Controlul genetic al dezvoltarii la plantele superioare

Controlul genetic al dezvoltarii la plantele superioare

Cuprins:

Introducere

Dezvoltarea florii la Arabidopsis

Determinarea combinationala a organelor florale

Metilarea ADN, factor reglator al dezvoltarii la plante.

INTRODUCERE

Reproducerea si dezvoltarea la plante difera semnificativ de cele de la alte eucariote. De exemplu, plantele au o alternanta de generatii intre sporofitul diploid si gametofitul haploid, iar linia germinativa nu este stabilita intr-o localizare precisa in timpul embriogenezei, ci in mai multe localizari in organismul adult (Fig. 1). De exemplu, la porumb fiecare spic contine celule ale liniei germinale care sufera meioza si formeaza polen.

Fig. 1. Ciclul de viata al unei plante cu flori.

La animale, cele mai multe decizii de dezvoltare majora sunt luate devreme in embriogeneza. La plantele superioare, diferentierea are loc aproape continuu in tot timpul vietii, in regiuni active din punct de vedere al diviziunii celulare, numite meristeme, situate atat in organele vegetative (radacina, tulpina, frunze), cat si in organele florale (sepale, petale, pistil, stamine). Meristemele radacinii si lastarilor tulpinali sunt formate in timpul embriogenezei si consta din celule care se divid in planuri geometrice distincte si la rate diferite pentru a produce modelele morfologice de baza ale fiecarui sistem de organe. Meristemele florale sunt stabilite printr-o reorganizare a meristemelor lastarilor dupa embriogeneza si diferentiate in structuri florale caracteristice fiecarei specii.

O diferenta importanta intre dezvoltarea animalelor si plantelor este urmatoarea: la plantele superioare, in timp ce grupe de celule permit proliferarea meristemelor si sufera mai departe diferentierea in tesuturi vegetative si florale, soarta lor in dezvoltare este determinata aproape in intregime de pozitia lor relativa fata de celulele vecine. Rolul critic al informatiei pozitionale la plantele superioare este in contrast cu dezvoltarea la animale, la care linie celulara joaca un rol cheie in determinarea soartei de dezvoltare a celulelor.

Plasticitatea modelelor de crestere la plantele superioare este rezultatul producerii continue de sisteme de organe florale si vegetative. Aceste sisteme sunt puternic conditionate de calitatea si intensitatea luminii. Plasticitatea dezvoltarii le confera plantelor o capacitate remarcabila de adaptare la mediu. De exemplu, un copac poate include, cu timpul, in trunchiul sau, un gard de sarma rigid. De asemenea, plantele rezista la anomalii genetice mari; de exemplu, au fost create plante transgenice de Arabidopsis prin supraexpresia si, respectiv, prin subexpresia ciclinei B. Supraexpresia ciclinei B a dus la o rata accelerata a diviziunii celulare, iar subexpresia a dus la o rata mica a diviziunii celulare. Plantele cu o rata mare a diviziunii celulare au mai multe celule si sunt mai mari decat plantele salbatice, pe cand plantele cu rata scazuta a diviziunii celulare au numarul de celule la jumatate, dar cresc aproape cu aceeasi rata si la aceeasi marime ca tipul salbatic, deoarece, desi numarul de celule este mai mic, fiecare celula este mai mare.

Deoarece plantele sunt capabile sa se adapteze la conditii extrem de variate de mediu, ele sufera rar transformare tumorala, cum se intampla la animale. In general, tumorile la plante se produc ca rezultat al interactiunii complexe cu patogeni precum Agrobacterium.

Dezvoltarea florii la Arabidopsis

Analiza genetica la Arabidopsis a relevat principii importante in determinarea genetica a structurii florale. Floarea de Arabidopsis thaliana este compusa din patru tipuri de organe aranjate in cercuri concentrice, dupa cum este ilustrat in figura 2. In dezvoltarea florii, fiecare cerc da nastere la un organ floral diferit.

Fig. 2. Diagrama unei flori de Arabidopsis in sectiune longitudinala si transversala. Din exterior spre interior se observa sepalele, petalele, staminele cu antere (organe mascule care formeaza polenul) si gineceul (carpelele care fuzioneaza pentru a forma ovarul).

Evenimentele implicate in dezvoltarea florala la Arabidopsis thaliana se succed in 12 stadii, dezvoltare care se finalizeaza cand mugurele floral se deschide (tabelul nr. 1).

