Toxicitatea acuta la daphnia

TOXICITATEA ACUTA LA DAPHNIA

METODA

INTRODUCERE

Scopul acestei testari este de a determina concentratia medie efectiva inhibitoare (CE₅₀) a unei substante la Daphnia in apa dulce. Este de dorit sa avem, pe cat posibil, informatii legate de solubilitatea in apa, presiunea de vapori, stabilitatea chimica, constantele de disociere si biodegradabilitatea substantei inainte de inceperea testului.

Trebuie luate in considerare atat la planificarea testului, cat si la interpretarea rezultatelor, informatiile suplimentare (de exemplu: formula structurala, gradul de puritate, natura si procentul de impuritati semnificative, prezenta si cantitatea aditivilor si coeficientul de distributie n-octanol/apa).

DEFINITII SI UNITATI DE MASURA

Cerintele Directivei pentru CL₅₀ la Daphnia se considera indeplinite prin determinarea CE₅₀ conform metodei de testare descrisa in continuare.

Toxicitatea acuta este exprimata in aceasta testare ca fiind concentratia medie efectiva inhibitoare (CE₅₀). Aceasta este concentratia, in termenii valorilor initiale, care imobilizeaza 50 % din Daphnia dintr-un lot de testare intr-o perioada continua de expunere care trebuie sa fie stabilita.

Imobilizarea:

Acele organisme care nu pot sa inoate in 15 secunde dupa agitarea usoara a vasului de testare sunt considerate a fi imobile.

Toate concentratiile substantei de testat sunt exprimate in greutate pe volum (mg/l). Ele pot fi de asemenea exprimate ca greutate pe greutate (mg.kg^-1).

SUBSTANTELE DE REFERINTA

O substanta de referinta poate fi testata ca un mijloc de a demonstra ca in conditiile de testare din laborator raspunsul speciilor testate nu s-a schimbat semnificativ.

Sumarul rezultatelor testului interlaboratoare EEC, folosind patru substante diferite este dat in Anexa II.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CE₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Daphnia este expusa substantei de testat adaugata in apa intr-o gama de concentratii, timp de 48 ore. Daca se foloseste o testare mai scurta, trebuie sa se prezinte justificarea in raportul de testare.

Concentratiile diferite ale substantei testate in conditii identice, exercita efecte diferite asupra capacitatii de inot a Daphniei si conduc la procente diferite de imobilizare, Daphnia nemaifiind capabila sa inoate la sfarsitul testarii.

Concentratiile care produc imobilizarea 0 sau 100% provin direct din observatiile inregistrate in perioada de testare, in timp ce CE₅₀ - 48 ore se determina prin calcul, daca este posibil.

Pentru aceasta metoda este folosit un sistem static, deoarece solutiile de testat nu sunt reinnoite in timpul perioadei de expunere.

CRITERII DE CALITATE

Criteriile de calitate se aplica atat testului limita, cat si metodei testului complet.

In testele de control aplicate, imobilizarea nu trebuie sa depaseasca 10%, la sfarsitul testului.

Daphnia testata in loturile de control nu trebuie sa fi fost capturata de la suprafata apei.

Este de dorit ca, concentratia oxigenului dizolvat din vasul de testare sa se mentina la valori mai mari de 3 mg l^-1 pe toata durata testarii si sa nu scada in nici o situatie sub
2 mg l^-1.

Concentratiile substantei de testat se mentin in limita a 80% din concentratiile initiale pe toata durata testului.

Pentru substantele care se dizolva usor in apa de dilutie, rezultand solutii stabile, adica acelea care nu se volatilizeaza, degradeaza, hidrolizeaza sau adsorb intr-o masura semnificativa, concentratia initiala poate fi considerata echivalenta cu concentratia nominala. Se va face dovada ca au fost mentinute concentratiile pe toata durata testului si ca au fost satisfacute criteriile de calitate.

Pentru substantele care sunt:

i)        putin solubile in mediul de testare, sau

ii)      capabile sa formeze emulsii stabile sau dispersii, sau

iii)            instabile in solutii apoase,

concentratia initiala va fi considerata drept concentratia determinata analitic in solutie (sau, daca nu este posibil tehnic, masurata in coloana de apa) la inceputul testului. Concentratia se determina dupa o perioada de echilibrare, dar inainte de introducerea organismelor test.

