TRANSFORMARI AEROBE SI ANAEROBE IN SOL

METODA

Aceasta metoda de testare reia testul OCDE TG 307 (2002).

INTRODUCERE

Aceasta metoda de testare se bazeaza pe liniile directoare existente (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Metoda descrisa in continuare a fost elaborata pentru masurarea transformarilor aerobe si anaerobe ale substantelor chimice in sol. Scopul experimentelor este acela de a determina (i) rata de transformare a substantei de testat si (ii) natura si ratele de formare si de epuizare ale produsilor de transformare la care pot fi expuse plantele si organismele din sol. Aceste studii sunt necesare pentru substantele chimice aplicate direct pe sol sau susceptibile sa ajunga in mediul din sol. Rezultatele acestor studii de laborator pot fi, de asemenea, utilizate pentru elaborarea de protocoale de prelevare de probe si de analiza pentru studii din domenii inrudite.

In general, pentru evaluarea cailor de transformare este suficienta realizarea de studii aerobe si anaerobe pe un singur tip de sol (8)(10)(11). Ratele de transformare se determina pentru inca cel putin trei alte soluri (8)(10).

Numarul si tipul solurilor utilizate in cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului si a sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, in 1995 (10). Tipurile de sol testate trebuie sa fie reprezentative pentru conditiile de mediu in care va fi utilizata sau eliberata substanta. De exemplu, substantele chimice eliberate intr-un climat subtropical sau tropical se testeaza cu Ferrasols sau Nitosols (sistemul FAO). In cadrul atelierului de lucru au fost de asemenea formulate recomandari privind prelevarea, manipularea si depozitarea probelor de sol bazate pe liniile directoare ISO (15). In cadrul acestei metode se studiaza si utilizarea solurilor de orezarie.

DEFINITII

Substanta de testat orice substanta, indiferent daca este vorba despre substanta mama sau despre produsii de transformare relevanti.

Produsi de transformare: toate substantele rezultate din reactiile biotice sau abiotice de transformare a substantei de testat, in special CO₂ si produsii din reziduurile legate.

Reziduuri legate: "reziduurile legate" sunt compusi vegetali sau animali din sol, care persista in matrice dupa extractie sub forma substantei mama sau a metabolitului(metabolitilor)/produsilor de transformare ai acesteia. Metoda de extractie nu trebuie sa modifice considerabil compusii insisi sau structura matricei. Natura legaturii poate fi determinata partial prin metode de extractie care modifica matricea si prin tehnici analitice complexe. Pana in prezent a fost identificata in acest mod natura legaturilor covalente, ionice, de sorbtie si de captare. In general, formarea reziduurilor legate reduce bioaccesibilitatea si biodisponibilitatea in mod considerabil (12) [modificare IUPAC 1984 (13)].

Transformare aeroba: reactie care se produce in prezenta oxigenului molecular (14).

Transformare anaeroba: reactie care se produce in absenta oxigenului molecular (14).

Sol: este un amestec de constituenti chimici minerali si organici, acestia din urma continand compusi cu un continut ridicat de carbon si azot si cu masa moleculara mare, care contin mici organisme (in special microorganisme). Solul poate fi manipulat in doua forme:

(a)        nederanjat, asa cum s-a format in timp, in straturile caracteristice unui numar mare de tipuri de sol;

(b)        deranjat, asa cum se gaseste de obicei pe terenurile arabile cand probele se preleveaza prin sapare si se folosesc in cadrul prezentei metode de testare (14).

Mineralizare: degradarea completa a unui compus organic in CO₂ si H₂O in conditii aerobe si in CH₄, CO₂ si H₂O in conditii anaerobe. In cadrul prezentei metode de testare, daca se foloseste un compus marcat cu ¹⁴C, mineralizare inseamna o degradare considerabila pe parcursul careia un atom de carbon marcat este oxidat, degajandu-se o cantitate adecvata de ¹⁴CO₂ (14).

Timp de injumatatire: t_0,5 este timpul necesar pentru transformarea a 50% dintr-o substanta de testat in cazul transformarilor care pot fi descrise printr-o cinetica de prim ordin; nu depinde de concentratie.

DT₅₀ (timp de degradare 50): este timpul in care concentratia substantei de testat se reduce cu 50%; difera de timpul de injumatatire t_0,5 daca transformarea nu respecta o cinetica de prim ordin.

DT₇₅ (timp de degradare 75): este timpul in care concentratia substantei de testat se reduce cu 75%.

DT₉₀ (timp de degradare 90): este timpul in care concentratia substantei de testat se reduce cu 90%.