Tabelul nr. 1. Evenimentele implicate in dezvoltarea florala la Arabidopsis thaliana

Analiza genetica si moleculara a dezvoltarii florii se face prin analiza mutatiilor genetice care afecteaza dezvoltarea florala. Genele care specifica dezvoltarea florii la Arabidopsis thaliana sunt in numar de patru: APETALA2 (AP2), AGAMOUS (AG), PISTILLATA (PI) si APETALA3 (AP3). In general, mutatiile in aceste gene afecteaza dezvoltarea in doua cercuri adiacente ale florii (fig. 3).

Mutatiile care afecteaza dezvoltarea florii cad in trei clase majore, fiecare cu un fenotip caracteristic. Comparativ cu floarea salbatica, unei clase ii lipsesc petalele si sepalele, alteia ii lipsesc petalele si staminele, iar celei de a treia ii lipsesc staminele si carpelele. Pe baza incrucisarii intre homozigoti mutanti, aceste clase de mutante pot fi repartizate in patru grupe de complementatie, fiecare dintre ele definind o gena diferita. Fiecare gena, precum si fenotipul plantei homozigote pentru o mutatie recesiva in acea gena sunt redate in fig. 3 si tabelul 2.

Fig. 3. Cele patru mutante florale originale, fiecare ilustrand o transformare homeotica (transformare in care un tip de organ inlocuieste un altul).

Tabelul nr. 2. Dezvoltarea florala la mutantele de Arabidopsis

Fenotipul la care lipsesc sepalele si petalele este cauzat de mutatiile ap2 (apetala2); fenotipul la care lipsesc staminele si petalele este datorat unor mutatii ap3 (apetala3) ori pi (pistillata); fenotipul fara stamine si carpele este datorat mutatiei ag (agamous). Prin analogie cu genele de la alte organisme, care produc dezvoltarea de organe in pozitii aberante (de exemplu, la Drosophila melanogaster), genele AG, AP2, PI si AP3 sunt clasificate ca homeotice, cu toate ca, spre deosebire de acestea, genele homeotice implicate in dezvoltarea florala nu codifica homeodomenii proteice.

Fiecare dintre aceste gene au fost clonate si secventiate, toate fiind identificate ca factori de transcriptie. Factorii de transcriptie codificati de AP3, PI si AG sunt membri ai familiei MADS box. Fiecare membru al acestei familii contine o secventa de 58 de aminoacizi avand caracteristici comune. Factorii de transcriptie MADS box sunt foarte comuni la plante si mai putin frecventi la animale.

Determinarea combinationala a organelor florale

In cel mai simplu model, primordiile florale pot fi privite ca trei campuri concentrice si partial suprapuse de activitate genica, desemnate A, B si C (fig. 4A). In primordiul florii de tip salbatic, cele trei cazuri de dezvoltare necesita activitatea lui AP2 pentru A (verticilele 1 si 2), AP3/PI pentru B, (verticilele 2 si 3) si AG pentru C (verticilele 3 si 4). Astfel, fiecare gena sau pereche de gene controleaza identitatea a doua verticile adiacente. Acest model presupune:

a)      combinatia produsilor genici homeotici prezenta in fiecare din cele 4 verticile este responsabila pentru specificarea dezvoltarii organelor care vor apare in acea pozitie;

b)      functiile A si C actioneaza antagonist. Astfel, activitatea AP2 in primul verticil este necesara pentru formarea sepalelor; activitatea AP2 in combinatie cu expresia AP3/PI in verticilul 2 este necesara pentru formarea petalelor; AP3/PI in combinatie cu AG in verticilul 3 sunt necesare pentru formarea staminelor si, in sfarsit, expresia lui AG in verticilul 4 este necesara pentru dezvoltarea gineceului (Fig. 4B).

Acest model simplu ABC poate fi aplicat si pentru formarea organelor florale in mutantele ag, pi, ap3 si ap2 (fig. 5).