In oricare din aceste cazuri, trebuie sa se efectueze determinari in timpul testarii pentru a confirma concentratiile reale de expunere sau respectarea criteriilor de calitate.

Valoarea pH-ului nu trebuie sa varieze cu mai mult de o unitate.

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.1. Reactivi

Solutiile substantelor de testat

Solutiile stoc de concentratia necesara sunt preparate prin dizolvarea substantei in apa deionizata sau in apa pregatita conform pct.1.6.1.2.

Concentratiile de testat alese sunt preparate prin diluarea solutiei stoc. Daca sunt testate concentratii mai ridicate, cantitati corespunzatoare din substanta de testat pot fi solubilizate direct in apa de dilutie.

In mod normal, substantele trebuie sa fie testate numai pana la limita solubilitatii.

Pentru unele substante (de exemplu, substantele putin solubile in apa sau substantele cu P_ow ridicat, sau cele care formeaza o dispersie stabila mai degraba decat o solutie reala in apa), se accepta sa se foloseasca o concentratie de testat deasupra limitei de solubilitate a substantei, pentru a ne asigura ca s-a obtinut concentratia maxima solubila/stabila. Este totusi important ca aceasta concentratie sa nu perturbe in alt fel sistemul de testare (de exemplu: formarea unei pelicule de substanta pe suprafata apei care sa impiedice oxigenarea apei, etc).

Pentru a prepara solutiile stoc ale substantelor cu solubilitate scazuta in apa sau pentru a ajuta dispersia acestor substante in apa de dilutie se pot folosi: dispersia cu ultrasunete, solventi organici, emulgatori sau agenti de dispersie. Cand se folosesc astfel de substante auxiliare, toate solutiile de testat trebuie sa contina aceeasi cantitate de substanta auxiliara, iar lotul de control trebuie sa fie expus la aceeasi concentratie a substantei auxiliare ca cea folosita in seriile de testare.

Concentratia unor astfel de substante auxiliare trebuie minimalizata, si in nici un caz nu trebuie sa depaseasca 100 mg/l.

Testul trebuie efectuat fara ajustarea pH-ului. Daca exista dovada unei schimbari pronuntate a pH-ului se recomanda ca testarea sa se repete dupa ajustarea pH-ului, iar rezultatele trebuie raportate. In acest caz, valoarea pH-ului solutiei stoc trebuie ajustata la valoarea pH-ului apei de dilutie daca nu exista indicatii speciale pentru a nu face acest lucru. In acest scop sunt preferate HCl si NaOH. Aceasta ajustare a pH-ului trebuie sa fie    facuta astfel incat concentratia substantei de testat din solutia stoc sa nu se schimbe in mod semnificativ. Daca in urma acestei corectii de pH are loc o reactie chimica sau precipitarea fizica a substantei de testat, acest lucru trebuie raportat.

1.6.1.2 Apa de dilutie

In aceasta testare se foloseste apa reconstituita [a se vedea Anexa I si Referinta (2): ISO 6341]. Pentru a evita necesitatea aclimatizarii inainte de testare se recomanda ca apa de cultura sa aiba aceeasi calitate (pH, duritate) ca apa folosita pentru dilutie.

Aparatura

Trebuie sa fie folosite aparatura si echipamente normale de laborator. Echipamentele care vin in contact cu solutiile de testat este de preferat sa fie confectionate in intregime din sticla:

oxigenometru (cu microelectrod sau alt echipament adecvat pentru masurarea oxigenului dizolvat in probele cu volum mic),

aparatura adecvata pentru controlul temperaturii,

pH metru,

echipament pentru determinarea duritatii apei.

Organisme test

Specia de testare preferata este Daphnia magna desi este permisa si Daphnia pulex. Organismele test trebuie sa fie in varsta de mai putin de 24 ore la inceputul testarii, crescute in laborator, fara boli evidente si cu un istoric cunoscut (de exemplu, crestere-pretratare, etc).

Procedeul de testare

Un test preliminar poate preceda testul final pentru a obtine informatii legate de intervalul de concentratii ce vor fi folosite in testul final.

