Tehnica efectuarii determinarilor biochimice din ser in sistem semiautomat

Metodele de analiza in laboratorul clinic cunosc astazi o dezvoltare remarcabila si rapida prin introducerea de tehnici noi si aparatura de inalta precizie.In laboratoarele clinice sunt folosite in prezent analizoare cu diferite grade de automatizare.Utilizarea acestora a devenit necesara din cauza varietatii si volumului mare de teste efectuate in mod uzual .

Autoanalizoarele folosite in laborator in general incorporeaza versiuni mecanizate ale procedurilor si tehnicilor manuale de baza.Modele diferite pot fi mai convenabile spitalelor in functie de nevoile acestora.Un anumit model poate fi avantajos din punct de vedere economic , tinandu-se cont de de costul reactivilor , in timp ce un altul poate aduce avantaje in ceea ce priveste viteza de lucru a probelor.Un laborator de dimensiuni medii , cu un volum de lucru de aproximativ 100 de teste /zi, isi poate indeplini sarcinile utilizand un analizor semiautomat.

In cazul analizoarelor semiautomate pregatirea si cititrea probelor se face manual, iar setarea parametrilor precum lungimea de unda, timpul de reactie, temperatura se face automat, datele fiind introduse cu ajutorul tastaturii cu care este prevazut analizorul. Memoria aparatului permite programarea unui numar variabil de metode diferite. Datele introduse pot fi vizualizare de obicei pe ecranul aparatului sau pot fi scoase pe suport de hartie cu ajutorul imprimantei incorporate.

Analizoarele pot fi de tipul spectrofotometrelor programabile in domeniul vizibil si ultraviolet , capabile sa stocheze in memoria lor un numar variabil de metode . O microcelula de flux cu volume de aspirare programabile face posibila prelevarea probei atunci cand se da comanda .Termostatarea probei in celula poate fi facuta cu ajutorul unui sistem Peltier.

Masuratorile analitice sunt posibile folosindu-se curbe de calibrare obtinute prin interpolarea cu un anumit numar de standarde ( de ex.10) sau probe cu concentratie cunoscuta. Curba de calibrare optima este calculata odata ce standardele au fost masurate sau introduse. Introducerea eronata a unor date poate fi semalata prin declansarea alarmei sau afisarea anumitor parametrii pe ecranul analizorului.

Metode :

Metoda este un grup de parametrii care definesc conditiile de lucru pentru fiecare test.Fiecare metoda stocata in memorie poate fi revizuita, editata sau stearsa .

Tipuri :

Absorbtie/ Concentratie

Endpoint, cu sau fara blank de reactie

Reactii cinetice cu sau fara blankul probei

Imunoturbidimetrie

Cut-off -metode cu limite intre rezultatele pozitive si negative

Fotometric

Metode cu standard:

Se aspira standardul a carui valoare de concentratie este afisa pe ecranul aparatului, apasandu-se butonul de punere in miscare a pompei.Dupa aspirare este afisat mesajul "reading standard".Se vor tipari absorbanta standardului si factorul calculat.

Daca este acceptata valoarea standardului , in functie de absorbanta acestuia si absorbanta blankului, este initiata masurarea probei.

Metode cu factor:

Masurarea in care se foloseste un factor omite procedura masurarii unui standard de referinta.Dupa citirea blank-ului si confirmarea sau editarea factorului , acesta este tiparit , iar ciclul de masurare este initiat.

Metode cinetice

Masuratorile cinetice pot fi efectuate folosind un factor, un standard sau o curba de calibrare , in analogie cu masuratorile colorimetrice.Fiecare masuratoare este efectuata intr-un ciclu incluzand :

Un interval fix de timp (timp de intarziere)

Citirea la interval de timp fix (timpul de masurare)

La sfarsitul fiecarui ciclu de masurare , un semnal sonor indica faptul ca aparatul este pregatit pentru urmatoarea proba.

Substante serice determinate prin metode manuale:

HDL-colesterol:

Reactivii si de specimenele stau la temperatura camerei.

Amestecati energic si lasati sa stea 5 minute la 37s.

Setati absorbanta A1 la 600 nm impotriva reactivului blank.

Amestecati energic si lasati sa stea 5 minute la 37s.