SUBSTANTE DE REFERINTA

Substantele de referinta se folosesc pentru caracterizarea si/sau identificarea produsilor de transformare prin metode spectroscopice si cromatografice.

APLICABILITATEA TESTULUI

Metoda se aplica tuturor substantelor chimice (nemarcate sau marcate radioactiv) pentru care se poate utiliza o metoda analitica cu o precizie si o sensibilitate suficienta. Se aplica pentru compusii usor volatili, nevolatili, solubili sau insolubili in apa. Testul nu se aplica substantelor chimice puternic volatile in sol (de exemplu fumiganti, solventi organici) care de aceea nu pot fi mentinute in sol in conditiile experimentale din cadrul acestui test.

INFORMATII PRIVIND SUBSTANTA DE TESTAT

Pentru masurarea ratei de transformare se poate utiliza o substanta de testat marcata sau nemarcata. Materialul marcat este necesar pentru studierea cailor de transformare si pentru stabilirea bilantului masic. Se recomanda marcarea cu ¹⁴C dar poate fi utila si utilizarea altor izotopi cum sunt ¹³C, ¹⁵N, ³H, ³²P. In masura in care este posibil, marcajul se amplaseaza in partea(partile) cea(cele) mai stabila(stabile)ale moleculei[1]. Puritatea substantei de testat trebuie sa fie de cel putin 95%.

Inainte de efectuarea unui test de transformare aeroba sau anaeroba in sol, sunt necesare urmatoarele informatii privind substanta de testat:

(a)        solubilitatea in apa (Metoda A.6);

(b)        solubilitatea in solventi organici;

(c)        presiunea vaporilor (Metoda A.4) si constanta lui Henry;

(d)        coeficientul de impartire n-octanol/apa (Metoda A.8);

(e)        stabilitatea chimica la intuneric (hidroliza) (Metoda C.7);

(f)         coeficientul pK_a daca este posibil ca o molecula sa fie supusa unei protonari sau deprotonari (Linia directoare 112 a OECD ) (16).

Este posibil sa fie utile si informatii privind toxicitatea substantei de testat asupra microorganismelor din sol ‌(Metodele de testare C.21 si C.22 ) (16).

Trebuie sa fie disponibile metode analitice (inclusiv metode de extractie si de purificare) necesare pentru cuantificarea si identificarea substantei de testat si a produsilor de transformare ai acesteia.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Probele de sol se trateaza cu substanta de testat si se incubeaza la intuneric in baloane de tip biometric sau in sisteme cu circulatie continua in conditii de laborator controlate (la temperatura si umiditate constanta). Dupa un interval de timp adecvat, se extrag si se analizeaza probele de sol in vederea masurarii substantei mama si a produsilor de transformare. Si produsii volatili se colecteaza in vederea efectuarii unei analize cu ajutorul unor dispozitive de absorbtie adecvate. Cu ajutorul materialului marcat cu ¹⁴C se pot masura diferitele rate de mineralizare a substantei de testat prin captarea ¹⁴CO₂ degajat si se poate stabili bilantul masic, inclusiv formarea reziduurilor legate de sol.

CRITERII DE CALITATE

Recuperare

Extractia si analizarea probelor de sol, cel putin in duplicat, imediat dupa adaugarea substantei de testat, ofera o prima indicatie privind repetabilitatea metodei analitice si uniformitatea procedurii de aplicare a substantei de testat. Ratele de recuperare din etapele ulterioare ale experimentelor sunt furnizate de bilanturile masice respective. Aceste rate de recuperare variaza intre 90% si 110% pentru substantele chimice marcate (8) si intre 70% si 110% pentru substantele chimice nemarcate (3).

Repetabilitatea si sensibilitatea metodei analitice

Repetabilitatea metodei analitice (cu exceptia randamentului extractiei initiale) in ceea ce priveste cuantificarea substantei de testat si a produsilor de transformare se poate controla prin efectuarea unei analize duplicat pe acelasi extract de sol, incubat suficient timp pentru a se forma produsii de transformare.

Pragul de detectie (LOD) a substantei de testat si a produsilor de transformare din cadrul metodei analitice trebuie sa fie de cel putin 0,01 mg·kg^-1 (substanta de testat) in sol sau de 1% din doza aplicata, respectiv valoarea mai mica dintre acestea. Se precizeaza si pragul de cuantificare (LOQ).

Precizia datelor privind transformarea

Analiza de regresie a concentratiilor substantei de testat in functie de timp ofera informatii adecvate privind fiabilitatea curbei de transformare si calcularea pragurilor de incredere pentru timpii de injumatatire (in cazurile de cinetica de pseudo prim ordin) sau a valorilor DT₅₀ si, daca este cazul, a valorilor DT₇₅ si DT₉₀.

DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Echipament si reactivi chimici

Incubatoarele sunt formate din circuite statice inchise sau din sisteme cu circulatie continua (7)(17). In figurile 1 si 2 sunt prezentate exemple de incubatoare cu circulatie continua si de baloane de tip biometric. Ambele tipuri de incubatoare prezinta avantaje si inconveniente(7)(17).

Este necesar echipament standard de laborator, in special urmatoarele:

Instrumente de analiza cum sunt: cromatografie in faza gazoasa sau lichida (GLC), cromatografie in faza lichida de inalta performanta (HPLC), echipament TLC, inclusiv sisteme adecvate pentru analiza substantelor marcate radioactiv si a substantelor nemarcate sau metoda dilutiei izotopice inverse;

Instrumente de identificare (de exemplu MS, GC-MS, HPLC-MS, RMN etc.).

Contor de scintilatie lichid;

Aparat de oxidare pentru combustia materialului radioactiv;

Centrifuga;

Aparat de extractie (de exemplu tuburi de centrifugare pentru extractia la rece si aparat Soxhlet pentru extractia continua sub reflux);

Instrumente pentru concentrarea solutiilor si a extractelor (evaporator rotativ);

Baie de aburi;

Dispozitiv mecanic de amestecare (de exemplu malaxor, amestecator rotativ).

Printre reactivii chimici utilizati se numara, de exemplu:

NaOH, puritate analitica, 2 moli · dm^-3, sau alta baza adecvata (de exemplu KOH, etanolamina);

H₂SO₄, puritate analitica, 0,05 moli · dm^-3,

Etilen glicol, puritate analitica;

Materiale de absorbtie solide, de exemplu var sodat sau tampoane poliuretanice;

Solventi organici, puritate analitica, cum sunt acetona, metanolul etc.;

Lichid de scintilatie.

Aplicarea substantei de testat

Substanta de testat se poate dizolva in apa (deionizata sau distilata) in vederea incorporarii sau a distribuirii in sol, sau, daca este necesar, se poate dizolva intr-o cantitate minima de acetona sau de alti solventi organici (6) daca este suficient de solubila si de stabila. Cu toate acestea, cantitatea de solvent selectata nu trebuie sa aiba o influenta semnificativa asupra activitatii microbiene din sol (vezi sectiunile 1.5 si 1.9.2-1.9.3). Trebuie evitata utilizarea unor solventi care inhiba activitatea microbiana cum sunt cloroformul, diclormetanul si alti solventi halogenati.

Substanta de testat se poate adauga si sub forma solida, amestecata cu nisip cuartos (6) sau intr-o subproba de sol uscat cu aer si sterilizata de mici dimensiuni. Daca substanta de testat se adauga cu ajutorul unui solvent, acesta se lasa sa se evaporeze inainte ca subproba tratata sa fie adaugata in proba initiala de sol nesterila.

In cazul substantelor chimice obisnuite, pentru care principala cale de patrundere in sol este prin namolul de epurare sau prin tratamente agricole, se incepe prin adaugarea substantei de testat in namol, care se introduce apoi in proba de sol. (vezi sectiunile 1.9.2 si 1.9.3)

Nu se recomanda utilizarea de materiale preparate in mod sistematic. Cu toate acestea, de exemplu in cazul substantelor putin solubile, utilizarea de materiale preparate poate fi o solutie buna.

Soluri

Selectarea solurilor

Pentru determinarea caii de transformare se poate utiliza un sol reprezentativ; se recomanda argila nisipoasa sau lutul nisipos fin sau argila sau nisipul lutos [conform clasificarii FAO si USDA (18)] cu un pH de 5,5-8,0, cu continut de carbon organic de 0,5-2,5% si cu o biomasa microbiana de cel putin 1% din carbonul organic total (10).

Pentru studiile privind ratele de transformare se folosesc cel putin trei soluri suplimentare reprezentative pentru gama de soluri in cauza. Solurile trebuie sa aiba pH-uri, continuturi de argila si biomase microbiene diferite (10).

Toate solurile se clasifica, cel putin din punctul de vedere al texturii (% nisip,    aluviuni, % argila) [conform clasificarii FAO si USDA (18)], al pH-ului, al capacitatii de schimb de cationi, al densitatii aparente, al caracteristicilor de retinere a apei si al biomasei microbiene (numai pentru studiile aerobe). Pentru interpretarea rezultatelor pot fi utile informatii suplimentare privind proprietatile solului. Pentru determinarea caracteristicilor solului se pot utiliza metodele recomandate la referinte (19)(20)(21)(22)(23). Masa microbiana se determina prin metoda respiratiei induse de substrat (SIR) (25)(26) sau prin metode alternative (20).