In plus fata de testele experimentale, se efectueaza un test de control fara substanta de testat si daca este relevant se efectueaza si un test de control care sa contina substanta auxiliara.

Daphnia este expusa substantei conform celor descrise mai jos:

durata: de preferinta 48 ore;

numarul de organisme: cel putin 20 pentru fiecare concentratie de testat, de preferinta
impartit in patru loturi a cate 5 exemplare fiecare sau doua
loturi de 10 exemplare;

trebuie prevazut volumul de apa astfel incat sa asigure cel putin 2 ml solutie de testat pentru fiecare organism;

concentratia de testat: solutia de testat trebuie preparata inainte de introducerea
Daphniei, de preferinta fara a folosi vreun solvent, altul decat
apa. Concentratiile se aleg in serie geometrica, intr-un raport
de concentratii care sa nu depaseasca 2,2. Concentratiile
care determina imobilizare de 0 si 100 % dupa 48 ore si o
gama de grade intermediare de imobilizari care permit
calcularea lui CE₅₀ la 48 ore, trebuie testate in acelasi timp cu
efectuarea testelor de control;

apa: a se vedea pct. 1.6.1.2;

lumina: ciclul lumina-intuneric este optional;

temperatura: temperatura de testare trebuie sa fie intre 18-22 sC, iar pentru fiecare
test trebuie sa fie constanta in limita a ± 1sC;

aerare: solutiile de testat nu trebuie aerate cu bule;

hranire: nu se administreaza hrana.

La sfarsitul testarii trebuie masurate pH-ul si concentratia oxigenului in solutiile de control si in toate solutiile de testat; pH-ul solutiilor de testat n-ar trebui sa se modifice.

Compusii volatili trebuie testati in vase umplute complet si inchise si suficient de mari pentru a impiedica lipsa oxigenului.

Daphnia este observata cel putin dupa 24 ore de expunere si din nou dupa 48 ore.

Test limita

Folosind procedurile descrise in aceasta metoda de testare, se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CE₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Daca natura substantei nu permite atingerea concentratiei de 100 mg/l in solutia de testat, testul limita trebuie sa fie efectuat la o concentratie egala cu solubilitatea substantei (sau concentratia maxima pentru formarea unei dispersii stabile) in mediul folosit (a se vedea si punctul 1.6.1.1.).

Testul    limita trebuie efectuat folosind 20 de exemplare de Daphnia, impartite in doua sau patru loturi. Numarul organismelor dintr-un lot se va regasi si in testele de control. Daca apar imobilizari trebuie sa se efectueze un studiu complet.

DATE SI EVALUARE

Pentru fiecare perioada in care s-au inregistrat observatii (24, 48 ore), se reprezinta grafic imobilizarea exprimata in procente, in functie de concentratie, pe o hartie logaritmica.

Cand este posibil, pentru fiecare perioada de observare trebuie sa se estimeze CE₅₀ si limitele de incredere (p=0,05) folosind procedeele standard; aceste valori trebuie rotunjite la 1 sau cel mult 2 cifre semnificative (exemple de rotunjire la 2 cifre: 170 pentru 173,5; 0,13 pentru 0,127; 1,2 pentru 1,21).

In cazul in care panta curbei de raspuns concentratie/procentaj este prea abrupta pentru a permite calcularea lui CE₅₀, este suficienta estimarea grafica a acestei valori.

Cand doua concentratii consecutive intr-un raport de 2,2 dau numai 0 si 100 % imobilizare, aceste doua valori sunt suficiente pentru a indica intervalul in care se situeaza CE₅₀.

Daca se observa ca stabilitatea sau omogenitatea substantei de testat nu pot fi mentinute, acest lucru trebuie raportat si interpretarea rezultatelor trebuie facuta cu grija.

