MICROSCOAPELE FOTONICE

MICROSCOAPELE FOTONICE

Microscopul fotonic (optic) este un aparat optic de marit care utilizeaza ca sursa    de radiatie fotonul. Se compune din doua parti si anume partea mecanica si cea optica.

Partea mecanica cuprinde piciorul microscopului si coloana microscopului.

Piciorul microscopului : este partea pe care se sprijina microscopul si cuprinde sursa de lumina reprezentata de un bec de 6V, un diafragm, o oglinda si doua suruburi.

Coloana microscopului : are atasate de ea mai multe componente.

a. Masuta (platina) este formata dintr-o parte superioara mobila si o parte inferioara fixa; are un sistem de cleme (valeti) cu ajutorul carora se fixeaza lama pe masuta; are doua scale gradate si surubul masutei cu ajutorul caruia se misca preparatul in directia dorita.

b. Tubul microscopului are atasat in partea superioara sistemul ocular. In interiorul tubului se gasesc prismele microscopului, iar in partea inferioara se gaseste revolverul format dintr-o parte superioara fixa si una inferioara mobila de care se ataseaza sistemul obiectiv.

c. Sistemul de vize (suruburi). Macroviza este surubul mare negru; realizeaza miscari grosiere ale coloanei microscopului (de ordinul centimetrilor). SE FOLOSESTE CU OBIECTIVUL DE 10X (sau mai mici : 2x, 4x, 6x). Macroviza se foloseste pentru prinderea imaginii preparatului. Microviza (surubul mic argintiu) realizeaza miscari fine ale coloanei microscopului (de ordinul micronilor), intreaga cursa a coloanei fiind de 2mm. Se foloseste pentru obtinerea unei imagini perfect clare a preparatului. Se utilizeaza cu oricare dintre obiective.

Surubul condensorului, surub mic, negru (vezi sistemul de transmis lumina)

2. Partea optica a microscopului cuprinde sistemul ocular, sistemul optic si sistemul de transmis lumina.

a. Sistemul ocular se afla in partea superioara a tubului microscopului. Microscoapele pot fi monoculare sau binoculare. Sistemul ocular este format dintr-un sistem de lentile. Puterea de marire a ocularului este de 10x. Prismele se afla in interiorul tubului, au puterea de marire de 1,6x. Intre oculare exista o scala gradata care ajuta la reglarea distantei pupilare a examinatorului.

b. Sistemul obiectiv este atasat de partea inferioara a revolverului. Exista doua tipuri de obiective - uscate (obiectivele de 10x,20x,40x,60x)

- umede sau de imersie (90x)

Sistemul obiectiv este format dintr-un sistem de lentile. Lentila inferioara numita lentila frontala este plan convexa si este orientata cu fata spre preparat. Obiectivele umede necesita intre lentila frontala si preparat un mediu lichid

(ulei de cedru). Sunt obiective citologice, se folosesc pentru examinarea frotiurilor sangvine.

c. Sistemul de transmis lumina cuprinde

- sursa de lumina reprezentata de becul de 6V

- diafragmul situat in piciorul microscopului, cu rol de a regla intensitatea fascicolului luminos

- oglinda situata in piciorul microscopului, cu rol de a reflecta raza luminoasa in axul optic

- condensorul situat sub platina; este format dintr-un sistem de lentile care au rolul de a focaliza razele luminoase pe preparat, astfel incat lumina sa fie optima si uniform repartizata. La nivelul condensorului se afla un diafragm, numit diafragm iris, care functioneaza la fel ca irisul uman. Are un surub cu ajutorul caruia se coboara sau se ridica condensorul, reglandu-se astfel intensitatea fascicolului luminos.

PUTEREA DE REZOLUTIE A MICROSCOPULUI

Puterea de rezolutie sau puterea de separare a microscopului reprezinta capacitatea microscopului de a evidentia doua puncte ca distincte. Este distanta minima la care doua puncte pot fi vazute ca distincte. Puterea maxima de rezolutie a microscopului optic este de 0,2µ comparativ cu puterea de rezolutie a ochiului uman emetrop care este de 0,2mm.