Prelevarea, manipularea si depozitarea solurilor

Se furnizeaza informatii detaliate privind istoricul locului din care se preleveaza solul testat. Aceste informatii includ localizarea exacta, acoperirea vegetala, date privind tratamentele cu substante chimice, cu ingrasaminte organice si anorganice, adaosurile de material biologic sau alte contaminari. Solurile tratate cu substanta de testat sau cu substante cu structura analoga pe parcursul ultimilor patru ani nu se folosesc in studiile de transformare (10)(15).

Solurile utilizate trebuie sa fie proaspat prelevate de pe teren (din orizontul A sau din stratul de 20 cm de la suprafata), si trebuie sa aiba un continut de apa care faciliteaza cernerea. Pentru alte soluri decat cele de orezarie, se va evite prelevarea de probe in tipul sau imediat dupa perioadele lungi (> 30 zile) de seceta, de inghet sau de inundatii (14). Probele se transporta astfel incat sa se reduca la minimum modificarile continutului de apa din sol si se pastreaza la intuneric, asigurandu-se circulatia libera a aerului in cea mai mare masura posibil. In acest sens este in general adecvata o punga de polietilena care nu se inchide ermetic.

Solul se prelucreaza cat mai repede posibil dupa prelevare. Se scot resturile vegetale, animale si pietrele mari inainte de cernerea solului printr-o sita cu ochiuri de 2 mm care retine pietrele si resturile vegetale si animale de mici dimensiuni. Se va evita uscarea si macinarea solului inainte de cernere (15).

In timpul iernii, cand prelevarea de pe teren este dificila (sol inghetat sau acoperit cu straturi de zapada) probele se pot preleva dintr-un lot de sol depozitat intr-o sera cu acoperire vegetala (de exemplu un amestec de iarba si trifoi). Sunt preferate in mod evident studiile efectuate pe sol proaspat prelevat, dar daca solul prelevat si prelucrat trebuie depozitat inainte de initierea studiului, conditiile de depozitare trebuie sa fie adecvate iar depozitarea sa se realizeze pe parcursul unei perioade limitate (4+2sC timp de maximum trei luni) pentru mentinerea activitatii microbiene.[3] Referintele (8)(10)(15)(26)(27) contin instructiuni detaliate privind prelevarea, manipularea si depozitarea solurilor utilizate in cadrul experimentelor de biotransformare.

Inainte de a fi utilizat in cadrul acestui test, solul tratat se pre-incubeaza pentru a permite germinarea si eliminarea semintelor si restabilirea echilibrului metabolismului microbian dupa trecerea de la conditiile de prelevare sau de depozitare la conditiile de incubare. In general este adecvat sa se prevada o perioada de pre-incubare de 2 pana la 28 de zile, aproximativ in conditiile de temperatura si de umiditate din cadrul testului real (15). In general durata de depozitare si de pre-incubare insumate nu trebuie sa depaseasca trei luni.

EFECTUAREA TESTULUI

Conditii de testare

Temperatura de testare

Pe parcursul intregii perioade de testare, solurile se incubeaza la intuneric, la o temperatura constanta reprezentativa pentru conditiile climatice in care va fi utilizata sau eliberata substanta. Pentru toate substantele testate care ajung in sol in climat temperat se recomanda o temperatura de 20+2sC. Temperatura se monitorizeaza.

In cazul substantelor aplicate sau eliberate intr-un climat mai rece (de exemplu in tarile nordice, in perioade de toamna/iarna), se incubeaza probe suplimentare de sol la o temperatura mai mica (de exemplu 10+2sC).

Continutul de umiditate

Pentru testele de transformare in mediu aerob, continutul de umiditate al solului[4] se ajusteaza si se mentine la un pF cuprins intre 2,0 si 2,5 (3). Continutul de umiditate al solului se exprima ca masa de apa pe masa de sol uscat si se controleaza in mod regulat (de exemplu la intervale de 2 saptamani) prin cantarirea balonului de incubare, iar pierderile de apa se compenseaza prin adaugarea de apa (de preferinta apa de la robinet sterilizata prin filtrare). Pierderile de substanta de testat si/sau de produsi de transformare prin volatilizare si/sau fotodegradare (daca este cazul) produse cand se adauga apa se vor evita sau se vor reduce la minimum.

Pentru testele de transformare in conditii aerobe si de orezarie solul se satureaza cu apa prin inundare.