RAPORTAREA

Raportul de testare va include, daca este posibil, urmatoarele informatii:

informatii despre organismul test (denumirea stiintifica, specia, furnizorul sau sursa, orice pretratare, metoda de crestere, inclusiv sursa, felul si cantitatea alimentelor, frecventa alimentarii );

sursa apei de dilutie si caracteristicile chimice principale (pH, duritate, temperatura);

in cazul unei substante putin solubile in apa, metoda de preparare a solutiei stoc si a solutiilor de testat;

concentratia oricaror substante auxiliare;

lista concentratiilor folosite si orice informatii disponibile legate de stabilitatea    substantelor chimice testate la concentratiile din solutiile de testat;

daca sunt efectuate analizele chimice, metodele folosite si rezultatele obtinute;

rezultatele testului limita daca a fost efectuat;

descrierea echipamentului de testare;

regimul de iluminare;

concentratiile de oxigen dizolvat, valorile pH-ului si temperaturilor solutiilor de testat;

dovada indeplinirii criteriilor de calitate;

tabelul care prezinta imobilizarea cumulata pentru fiecare concentratie testata si inregistrarile de control (inclusiv pentru testul cu substanta auxiliara, daca este cazul) efectuate pentru fiecare perioada de observare recomandata (24 si 48 ore);

graficul curbei de raspuns concentratie/procentaj la sfarsitul testarii;

daca e posibil, valorile CE₅₀ la fiecare perioada de observare recomandata (cu limite de incredere de 95%);

procedeele statistice folosite pentru determinarea valorilor CE₅₀ ;

daca s-a folosit o substanta de referinta, rezultatele obtinute;

cea mai ridicata concentratie de testat care nu provoaca imobilizarea in timpul perioadei de testare;

cea mai scazuta concentratie de testat care provoaca imobilizare 100 % in timpul perioadei de testare.

BIBLIOGRAFIE

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202, Decision of the Council C (81) 30 final and updates.

International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989

AFNOR - Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera -crustacea) NFT 90 301 ( January 1983)

Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje,R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986

DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (11)

Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay, Griffin, Waycombe, U.K. 1978

Litchfield, J.T and Wilcoxon, F.A. simplified method of evaluating dose effect experiments, J.Pharmacol. and Exper. Therap, 1949, vol 99-113

Sprague J.B., Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol 3, 793-821

Sprague J.B., Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol.4, 3-32

Stephan C.E, Methods for calculating an LC₅₀. In Aquatic Toxicology and Hayard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM 1977, STP 634, 65-84

Stephan C.E, Busch K.A, Smith R., Burke, J. and Andrews R.W. A computer program for calculating an LC₅₀. US EPA.

Anexa 1

Apa reconstituita

Exemplul unei ape de dilutie adecvata ( conform ISO 6341)

Toate sustantele chimice trebuie sa fie de calitate analitica.

Apa trebuie sa fie apa distilata de calitate buna, sau apa deionizata cu o conductibilitate mai mica de 5 µScm^-1.

Aparatura pentru distilarea apei nu trebuie sa contina nici o piesa din cupru.

Apa de dilutie reconstituita

Se adauga cate 25 ml din cele 4 solutii stoc si se completeaza pana la 1 litru cu apa.

Se aereaza pana cand concentratia oxigenului dizolvat este egala cu valoarea de saturatie cu oxigen.

pH-ul trebuie sa fie 7,8 ± 0,2.

Daca este necesar se ajusteaza pH-ul cu NaOH (hidroxid de sodiu) sau HCl (acid clorhidric).

Apa de dilutie preparata astfel este lasata in repaos cca. 12 ore si nu mai trebuie aerata.

Suma ionilor de Ca si Mg in aceasta solutie este 2,5 mmol / l. Raportul ionilor Ca:Mg este 4:1 si al ionilor Na:K este 10:1.Alcalinitatea totala a acestei solutii este 0,8 mmol /l.

Orice modificare a prepararii apei de dilutie nu trebuie sa schimbe compozitia sau proprietatile apei.

Anexa 2

Sumarul rezultatelor testarii interlaboratoare EEC efectuate in 1978

[ de asemenea citat in referinta (2)]

Atentie: scopul acestei testari interlaboratoare a fost de a determina CE₅₀ la 24 ore.

Substantele utilizate:

Dicromat de potasiu

Acid tetrapropilbenzensulfonic

Acid tetrapropilbenzensulfonic, sare de sodiu

Acid tricloro-2,4,5-fenoxiacetic, sare de potasiu

Anexa 3

Exemplu de inregistrare grafica: concentratie / procent de imobilizare

Exemplu de determinare a CE₅₀ folosind hartie logaritmica

Imobilizare in %