Setati absorbanta A2 la 600 nm impotriva reactivului blank.

Este recomandat analizor automat cu citire bicromatica (600-700 nm)

GLUCOZA

Conditii de testare

Lungime de unda: 505 (492-520) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda: endpoint (increasing)

Citeste impotriva: reactiv blank

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se masoara absorbanta (A) dupa cinci minute de incubatie.

ALT (GPT)

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 2 volume de reactiv 1(R1) cu 1 volum de reactiv 2(R2).

Stabilitate: la 20-25 ° C: 5 zile

la 2-8 ° C: 2 saptamani

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Daca am absorbanta reactivului de lucru este mai mica de 1,1 la 334 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 340 (334-365) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata

Metoda:. kinetic (decreasing)

Metoda cu un reactiv

Se amesteca si dupa 2 minute de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 2 minute.

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se adauga:

Se amesteca si dupa 2 minute de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 2 minute.

AST(GOT)

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 2 volume de reactiv 1 cu 1 volum de reactiv 2.

Stabilitate: la 20-25 ° C: 5 zile

la 2-8 ° C: 4 saptamani

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mica de 1,2 la 334 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungime de unda: 340 (334-365) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata

Metoda:. kinetic (decreasing)

Metoda cu un reactiv

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie la 37sse adauga:

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

UREE

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 3 volume de reactiv (R1), cu 1 volum de reactiv (R2).

Stabilitate: la 20-25 ° C: 7 zile

la 2-8 ° C: 4 saptamani

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mica de 1,5 la 334 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 340 (334-365) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata

Metoda:. kinetic (decreasing)

Metoda cu un reactiv

Se amesteca si dupa 30 de secunde de incubatie se masoara absorbanta timp de 1 minut .

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se adauga:

Se amesteca si dupa 30 de secunde de incubatie se masoara masoara absorbanta timp de 1 minut .

α-Amilaza

METODA

Reactivul de lucru -reactivul este gata pentru utilizare.

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare de 0,5 la 405 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 405 nm

Cuveta: 1 cm

Temperatura: 37 ° C

Metoda:. kinetic (increasing)

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se incubeaza reactia la 37 ° C timp de 1 minut.

Cititi valorile absorbantei la fiecare 30 de secunde dupa 1 minut pentru cel putin 2 minute. Determinati schimbarea absorbantei pe minut (ΔA / min).

Bilirubina totala si directa

Pregatirea reactivului de lucru

A: Bilirubina totala

Raportul de amestec RT1 si R2: 125 ml/25ml

B: Bilirubina directa

Raportul de amestec RD1 si R2: 125 ml/25ml

Reactivii pot fi aplicati numai dupa amestecare anterioara!

Stabilitatea rectivului de lucru

20-25 ° C: 1 zi

2-8 ° C: 5 zile

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare decat 0,02 la 546 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 555 nm (540-560 nm)

Lungimea de unda secundara : 600 nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda: end point.

Citeste impotriva: reactiv blank

Pipetati in cuveta

A) Bilirubina totala

B)Bilirubina directa

Se amesteca si se citeste densitatea optica (A), dupa exact 3 minute de incubatie.

CALCIU

In cursul determinarii va rugam sa utilizati numai echipamente de plastic de unica folosinta!

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare de 1,5 la 600 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 650 (600) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda:. End point(increasing)

Citeste impotriva: reactiv blank

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se masoara densitatea optica dupa 1 minut de incubatie

CREATININA

Pregatirea reactivului de lucru

Se amesteca (R1) cu (R2) intr-o proportie de 1: 1

Stabilitatea reactivului de lucru: 20 -25 sC 1 luna

Condii de testare

Lungimea de unda: 492(480-520) nm

Temperatura: 25,30,37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda:. Kinetic sau End point

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se masoara dupa 30 de secunde de incubatie densitatea optica comparativ cu apa distilata (A1).Dupa 2 minute de incubatie se citeste din nou densitatea optica(A2).

γ-GT

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 4 volume de reactiv 1 cu 1 volum de reactiv 2.

Stabilitate: la 20-25 ° C: 5 zile

la 2-8 ° C: 3 saptamani

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Nu utilizati reactivul de lucru, daca densitatea optica initiala masurata impotriva apa distilate la 405 nm depaseste 1,0.

