-10 mg/litru. In unele cazuri, se recomanda sa se efectueze serii paralele cu substanta de testat la doua concentratii diferite, de exemplu, 2 si 5 mg/litru. In mod normal, se calculeaza ThOD pe baza formarii sarurilor de amoniu dar, daca se banuieste sau se stie ca are loc nitrificarea, se calculeaza pe baza formarii nitratului (ThOD_NO3: vezi Anexa II.2). Totusi, daca nitrificarea nu este completa, dar are loc, se corecteaza cu modificarile concentratiilor de nitrit si nitrat, determinate prin analiza, (vezi Anexa V).

Daca trebuie determinata toxicitatea substantei de testat (de exemplu, in cazul in care au fost gasite anterior valori de biodegradabilitate scazute), este necesara o alta serie de vase.

Se pregateste un alt vas mare ce contine mediu mineral aerat (aproximativ o treime din volumul sau) plus substanta de testat si substanta de referinta la aceleasi concentratii finale ca si acelea din celelalte vase mari.

Se inoculeaza solutiile din vasele mari cu efluent secundar (de la o picatura sau aproximativ 0,05 ml, pana la 5 ml/litru) sau cu o alta sursa cum ar fi apa de rau (vezi 1.6.4.2.). In final, se aduc solutiile la volum cu mediu mineral aerat folosind un furtun care ajunge la fundul vasului pentru a realiza o amestecare adecvata.

2.5. Numarul de vase la o testare tipica

La o testare tipica sunt folosite urmatoarele vase:

cel putin 10 continand substanta de testat si inoculul (suspensia de testat),

cel putin 10 continand numai inoculul (martor cu inocul),

cel putin 10 continand substanta de referinta si inoculul (control procedura),

si, cand este necesar, 6 vase continand substanta de testat, substanta de referinta si inoculul (controlul de toxicitate). In plus, pentru a fi posibila identificarea ferestrei de 10 zile, sunt necesare dubluri ale celor mai multe vase.

2.6. Efectuarea testului

Se distribuie imediat fiecare solutie preparata in vasele CBO din grupul respectiv, prin furtun, din sfertul inferior (nu la baza) al vasului mare adecvat, astfel incat toate vasele CBO sa fie complet umplute. Se lovesc usor pentru a indeparta bulele de aer. Se analizeaza imediat, la momentul zero, oxigenul dizolvat din vase, prin metoda Winkler sau prin metoda electrodului. Continutul vaselor poate fi pastrat pentru a fi analizat mai tarziu, prin metoda Winkler, prin adaugarea de sulfat de magneziu (II) si de hidroxid de sodiu (primul reactiv Winkler). Se depoziteaza vasele inchise cu grija, ce contin oxigen fixat ca oxid de magneziu (III) hidratat, brun, la intuneric, la 10-20⁰C, timp de cel mult

24 ore, inainte de efectuarea etapelor ramase ale metodei Winkler. Se astupa vasele replicate ramase, asigurandu-se ca nu sunt incluse bule de aer si ca incubatia are loc la 20⁰C, la intuneric. Fiecare serie experimentala trebuie sa fie insotita de o serie paralela, ce contine solutie martor cu inocul. Se preleveaza probe din vasele duplicate, din toate seriile, pentru analiza oxigenului dizolvat la intervale de timp (cel putin saptamanal), de-a lungul celor 28 zile de incubare.

Probele prelevate saptamanal permit evaluarea procentului de indepartare in fereasta de 14 zile, in timp ce prelevarea de probe la 3-4 zile permite identificarea ferestrei de 10 zile, care necesita dublarea numarului celor mai multe vase.

Pentru substantele de testat care contin N, se fac corectii ale consumului de oxigen necesar oricarei nitrificari ce are loc. Pentru aceasta, se foloseste metoda electrodului de O₂ pentru determinarea concentratiei oxigenului dizolvat si apoi se preleveaza o proba din vasul CBO pentru analiza azotitului si azotatului. Din cresterea concentratiei de azotit si azotat se calculeaza oxigenul folosit (vezi Anexa V).

3. DATE SI RAPORTARE

3.1. Interpretarea rezultatelor

Mai intai se calculeaza CBO folosit dupa fiecare perioada de timp, prin scaderea oxigenului consumat (mg O₂/litru) de martorul cu inocul din acela al substantei de testat. Se imparte acest consum corectat la concentratia substantei de testat (mg/litru), pentru a obtine CBO specific ca mg oxigen pe mg substanta de testat. Se calculeaza procentul de biodegradabilitate prin impartirea CBO specific la ThOD specific (calculat in concordanta cu Anexa II.2) sau CCO (determinat prin analiza, vezi Anexa II.3), dupa cum urmeaza:

mg O₂ consumat de substanta de testat - mg O₂ consumat de proba alba

CBO =     = mg O₂ per mg substanta de testat

mg substanta de testat din vas

CBO (mg O₂ /mg substanta de testat)

% degradare = x 100

ThOD (mg O₂ /mg substanta de testat)

sau

CBO (mg O₂ /mg substanta de testat)

% CCO = x 100

CCO (mg O₂ /mg substanta de testat)

Se va nota ca aceste doua metode nu vor da in mod necesar aceeasi valoare; este preferabil sa folosim prima metoda.

Pentru substantele de testat ce contin azot, se foloseste ThOD (NH₄ sau NO₃) in concordanta cu ceea ce este cunoscut sau asteptat privind incidenta nitrificarii (Anexa II.2). Daca nitrificarea are loc, dar nu este completa, se calculeaza corectia pentru oxigenul consumat la nitrificare din modificarea concentratiilor de azotit si azotat (Anexa V).

3.2. Validarea rezultatelor

Scaderea continutului de oxigen in martorul cu inocul nu trebuie sa depaseasca 1,5 mg oxigen dizolvat/litru, dupa 28 zile. Valori mai mari decat aceasta cer investigarea tehnicilor experimentale. Concentratiile reziduale de oxigen din vasele de testare nu trebuie sa scada sub 0,5 mg/litru in orice moment. Astfel, nivele de oxigen mai scazute sunt valide numai daca metoda de determinare a oxigenului dizolvat folosita este capabila de masurarea cu precizie a unor astfel de nivele de concentratii.

Vezi de asemenea 1.5.2.

3.3. Raportare

Vezi 1.8.

4. FISA DE DATE

Un exemplu de fisa de date este dat in continuare.