Conditii aerobe de incubare

In sistemele cu circulatie continua conditiile aerobe se mentin prin spalare intermitenta sau ventilare cu aer umezit. In baloanele de tip biometric, schimbul de aer se realizeaza prin difuziune.

Conditii aerobe sterile

Pentru obtinerea de informatii privind importanta transformarii abiotice a unei substante de testat probele de sol pot fi sterilizate (pentru metode de sterilizare vezi referintele 16 si 29), tratate cu o substanta de testat sterila (de exemplu prin adaugarea de solutie printr-un filtru steril) si aerate cu aer steril umed dupa cum se arata in sectiunea 1.9.1.3. In cazul solurilor de orezarie, solul si apa se sterilizeaza, iar incubarea se efectueaza dupa cum se arata in sectiunea 1.9.1.6.

Conditii anaerobe de incubare

Pentru crearea si mentinerea conditiilor anaerobe, solul tratat cu substanta de testat si incubat in conditii aerobe timp de 30 de zile sau pe parcursul unei perioade egale cu timpul de injumatatire sau cu DT₅₀ (aceea dintre ele care este mai scurta) se acopera apoi cu apa (strat de apa de 1-3 cm), iar sistemul de incubare se clateste cu un gaz inert (de exemplu azot sau argon).[5] Sistemul de testare trebuie sa permita masurarea pH-ului, a concentratiei de oxigen si a potentialului redox si sa contina dispozitive de captare a produsilor volatili. Sistemul de tip biometric trebuie sa fie inchis pentru a evita orice intrare a aerului prin difuziune.

Conditii de incubare in solurile de orezarie

Pentru studierea transformarii in solurile de orezarie, solul se inunda cu un strat de apa de 1-5 cm iar substanta de testat se introduce in faza apoasa (9). Se recomanda ca adancimea stratului de sol sa fie de cel putin 5 cm. Sistemul se ventileaza cu aer ca si in conditii aerobe. Se supravegheaza si se inregistreaza pH-ul, concentratia de oxigen si potentialul redox al stratului de apa. Inainte de inceperea studiilor de transformare este necesara o perioada de preincubare de cel putin doua saptamani (vezi sectiunea 1.8.3.2).

Durata testului

In general, studiile privind rata si caile de transformare nu trebuie sa depaseasca 120 de zile[6] (3)(6)(8), deoarece dupa acest termen sistemele artificiale de laborator in care nu se produce o reconstituire naturala sunt afectate in timp de o scadere a activitatii microbiene din sol. Daca este necesara o caracterizare a epuizarii substantei de testat si a formarii si epuizarii principalilor produsi de transformare, studiile pot fi continuate pe parcursul unor perioade mai lungi (de exemplu intre 6 si 12 luni) (8). Daca se folosesc perioade de incubatie mai lungi, acestea trebuie justificate in raportul de testare si trebuie mentionate masuratorile biomasei efectuate in timpul si la sfarsitul acestor perioade.

Efectuarea testului

Se introduc 50 pana la 200 g de sol (greutate uscata) in fiecare balon de incubare (vezi Figurile 1 si 2 din anexa 3) si se trateaza cu substanta de testat cu ajutorul uneia dintre metodele descrise in sectiunea 1.8.2. Daca pentru aplicarea substantei de testat se folosesc solventi organici, acestia se elimina din sol prin evaporare. In continuare, solul se mesteca bine cu o spatula si/sau prin agitarea balonului. Daca studiul se desfasoara in conditii de orezarie, solul si apa se amesteca bine dupa aplicarea substantei de testat. Se analizeaza substanta de testat prezenta in parti alicote mici (de exemplu 1 g) din solurile tratate pentru a verifica daca repartizarea este uniforma. In continuare este prezentata o metoda alternativa.

Tratamentul aplicat trebuie sa corespunda celei mai mari rate de aplicare a produsului fitosanitar recomandate in instructiunile de utilizare si sa poata fi incorporat uniform si la o adancime adecvata in sol (de exemplu in stratul[7] format de primii 10 cm de la suprafata solului). De exemplu, pentru substantele chimice aplicate pe frunze sau pe sol care nu sunt incorporate in sol, adancimea adecvata pentru calcularea cantitatii de substanta chimica de adaugat in fiecare balon este de 2,5 cm. Pentru substantele chimice incorporate in sol, adancimea adecvata este adancimea de incorporare mentionata in instructiunile de utilizare. Pentru substantele chimice obisnuite, doza aplicata se estimeaza avand in vedere cea mai relevanta cale de intrare; de exemplu, daca cea mai relevanta cale de intrare in sol este prin namoluri de epurare, substanta chimica se dozeaza in namol intr-o concentratie egala cu concentratia anticipata din namol, iar cantitatea de namol adaugata in sol trebuie sa fi egala cu cantitatea de namol adaugata in mod obisnuit in solurile agricole. Daca aceasta concentratie nu este suficient de ridicata pentru identificarea principalilor produsi de transformare, este utila incubarea unor probe de sol separate care contin rate mai mari de substanta, dar trebuie evitate ratele excesive care influenteaza functiile microbiene ale solului (vezi sectiunile 1.5 si 1.8.2).

