Toxicitate pentru rame

TOXICITATE PENTRU RAME

TEST PE SOL ARTIFICIAL

1. METODA

1.1. Introducere

In acest test de laborator substanta de testat se adauga la un sol artificial in care se plaseaza rame timp de 14 zile. Dupa aceasta perioada (si optional dupa 7 zile) se examineaza efectul letal al substantei pe rame. Testul prevede o metoda pentru determinarea pe termen relativ scurt, a efectului substantelor chimice pe rame prin absorbtie dermala si alimentara.

1.2. Definitie si unitate

CL₅₀, concentratia de substanta estimata ca letala pentru 50 % din organismele test in timpul perioadei de testare.

1.3. Substanta de referinta

Se foloseste periodic o substanta de referinta ca mijloc de a demonstra ca sensibilitatea sistemului de testare nu s-a schimbat semnificativ.

Se recomanda ca substanta de referinta, cloracetamida reactiv pentru analiza.

1.4. Principiul testului

Solul este un mediu variabil asa ca pentru acest test se foloseste un sol artificial de argila atent definit. Ramele adulte din specia Eisenia foetida (a se vedea nota din anexa) sunt tinute in solul artificial definit tratat cu diferite concentratii ale substantei de testat. Continutul vaselor este imprastiat pe o tava dupa 14 zile (optional 7 zile) de la inceperea testului si se numara ramele care au supravietuit la fiecare concentratie.

1.5. Criterii de calitate

Testul este desemnat ca fiind cat se poate de reproductibil cu privire la substratul de testare si organism. Mortalitatea la testele de control nu trebuie sa depaseasca 10 % la sfarsitul testului altfel testul este invalidat.

1.6. Descrierea metodei de testare

1.6.1. Materiale

1.6.1.1. Substrat de testare

Se foloseste sol artificial definit ca substrat de testare de baza.

(a) Substrat de baza (procentele se refera la greutate uscata)

10 % muschi de turba (cat se poate de aproape de pH 5,5 la 6 si pe cat se poate fara resturi vizibile de plante si pamant)

20% argila caolinitica cu mai mult de 50 % caolinit

aproximativ 69 % nisip industrial de cuart (mai mult de 50 % nisip fin cu dimensiunea particolelor de la 0,05 mm pana la 0,2 mm). Daca substanta nu se disperseaza suficient in apa, trebuie pastrata o cantitate de 10 g nisip/vas de testare pentru amestecarea mai tarziu cu substanta de testat

aproximativ 1% carbonat de calciu (CaCO₃), pulverizat, chimic pur, adaugat pentru a ajusta pH-ul la 6,0

(b) Substrat de testare

Substratul de testare contine in substratul de baza substanta de testat si apa deionizata. Continutul de apa este de aprox. 25 - 42% din greutatea uscata a substratului de baza. Continutul de apa al substratului este determinat aducand la greutate constanta substratul prin uscare la 105⁰C. Criteriul cheie este ca solul artificial trebuie udat pana la punctul in care nu mai exista apa statatoare. Amestecarea se face cu grija pentru a se obtine o distributie uniforma a substantei de testat si a substratului. Trebuie raportat modul de introducere a substantei de testat in substrat.

(c) Substrat de control

Substratul de control contine substrat de baza si apa. Daca se foloseste un agent aditiv, substratul de control trebuie sa contina aceeasi cantitate de agent aditiv.

1.6.1.2. Vase de testare

Vase de sticla cu capacitatea de aproximativ 1 l (acoperite adecvat cu capace de plastic, farfurii sau film de plastic cu gauri de aerisire) umplute cu o cantitate de substrat de testare sau de control umed, echivalent cu 500 g greutate uscata de substrat.

1.6.2. Conditii de testare

Vasele trebuie pastrate in camere climatice la o temperatura de 20^oC 2^oC cu lumina continua. Intensitatea luminii trebuie sa fie de 400-800 de lux.

Perioada de testare este de 14 zile, dar mortalitatea poate fi evaluata optional la 7 zile dupa inceperea testului.