PUTEREA DE MARIRE A MICROSCOPULUI

Puterea de marire a microscopului este data de produsul dintre puterea de marire a ocularului, a prismelor si a obiectivului.

REGULI DE BAZA PRIVIND EXAMINAREA LA MICROSCOP

conectarea la retea

se aduce in axul optic obiectivul de 10x

cu ajutorul valetilor se fixeaza lama pe platina

privind din lateral se aduce fragmentul de tesut examinat in dreptul spotului luminos

cu ajutorul macrovizei (ob. 10x) se coboara coloana microscopului atat cat este posibil

privind in oculare se regleaza distanta pupilara si cu ajutorul macrovizei se ridica usor coloana microscopului pana cand se obtine imaginea preparatului

cu ajutorul microvizei se obtine imaginea perfect clara

se regleaza condensorul astfel incat lumina sa fie optima si uniforma

fara sa mai atingem macroviza, rotim revolverul si aducem in axul optic obiectivul de 20x; cu microviza obtinem imaginea perfect clara

la fel se procedeaza si cu obiectivele de 40x,60x,90x

la sfarsitul examinarii se aduce in axul optic obiectivul de 10x, se indeparteaza lama de pe platina si se deconecteaza microscopul de la retea.

MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZA

Este un microscop special care mareste contrastul intre diferitele structuri ale unui preparat proaspat sau nativ (celulele sunt vii, preparatul nu este fixat, colorat).

Atunci cand unda luminoasa traverseaza structuri cu consistente diferite, aceasta este supusa unui proces de defazare. Microscopul cu contrast de faza transforma diferenta de drum a razelor luminoase in diferenta de amplitudine, perceptibila vederii. Pentru examinarea in contrast de faza, unui microscop obisnuit i se ataseaza obiective speciale cu inel de faza, un diafragm inelar si un microscop ajutator.

Acest microscop permite studiul celulelor in stare vie, observandu-se astfel viabilitatea celulara (miscarile ciliare, flagelare, diviziunea celulara, reactii celulare la diferiti stimuli fizici si chimici). Permite de asemenea studiul culturilor de celule.

MICROSCOPUL CU LUMINA POLARIZATA

Cu acest microscop se studiaza fenomenul de birefringenta (dubla refractie). Prezinta doua prisme speciale numite nicoli, confectionate dintr-un material numit spath de Islanda. Cele doua prisme poarta numele de polarizor si analizor.

Birefringenta se studiaza in pozitie de nicoli incrucisati, atunci cand planurile celor doi nicoli sunt perpendiculare. Astfel, campul microscopului devine intunecat iar daca structurile studiate sunt birefringente acestea apar intens stralucitoare.

Acest microscop se utilizeaza pentru examinarea structurilor cu compozitie chimica macromoleculara cu aspect liniar (ex. fibrele de colagen, fibrele de mielina, fibra musculara striata), structurile cu simetrie radiala (ex. granule proteice, lipidice, colesterol) si pentru studiul structurilor (ex. membrane biologice).

MICROSCOPUL CU LUMINA FLUORESCENTA

Acest microscop studiaza fenomenul de fluorescenta, fenomen luminos care ia nastere in structuri biologice primare (naturale) sau secundare (artificiale). Metoda se bazeaza pe proprietatea unor substante care, iradiate cu un fascicol de lumina cu o lungime de unda mica si cu frecventa inalta, emit radiatii cu o lungime de unda mare si o frecventa joasa - lumina fluorescenta.

Microscopul cu lumina fluorescenta este un microscop special care are ca sursa de lumina o lampa tubulara de cuart cu vapori de mercur sub tensiune inalta.

Microscopul este dotat cu filtre speciale si anume filtrul de excitatie situat in piciorul microscopului, intre oglinda si condensor, cu rolul de a opri toate radiatiile in afara U.V. si filtrul de protectie situat la nivelul ocularelor, cu rol de a proteja retina.