Condii de testare

Lungimea de unda: 405 nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata

Metoda:. kinetic (increasing)

Metoda cu un reactiv

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca se asteapa    1 minut

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

Proteine totale

Condii de testare

Lungimea de unda: 546 (530-580) nm

Temperatura: 25,30, 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda:. End point

Citeste impotriva: reactiv blank

Pipetati in cuveta

Se amesteca si dupa 10 minute de incubatie cititi densitatea optica. Rezultatul final, culorat este stabil timp de cel putin 1 ora.

LDH - P

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 1 volum de reactiv 1(R1) cu 1 volum de reactiv 2(R2).

Stabilitate: la 20-25 ° C: 1saptamana

la 2-8 ° C: 4 saptamani

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mica de 340 nm de reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 340 (334-365) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata

Metoda:. kinetic (decreasing)

Metoda cu un reactiv

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea densitatei optice per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se adauga:

Se amesteca si dupa 1 minut de incubatie se masoara schimbarea absorbantei per minut (ΔA/min) timp de 3 minute.

Trigliceride

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

Reactivii sunt gata pentru utilizare. Reactivii sunt stabili pana la data de expirare de pe eticheta. Reactivii se pastreaza la 2-8 ° C,protejati de lumina. Evitati contaminarea reactivilor deschisi.

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare decat 0,35 la 492 nm reactivul nu poate fi folosit.

Condii de testare

Lungimea de unda: 505 (490-550) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: reactiv blank

Metoda:. endpoint (increasing)

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se citeste absorbanta (A) dupa 6 minute la 37 ° C. Culoarea este stabila pentru 30 minute.

ACID URIC

Pregatirea si stabilitatea reactivlor de lucru

I. Metoda cu un reactiv:

Se amesteca 2 volume de reactiv 1 (R1) cu 1 volum de reactiv 2 (R2).

Stabilitate: la 20-25 ° C: 2 saptamani

la 2-8 ° C: 1 luna

II. Metoda cu doi reactivi : reactivii sunt gata pentru utilizare.

Condii de testare

Lungimea de unda:    546(520-570) nm

Temperatura:    37 ° C

Cuveta:    la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva:    reactiv blank

Metoda cu un reactiv:

Se amesteca si se masoara densitatea optica (OD) dupa 5 minute incubatie.

Metoda cu doi reactivi

Se amesteca si se asteapta 1 minut.

Se amesteca si se masoara densitatea optica(OD) dupa 5 min. de incubatie.

Colesterol

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare de 0.1 la 492 nm reactivul nu poate fi folosit.

Probe

Ser nehemolizat.

Conditii de testare

Lungime de unda: 505 (480-520) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: reactiv blank

Metoda: endpoint (increasing)

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se masoara absorbanta (A) dupa 5 minute de incubatie.

Magneziu

Pregatirea si stabilitatea reactivului de lucru

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare de 1,2 la 492 de reactivul nu poate fi folosit

Condii de testare

Lungimea de unda: 500 (480-520) nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Metoda:. End point(increasing)

Pipetati in cuveta

Se amesteca si se incubeaza 5 minute si apoi se citeste absorbanta comparativ cu blankul.

FAS

Pregatire

Se dizolva 1 flacon din R2 in cantitatea corespunzatoare de R 1. (rata de amestecare este de 1:40.)

Stabilitatea de reactivului de lucru :

-2 - 8 ° C     2 saptamani

-20-25 ° C 2 zile

Daca absorbanta reactivului de lucru este mai mare de 1,3 la 405 nm reactivul nu poate fi folosit.

Conditii de testare

Lungime de unda: 405-410nm

Temperatura: 37 ° C

Cuveta: la 1 cm in calea luminii

Citeste impotriva: apa distilata sau aer

Metoda: kinetic (increasing)

Pipetati in cuveta

Se amesteca si dupa o incubatie de 60 de secunde cititi schimbarea densitatii optice (ΔA) timp de 2 minute. Determinati schimbarea densitatii optice pe minut (ΔA/min).

Bibliografie:

Practical Clinical Biochemistry: Methods and Interpretations-Chawla

Metrolab 1600 plus-manual de utilizare