1.6.3. Procedura de testare

Concentratiile substantei de testat

Concentratiile substantei de testat sunt exprimate ca greutate de substanta pe greutate de substrat de baza uscat (mg / kg).

Testul de determinarea domeniului care provoaca mortalitate

Domeniul de concentratii care provoaca mortalitati de 0 - 100 % poate fi determinat printr-un test de stabilire a valorilor care provoaca mortalitate, care sa ofere informatii despre domeniul de concentratii ce trebuie folosit in testul definitiv.

Substanta trebuie testata la urmatoarele concentratii: 1000; 100; 10; 1 si 0,1 mg substanta / kg substrat de testare (greutate uscata).

Daca trebuie facut un test definitiv, complet, o serie de testare pe concentratie si una pentru controlul netratat, fiecare cu cate 10 rame, pot fi suficiente pentru acest test.

Testul definitiv

Rezultatele testului de stabilire a valorilor care provoaca mortalitate sunt folosite pentru a selecta cel putin 5 concentratii intr-o serie geometrica din domeniul 0 - 100% mortalitate, care difera cu un factor constant care nu depaseste 1,8.

Testele in care se folosesc aceste serii de concentratii trebuie sa permita estimarea valorii CL₅₀ si a limitelor de incredere cat se poate de precis.

In testul definitiv se folosesc 4 loturi de testare pe concentratie si 4 loturi de control netratate, fiecare cu 10 rame. Rezultatele acestor teste repetate sunt date ca o medie si abatere standard.

Cand doua concentratii consecutive intr-un raport de 1,8 dau numai 0% si 100% mortalitate, aceste doua valori sunt suficiente pentru a indica domeniul in care se afla CL₅₀.

Amestecul de substrat de baza de testare si substanta de testat

Cand se poate, substratul de testare trebuie facut fara agenti suplimentari, altii decat apa. Imediat inainte de inceperea testului, o emulsie sau dispersie de substanta de testat in apa deionizata sau alt solvent se amesteca cu substrat de baza de testare sau este pulverizata uniform peste el, cu cromatografie fina sau pulverizare similara.

Daca este insolubila in apa, substanta de testat se poate dizolva intr-un volum cat se poate de mic de solvent organic adecvat (de exemplu, hexan, acetona sau cloroform).

Se pot folosi numai agenti care se volatilizeaza rapid pentru a solubiliza, dispersa sau emulsiona substanta de testat. Substratul de testare trebuie aerisit inainte de utilizare. Cantitatea de apa evaporata trebuie inlocuita. Martorul trebuie sa contina aceeasi cantitate din orice agent aditiv.

Daca substanta de testat nu este solubila, dispersabila sau emulsionabila in solventi organici, se amesteca 10 g de nisip de cuart fin macinat cu o cantitate de substanta de testat necesara pentru a trata 500 g greutate uscata de sol artificial cu 490 g substanta uscata de substrat de testare.

Pentru fiecare lot de testare, o cantitate de substrat de testare umed echivalent a 500 g greutate uscata este plasata in fiecare vas de sticla impreuna cu 10 rame, care au fost tinute 24 de ore intr-un substrat de baza umed, similar si apoi spalate rapid si surplusul de apa absorbit pe hartie de filtru. Inainte de utilizare sunt plasate pe suprafata substratului de testare.

Vasele sunt acoperite cu capace de plastic, farfurii sau filme de plastic perforate pentru a preveni uscarea substratului si sunt pastrate in conditii de testare 14 zile.

Evaluarile trebuie facute dupa 14 zile (si optional 7 zile) de la inceperea testului. Substratul este imprastiat pe o placa de sticla sau otel inox. Ramele sunt

examinate si se determina numarul de rame supravietuitoare. Ramele sunt considerate moarte daca nu raspund la stimulul mecanic usor, la partea din fata.

Cand se face examinarea la 7 zile, vasul este reumplut cu substrat si ramele supravietuitoare sunt plasate pe aceeasi suprafata a substratului de testare.