Asa cum am amintit, fluorescenta unui preparat poate fi clasificata in doua categorii :

a.             fluorescenta primara - naturala sau autofluorescenta, este produsa de substante care se gasesc in mod natural in celule sau tesuturi : dintele natural, clorofila (rosu), anumite virusuri, bacilul Koch (verde stralucitor), amine biogene

b.             fluorescenta secundara - artificiala, provocata, este indusa prin tratarea tesuturilor cu fluorocromi, folosind metoda fluorocromarii cu acridin-orange. Fluorocromii sunt substante chimice cu proprietatea de a se fixa de anumite structuri din preparat si de a emite de la nivelul acestora lumina indusa. Cu ajutorul fluorocromarii se pot identifica acizii nucleici (ARN - rosu, ADN - verde-galbui), fibre de colagen elastice si de reticulina (verde), nucleii leucocitelor (verde), etc.

Coloratia cu acridin orange se mai utilizeaza in citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici in conditiile unui proces tumoral)

Cea mai importanta aplicatie este imunofluorescenta care se bazeaza pe cuplarea unui acid cu un fluorocrom; prin fluorescenta indusa poate fi identificata reactia antigen-anticorp, localizarea antigenelor in celula.

ETAPELE CONFECTIONARII PREPARATULUI PERMANENT

Recoltarea - recoltarea materialului biologic se poate efectua fie de la organisme vii (biopsie), fie de la cadavre (necropsie). Fragmentul recoltat nu trebuie sa fie mai mare 0,5 cm.

Fixarea - consta in mentinerea, conservarea structurilor recoltate intr-o forma cat mai apropiata de cea existenta in organismele vii. Prin fixare se stopeaza procesele vitale si se impiedica fenomenele de descompunere. Fixarea se realizeaza prin diferite metode : fizice (flambare, congelare cu zapada carbonica la -30sC, freon la -270sC, azot lichid); chimice - fixatorii pot fi simpli (formol, alcool metilic, alcool etilic) sau in amestec (Bouin - pentru studiul organitelor si produsilor de secretie, Carnoy - pentru studiul acizilor nucleici, reticulului endoplasmic, Da Fanno, Ramon y Cajal - pentru studiul mitocondriilor).

Deshidratarea - se fac 3 bai succesive de alcool cu concentratie crescatoare 70s,90s si absolut.

Includerea - mediul de includere este parafina cu punct de topire la +56sC, rezultand blocurile de parafina.

Sectionarea - se realizeaza cu ajutorul microtomului cu ajutorul caruia se realizeaza sectiuni de ordinul micronilor (5-7µ).

Lipirea sectiunilor pe lama - se realizeaza intr-o baie de apa calda; lama se pregateste in prealabil cu albumina Mayer; sectiunea se intinde pe lama si se lasa in termostat 24h pentru uscare.

Deparafinarea - se realizeaza cu xilen, cu ajutorul caruia se indeparteaza parafina.

Hidratare - 3 bai consecutive in alcool cu concentratii descrescatoare - absolut, 90s, 70s.

Colorarea - exista mai multe categorii de coloranti :

Bazici (nucleari) - hematoxilina (coloreaza nucleul in albastru-violet), albastru de metilen

Acizi (citoplasmatici) - eozina (coloreaza citoplasma in rosu), fuxina acida

Neutri - May Grümwald Giemsa (specific pentru frotiurile de sange)

Indiferenti - Sudan III, Sudan IV (pentru produsii lipidici)

Deshidratarea - idem cu punctul 3.

Clarificarea - se realizeaza cu xilen, cu ajutorul caruia se indeparteaza surplusul de colorant.

Montarea - se pune o picatura de balsam de Canada peste preparat, se aseaza lamela si se elimina eventualele bule de aer. Preparatul astfel obtinut se aseaza in termostat la 37sC

Etichetarea.