Fig. 4. Modelul ABC pentru specificarea organelor florale la Arabidopsis. A) Diagrama florii de Arabidopsis de tip salbatic. Modelul ABC presupune ca cele 4 verticile sunt definite de trei campuri de dezvoltare partial suprapuse, 1, 2 si 3. B). Modelul ABC este un model combinational, in care verticilele sunt specificate de catre cele trei "functii" A, B si C, corespunzand campurilor de dezvoltare specificate in A. Modelul ABC se bazeaza pe observatiile asupra unor mutante particulare; pentru ca mutantele ap2 au aratat o intensificare a functiei C, AP2 a fost propusa ca o gena de functie A si, invers, mutantii ag sugereaza o intensificare a functiei A, deci AG a fost propusa ca o gena de functie C. Fenotipurile ap3 si pi sugereaza o pierdere a functiei B, prin urmare genele AP3 si PI au fost propuse a fi coopera in realizarea functiei B.

Fig. 5. Modelul ABC sugereaza un antagonismu intre functiile A si C. Pornind de la aceasta ipoteza, se poate prezice ca in absenta functiei C, functia A se va realiza in tot meristemul floral si, invers, in absenta functiei A, functia C se va indeplini in tot meristemul floral. In plus, pierderea functiei B ar impiedica modificarea corespunzatoare a functiilor A si B in ciclurile centrale. Sunt ilustrate fenotipurile prezise corespunzator acestor functii alterate. Totusi, fenotipurile observate ale mutantilor de nul ap2 si ag (vezi fig. 4) nu sunt exact echivalente fenotipurilor prezise de modelul ABC.

Rolul factorilor de transcriptie ap2, ap3, pi , ag, poate fi dedus din fenotipurile mutantelor. Aceasta se bazeaza pe observatia ca mutatia in oricare gena elimina doua organe florale care apar din verticile adiacente. Acest model sugereaza ca ap2 este necesar pentru sepale si petale, ap3 si pi sunt necesare pentru petale si stamine, iar ag este necesar pentru stamine si carpele. Deoarece fenotipurile mutante sunt produse de pierderea functiei alelelor genelor, se deduce ca ap2 este exprimat in verticilele 1 si 2, ap3 si pi sunt exprimate in verticilele 2 si 3, iar ag este exprimat in verticilele 3 si 4.

Modelele de suprapunere a expresiei sunt aratate in tabelul 3; dezvoltarea florala este controlata in maniera combinationala de cele patru gene. Sepalele se dezvolta din tesutul in care numai ap2 este activ; petalele sunt exprimate prin combinatia lui ap2, ap3 si pi, staminele sunt determinate prin combinatia lui ap3, pi si ag, iar carpelele deriva dintr-un tesut in care numai ag este activ (fig. 4). Tabelul 3 nu reprezinta toate caracteristicile fenotipice ale mutatiilor ap2 si ag din tabelul 2.

Tabelul nr. 3. Domeniile de expresie combinationala a genelor ce determina dezvoltarea florala.

Astfel, in particular, conform modelului combinational din tabelul 3, dezvoltarea carpelelor si staminelor din verticilele 1 si 2 in plantele homozigote ap2 ar necesita expresia lui Ag in verticilele 1 si 2. Similar, dezvoltarea petalelor si sepalelor din verticilele 3 si 4 din plantele homozigote ag ar necesita expresia lui Ap2 in verticilele 3 si 4. Aceasta discrepanta poate fi explicata daca se presupune ca expresia lui Ap2 si expresia lui Ag sunt mutual exclusive: in prezenta factorului de transcriptie Ap2, Ag este represat, iar in prezenta factorului de transcriptie Ag, Ap2 este represat. Atunci, in mutantele ap2, expresia lui Ag se prelungeste in verticilele 1 si 2 si in mutantele ag - expresia Ap2 se prelungeste in verticilele 3 si 4. In plus, aceasta presupunere explica prezenta fenotipurilor mutantelor simple si chiar a celor duble.

Ipoteza interactiunii dintre Ap2 si Ag a fost verificata prin hibridarea in situ a ARN din celulele florale cu sonde marcate pentru fiecare gena: s-a demonstrat ca Ap2 este exprimat in verticilele 1 si 2; Ap3 si Pi - in verticilele 2 si 3 si Ag in verticilele 3 si 4 (Ap2 este exprimat si in tesuturi neflorale, dar rolul sau este necunoscut).

Presupunerea ca expresiile ap2 si ag se exclud reciproc s-a dovedit prin studiul mutatiilor. Astfel, in mutantele ap2, ag este exprimat in verticilele 1 si 2 si, reciproc, in mutantele ag, ap2 este exprimat in verticilele 3 si 4. Se cunoaste, de asemenea, ca ap3 si pi lucreaza impreuna. Factorul de transcriptie codificat de AP3 si PI este o proteina dimerica compusa din polipeptidele Ap3 si Pi. Fiecare componenta polipeptidica ramane inactiva in citoplasma in absenta celeilalte; impreuna, ele formeaza un factor de transcriptie activ, care migreaza in nucleu.