1.6.4. Organisme de testare

Organismele de testare trebuie sa fie Eisenia foetida adulte (a se vedea nota din anexa) (in varsta de cel putin 2 luni, cu clitelum) cu o greutate umeda de 300 - 600 mg (pentru metoda de crestere a se vedea anexa).

2. DATE

2.1. Interpretarea si evaluarea rezultatelor

Concentratiile substantei testate sunt raportate in functie de procentele de mortalitate corespunzatoare.

Cand datele sunt adecvate, valoarea CL₅₀ si limitele de incredere (p = 0,05) trebuie determinate folosind metodele standard (Litchfield si Wilcoxon, 1949 pentru metoda echivalenta). CL₅₀ se exprima in mg de substanta de testat pe kg de substrat de testare (greutate uscata).

In acele cazuri in care panta curbei concentratiei este prea mare, pentru a permite calculul lui CL₅₀ este suficienta o estimare grafica a acestei valori.

Cand 2 concentratii consecutive intr-un raport de 1,8 dau numai 0% si 100% mortalitate, cele doua valori sunt suficiente pentru a indica domeniul in care se afla CL₅₀.

3. RAPORTAREA

3.1. Raportul de testare

Daca se poate, raportul de testare trebuie sa contina urmatoarele:

mentiunea ca testul a fost realizat in concordanta cu criteriile de calitate mentionate mai sus

testul realizat (testul de stabilire a valorilor care provoaca mortalitate si /sau testul definitiv)

- descrierea exacta a conditiilor de testare sau mentiunea ca testul a fost facut in concordanta cu metoda; trebuie raportate orice devieri

- descrierea exacta cum a fost amestecata substanta de testat in substratul de baza de testare.

- informatii despre organismele test (specii, varsta, media si gama de greutate, conditii de pastrare si crestere, furnizor)

- metoda folosita pentru determinarea CL₅₀

- rezultatele testului, inclusiv toate datele folosite

- descrierea simptomelor observate sau modificarilor de comportament ale organismelor test

- mortalitatea la controale

- CL₅₀ sau cea mai mare concentratie testata fara mortalitate si concentratia testata cea mai scazuta cu mortalitate de 100 % dupa 14 zile (si optional 7 zile) de la inceperea testului

- alcatuirea unei diagrame ce contine curba concentratie/raspuns

- rezultatele obtinute cu substanta de referinta, fie in asociatie cu testul prezent fie cu testele anterioare de control al calitatii.

A N E X A

Reproducerea si pastrarea ramelor inainte de testare

Pentru reproducerea organismelor, 30 pana la 50 de rame adulte sunt puse intr-o cutie cu substrat proaspat si scoase dupa 14 zile. Aceste organisme se pot folosi ulterior pentru alte serii de reproducere. Ramele scoase din coconi sunt folosite pentru testare cand sunt mature (in conditiile prescrise, dupa 2-3 luni).

Conditii de pastrare si reproducere

Camera climatica : temperatura 20^oC 2^oC de preferinta cu lumina continua (intensitatea
400 pana la 800 lux)

Cutii pentru crestere: vase suficient de adanci cu volumul de 10-20 l

Substrat Eisenia foetida se poate creste in diferite excremente animale. Se

recomanda sa se foloseasca ca mediu de reproducere un amestec de

50 % volum turba si 50 % balegar de vaca sau cal. Mediul trebuie

sa aiba o valoare a pH-ului de 6-7 (ajustata cu carbonat de calciu) si

o conductivitate ionica scazuta (mai putin de 6 mmhos sau 0,5 %

concentratie de sare)

Substratul trebuie sa fie umed, dar nu foarte ud.

Se pot folosi alte proceduri de succes pe langa metoda data mai

sus.

NOTA: Unii taxonomisti au impartit Eisenia foetida in doua specii (Bouche, 1972). Acestea sunt morfologic similare, dar una, Eisenia foetida foetida are niste dungi transversale tipice, pe anumite segmente si cealalta, Eisenia foetida andrei nu are aceste dungi si are o culoare rosiatica. Unde se poate, trebuie folosita Eisenia foetida andrei. Se pot folosi alte specii daca exista metodologia necesara.