Ca alternativa, se poate trata un lot mai mare de sol (1 pana la 2 kg) cu substanta de testat, amestecandu-se bine intr-un malaxor adecvat, si se transfera parti mici de 50 pana la 200 g in baloane de incubare (de exemplu cu ajutorul unor repartitoare de probe). Se analizeaza parti alicote mici (de exemplu de 1 g) din lotul de sol tratat pentru a verifica daca repartizarea substantei de testat este uniforma. Aceasta procedura este preferabila, deoarece permite o repartizare mai uniforma a substantei de testat in sol.

Se incubeaza si probe de sol netratate in aceleasi conditii (aerobe) ca si probele tratate cu substanta de testat. Aceste probe se utilizeaza pentru masurarea biomasei pe parcursul studiilor si la finalul acestora.

Daca substanta de testat se aplica pe sol dizolvata in unul sau mai multi solventi organici, se incubeaza probe de sol tratate cu aceeasi cantitate de solvent sau solventi in aceleasi conditii (aerobe) ca si probele tratate cu substanta de testat. Aceste probe se folosesc pentru masurarea biomasei la inceputul, in timpul si la finalul studiilor pentru a se verifica efectele solventului sau solventilor asupra biomasei microbiene.

Baloanele care contin sol tratat se conecteaza la un sistem cu circulatie continua de tipul celui descris in Figura 1 sau se inchid cu o coloana de absorbtie de tipul celei prezentate in Figura 2 (vezi anexa 3).

Prelevare de probe si masuratori

Se scot baloane de incubare duplicat la intervale adecvate si se extrag probele de sol cu ajutorul unor solventi adecvati cu polaritate diferita si se analizeaza in vederea masurarii substantei de testat si/sau a produsilor de transformare. Un studiu bine proiectat include suficiente baloane pentru ca doua dintre acestea sa poata fi sacrificate la fiecare prelevare. De asemenea, se scot solutii de absorbtie sau materiale solide de absorbtie la diferite intervale de timp (la intervale de 7 zile in prima luna, iar apoi la intervale de 17 zile) pe parcursul si la sfarsitul perioadei de incubare a fiecarei probe de sol si se analizeaza produsii volatili. De altfel, pe langa proba de sol prelevata direct dupa aplicare (proba din ziua 0) trebuie sa mai existe cel putin 5 puncte suplimentare de prelevare. Intervalele de timp se aleg astfel incat sa se poata determina modelul de epuizare pentru substanta de testat si modelele de formare si de epuizare a produsilor de transformare (de exemplu zilele 0, 1, 3, 7; 2, 3 saptamani; 1, 2, 3 luni etc.).

Daca substanta de testat este marcata cu ¹⁴C, radioactivitatea neextractibila se cuantifica prin combustie si se calculeaza un bilant masic pentru fiecare interval de prelevare.

In cazul incubarii anaerobe sau in mediu de orezarie, faza de sol si faza apoasa se analizeaza impreuna in vederea masurarii substantei de testat, iar produsii de transformare se separa prin filtrare sau centrifugare inainte de extractie si de analizare.

Teste facultative

Studiile aerobe nesterile la alte temperaturi si umiditati ale solului pot fi utile pentru estimarea influentei temperaturii si umiditatii solului asupra ratelor de transformare a unei substante de testat si/sau a produsilor de transformare ai acesteia din sol.

Se poate incerca realizarea unei caracterizari suplimentare a radioactivitatii neextractibila utilizandu-se, de exemplu, extractia cu un lichid supercritic.