Dat fiind rolul critic al factorilor de transcriptie Ap2, Ap3/Pi si Ag in determinarea florala, s-a presupus ca mutantele triple (la care lipsesc toti cei 3 factori de transcriptie) duc la aparitia de flori anormale. Fenotipul triplu mutant prezinta, insa, flori care nu au niciun organ floral normal, ci consta din frunze aranjate in inele concentrice.

In concluzie, procesele de dezvoltare la plantele superioare difera semnificativ de cele de la animale prin aceea ca deciziile procesului de dezvoltare sunt luate continuu pe parcursul vietii, la nivelul meristemelor organelor vegetative (radacina, tulpina, frunze) si la nivelul organelor florale (sepale, petale, pistil si stamine). Pe de alta parte, controlul genetic al dezvoltarii plantei este mediat de factori de transcriptie analogi cu cei de la animale. De exemplu, controlul dezvoltarii florale la Arabidopsis depinde de expresia combinationala a patru gene la nivelul fiecaruia din cele patru verticile concentrice, in celulele care vor forma sepale, petale, stamine sau carpele.

Metilarea ADN, factor reglator al dezvoltarii la plante

Cercetari recente au demonstrat ca metilarea ADN joaca un rol important in reglarea momentului infloririi si in dezvoltarea endospermului. Identificarea genelor care controleaza aceste procese, ca si observarea expresiei lor alterate la plante cu metilare scazuta deschid perspectiva intelegerii rolului reglator al fenomenului de metilare a ADN in dezvoltarea plantelor. In acest sens, s-a demonstrat ca demetilarea la nivelul intregului genom are efect pleiotropic asupra morfologiei plantei, inclusiv asupra transformarii homeotice a organelor florale si asupra momentului infloririi. Demetilarea s-a realizat prin crearea de mutatii DDM1 (descresterea metilarii ADN 1), cu ajutorul 5-azacitidinei, la nivelul genelor responsabile pentru proteine necesare remodelarii cromatinei sau, alternativ, cu ajutorul unui ADN antisens pentru gena care codifica metiltransferaza (MET1). Unele anomalii au fost comune ambelor tipuri de plante mutante (ddm1 si met1), ceea ce inseamna ca reducerea metilarii, indiferent de metoda de producere, afecteaza reglarea unui subset special de gene.

Metilarea ADN ar putea fi, de asemenea, importanta in managementul genomic. Metilarea elementelor transpozabile impiedica transcriptia lor si micsoreaza recombinarea intre elementele identice, mentinand integritatea genomului. De asemenea, silentierea transgenelor este o consecinta a metilarii. In general, metilarea impiedica transcriptia direct, prin blocarea legarii factorilor de transcriptie sau indirect (cum se intampla la animale), prin intermediul unor proteine care, prin legare la ADN-ul metilat, duc la deacetilarea histonelor vecine si descresterea transcriptiei.

La plante, metilarea citozinei are loc atat in secventele simetrice CpG si CpNpG, cat si in secvente nesimetrice ca, de exemplu, CpApTp si CpTpT. Nu este cunoscuta importanta simetriei sau a asimetriei secventelor metilate in reglajul genetic dar, intrucat metilarea in secventele simetrice poate fi transmisa prin ciclurile de replicare ADN, pare probabil ca aceasta sa aiba un rol crucial in reglarea expresiei genice. Nu exista dovezi clare asupra mecanismelor ereditatii metilarii citozinelor asimetrice, care trebuie sa fie metilate de novo pe catena fiica dupa fiecare ciclu de replicare ADN.

Roluri ale metilarii (exemple):

1) Reglarea expresiei genice in timpul dezvoltarii la plante implica metilarea ca mecanism al expresiei diferentiate a genelor materne si paterne in dezvoltarea semintelor. Imprintingul, expresia diferentiata a genelor mostenite prin gametul femel, respectiv mascul, este un fenomen comun la mamifere. Imprintingul are loc si la plantele cu flori, la care afecteaza expresia genica in endospermul triploid. Dezvoltarea este perturbata cand balanta intre genomurile matern (m) si patern (p) - 2m:1p este alterata; aceasta duce la avortarea semintei. Incrucisarile intre plantele tetraploide si diploide de Arabidopsis au demonstrat ca raportul de 4m:1p in endosperm duce la reducerea numarului de mitoze in si descresterea marimii semintei. Din contra, raportul invers intre numarul de genomuri matern/patern are efect invers: numar mare de mitoze in endosperm si samanta mare. Deci imprintingul genelor regleaza dezvoltarea semintei.