DATE

PRELUCRAREA REZULTATELOR

Cantitatile de substanta de testat, de produsi de transformare, de substante volatile (exprimate numai in %) si de produsi neextractibili se exprima ca % din concentratia initiala aplicata si, daca este cazul, ca mg·kg^-1 de sol (ca greutate uscata a solului) pentru fiecare interval de prelevare. Se furnizeaza si un bilant masic exprimat ca procent din concentratia aplicata initial pentru fiecare interval de prelevare. Reprezentarea grafica a concentratiilor substantei de testat in functie de timp permite estimarea timpului de injumatatire al transformarii sau DT₅₀. Se identifica principalii produsi de transformare, iar concentratiile acestora se reprezinta in functie de timp astfel incat sa fie ilustrate ratele de formare si de epuizare ale acestora. Este produs principal de transformare orice produs care reprezinta > 10% din doza aplicata in orice moment de pe parcursul studiului.

Produsele volatile captate ofera indicatii privind potentialul volatil al substantei de testat si produsii de transformare ai acesteia din sol.

Timpul de injumatatire sau valorile DT₅₀ si, daca este cazul, valorile DT₇₅ si DT₉₀ se pot determina cu mai multa precizie utilizandu-se metode de calcul bazate pe modele cinetice adecvate. Durata timpului de injumatatire si valorile DT₅₀ sunt incluse in raport, impreuna cu o descriere a modelului cinetic utilizat, cu ordinul cineticii si cu coeficientul de determinare (r²). Este preferabila cinetica de prim ordin, cu exceptia cazurilor in care r² < 0,7. Daca este cazul, calculele se aplica si principalilor produsi de transformare. Referintele 31-35 contin exemple de modele adecvate.

In cazul studiilor privind ratele de transformare realizate la diferite temperaturi, acestea sunt descrise in functie de temperatura in cadrul intervalului experimental de temperatura cu ajutorul relatiei lui Arrhenius:

sau

unde A si B sunt constantele de regresie, respectiv segmentul si panta dreptei de interpolare determinate de regresia liniara a ln k fata de 1/T, unde k este constanta de viteza la temperatura T, iar T este temperatura in grade Kelvin. Daca transformarea depinde de activitatea microbiana, trebuie acordata o atentie speciala intervalului limitat de temperaturi in care se aplica relatia Arrhenius.

EVALUAREA SI INTERPRETAREA REZULTATELOR

Desi studiile se realizeaza intr-un sistem artificial de laborator, rezultatele permit estimarea ratei de transformare a substantei de testat, precum si rata de formare si de epuizare a produsilor de transformare in conditii de teren (36)(37).

Studiile asupra cailor de transformare a unei substante de testat ofera informatii privind modul in care structura substantei aplicate se modifica in sol prin reactii chimice si microbiene.

RAPORTARE

RAPORT DE TESTARE

Raportul de testare trebuie sa contina urmatoarele informatii:

Substanta de testat:

denumirea comuna, denumirea chimica, numarul CAS, formula structurala [indicandu-se pozitia marcajului (marcajelor) radioactiv(e) daca se foloseste material marcat radioactiv] si proprietatile fizice si chimice relevante (vezi sectiunea 1.5);

puritatea (impuritatile) substantei de testat;

puritatea radiochimica a substantei chimice marcate si activitatea specifica (daca este cazul);

Substante de referinta:

denumirea chimica si structura substantelor de referinta utilizate pentru caracterizarea si/sau identificarea produsilor de transformare;

Solurile de testare:

detalii privind locul de colectare;

data si procedura de prelevare a solului;

proprietatile solului cum sunt pH-ul, continutul de carbon organic, textura (% nisip, % aluviuni, % argila), capacitatea de schimb de cationi, densitatea aparenta, caracteristicile de retinere a apei si biomasa microbiana;

durata depozitarii solului si conditiile de depozitare (daca este depozitat);

Conditii de testare;

datele la care au fost realizate studiile;

cantitatea de substanta de testat aplicata;

solventii utilizati si metoda de aplicare a substantei de testat;

greutatea solului tratat initial si prelevat la fiecare interval in vederea analizei;

descrierea sistemului de incubare utilizat;

debitul de aer (numai pentru sistemele cu circulatie continua);

temperatura la inceputul experimentului;

continutul de umiditate din sol pe parcursul incubarii;

biomasa microbiana initiala, de pe parcursul derularii si de la sfarsitul studiilor aerobe si in conditii de orezarie;

pH-ul, concentratia de oxigen si potentialul redox initiale, de pe parcursul derularii si de la sfarsitul studiilor aerobe si in conditii de orezarie;

metoda(metodele) de extractie;

metodele de identificare si de cuantificare a substantei de testat si principalii produsi de transformare din sol si materialele de absorbtie;

numarul de duplicate si de probe martor.

Rezultate:

rezultatul determinarii activitatii microbiene;

repetabilitatea si sensibilitatea metodelor analitice utilizate;

ratele de recuperare (procentele acceptabile pentru ca un studiu sa fie considerat valabil sunt prezentate in sectiunea 1.7.1);

tabelul rezultatelor exprimate ca % din doza initiala aplicata si, daca este cazul, in mg·kg-1 de sol (greutate uscata);

bilantul masic de pe parcursul si de la inceputul studiilor;

cuantificarea CO2 degajat si a altor compusi volatili;

grafice ale concentratiilor substantei de testat din sol in functie de timp si, daca este cazul, grafice pentru produsii importanti de transformare;

timpul de injumatatire sau DT50, DT75 si DT90 pentru substanta de testat si, daca este cazul, pentru produsii principali de transformare, inclusiv pragurile de incredere;

estimarea ratei de degradare abiotica in conditii sterile;

o evaluare a cineticii de transformare a substantei de testat si, daca este cazul, a principalilor produsi de transformare;

caile de transformare propuse, daca este cazul;

discutarea si interpretarea rezultatelor;

date brute (de exemplu cromatogramele probelor, calculele privind viteza de transformare a probelor si mijloacele utilizate pentru identificarea produsilor de transformare).

REFERINTE BIBLIOGRAFICE:

US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

Uniunea Europeana (UE) (1995). Directiva 95/36/CE din 14 iulie 1995 de modificare a Directivei 91/414/CEE a Consiliului privind introducerea pe piata a produselor fitofarmaceutice, anexa II partea A si anexa III partea A: Evolutie si comportamentul in mediu.

Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.

ISO/DIS 11266-1. (1993). Soil Quality - Guidance on laboratory tests for biodegradation in soil: Part 1. Aerobic Conditions.

ISO 14239 (1997). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

SETAC-Europe (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides, Mark R. Lynch, Ed.

MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.

DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley - VCH (1998).

T.R. Roberts: Non extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)

OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981)

ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling - Part 6. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

Anexa V la Directiva 67/548/CEE.

Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons, Vol. 1, 85-114.

Soil texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed. ) Agronomy Series No. 9, 2^nd Edition.

Methods of Soil Analysis (1982). Part 2. Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No. 9, 2^nd Edition.

ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.

Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehbruch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978). A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10,215 221.

ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation extraction method.

Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.

Kato, Yasushiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16^th Symposium on Environmental Science of Pesticides, 105-120.

Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).

Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).

Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.

Anderson J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.

Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.

Goring C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.

Timme, G., Freshe, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, 188-204.

Timme, G., Freshe, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47-60.

Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.

Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.

ANEXA 1

SUCTIUNEA, CAPACITATEA CAMPULUI (FC) SI CAPACITATEA DE RETINERE A APEI (WRC)(1)

(a) pF = log din valoarea coloanei de apa exprimate in cm.

(b) 1 bar = 10⁵ Pa.

(c) Corespunde unui continut aproximativ de apa de 10% in nisip, de 35% in aluviuni si de 45% in argila.

(d) Capacitatea campului nu este constanta, ci variaza in functie de tipul de sol de la pF 1,5 la 2,5.

Suctiunea se masoara in cm coloana de apa sau in bari. Deoarece intervalul valorilor suctiunii este foarte mare, se exprima simplu ca valoare pF, adica echivalentul logaritmului din valoarea coloanei de apa exprimata in cm.

Capacitatea campului se defineste ca fiind cantitatea de apa care poate fi stocata, avand in vedere gravitatia, de un sol natural dupa 2 zile de la incheierea unei perioade lungi de ploaie sau dupa ce a fost irigat suficient. Se determina in sol nederanjat, in situ, pe camp. Aceasta masuratoare nu se poate realiza pe probe de sol de laborator deranjat. Valorile FC determinate pentru soluri deranjate pot prezenta variatii sistematice considerabile.

Capacitatea de retinere a apei (WHC) se determina in laborator pe soluri deranjate si nederanjate prin saturarea unei coloane de sol cu apa prin transport capilar. Este extrem de utila pentru solurile deranjate si poate fi cu pana la 30% mai mare decat capacitatea campului (1). Se determina experimental mai usor decat se determina valori FC fiabile.

(1) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen, DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

ANEXA 2

CONTINUTUL DE UMIDITATE (g de apa in 100g sol uscat) AL DIFERITELOR TIPURI DE SOL DIN DIFERITE TARI

Capacitate de retinere a apei

ANEXA 3

Figura 1

Exemplu de aparat cu circulatie continua pentru studiul transformarii substantelor chimice in sol (1)(2)

AER sau N2

Figura 2

Exemplu de balon de tip biometric pentru studiul transformarii substantelor chimice in sol (3)

Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.

Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol. 1, 85-114.

Anderson J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.