Faptul ca metilarea ADN este importanta in imprintingul la plante s-a demonstrat la Arabidopsis si la porumb; prin studierea plantelor mutante la care a fost inhibata metilarea (prin inhibarea genei metiltransferazei) s-a constatat expresia aberanta a genelor la nivelul endospermului.

2) Metilarea are rol in dezvoltarea plantelor, prin medierea vernalizarii si promovarea infloririi la temperaturi scazute. Plantele care cresc la latitudini mari adesea necesita expunere prelungita la temperaturi scazute (vernalizare) pentru a initia inflorirea. Spre deosebire de inducerea infloririi prin marirea zilei, vernalizarea este caracterizata prin celule active mitotic care vor forma meristemele inflorescentei. Starea de vernalizare este memorata de la o diviziune mitotica la alta, dar nu este mostenita la descendenti. Aceasta inseamna ca vernalizarea este mediata prin demetilarea promotorului unei/unor gene importante pentru inducerea infloririi. Experimental, cresterea plantelor de tutun si Arabidopsis obtinute prin culturi de celule la temperaturi    scazute a avut ca efect reducerea nivelului de metilare.

Resetarea modelelor de metilare la mamifere (stergerea metilarii generatiei anterioare si remetilarea la noul embrion) se petrece intre doua generatii prin demetilare la nivelul intregului genom, imediat dupa fecundare, urmata de remetilarea genomului embrionului. Imprintul genomic este probabil resetat inainte de fecundare, in timpul gametogenezei. La plante, modelul de metilare (cel putin al unor secvente) este transmis neschimbat, prin gameti, la generatia urmatoare; de exemplu, elementele transpozabile si transgenele inactivate isi mentin aceasta stare la descendenti. Aceasta inseamna ca la plante nu exista un mecanism pentru remetilarea genomului ca intreg. Totusi, imprintingul genelor importante pentru dezvoltarea endospermului trebuie sa fie restabilit in fiecare generatie, ca si la mamifere.

Metilarea necesita ADN metiltransferaze si o proteina de modelare a cromatinei. La Arabidopsis, exista cel putin 8 gene pentru ADN metiltransferaze, care se clasifica in trei familii diferite (fig. 6). Acestea sunt tipice pentru plante, in general. Prima familie, MET1, codifica metiltransferaze care mentin metilarea dubletelor CpG si, la un nivel mai scazut, a tripletelor CpNpG. A doua familie, numita de cromometilaze, pare sa existe numai la plante. Ele difera de familia MET1, prin prezenta unui motiv de secventa in plus, omolog cu un cromodomeniu si au rol in metilarea heterocromatinei; enzimele MET1 intervin, de asemenea, in metilarea secventelor heterocromatice, chiar daca le lipseste acest cromodomeniu. A treia familie este cea mai asemanatoare cu metiltransferazele de la mamifere, la care metilarea se petrece de novo la fiecare generatie; la plante, aceste enzime au un aranjament neobisnuit al motivelor conservate caracteristice pentru metilarea citozinei, si nu prezinta activitate de metilare a citozinei.

Fig. 6. Dendrograma aratand cele trei familii de ADN metiltransferaze la Arabidopsis.

Metilarea ADN poate altera structura cromatinei, si invers, structura ADN poate influenta metilarea ADN. Mutatia genei DDM1 duce la pierderea metilarii, atat in secvente repetate, cat si in secvente unice. S-a demonstrat ca DDM1 codifica o proteina cu omologie cu familia ATPazelor dependente de ADN, care joaca un rol in coactivarea/corepresia transcriptiei, asamblarea cromatinei sau in repararea ADN. Astfel, DDM1 poate fi importanta in remodelarea cromatinei, pentru a permite accesul lui MET1 si altor metiltransferaze la ADN, posibil printr-o interactiune cu o proteina care leaga gruparile metil.

In concluzie, metilarea ADN are un rol important in controlul expresiei genice la plante, reprezentand o parte integranta a mecanismelor de control genic la plante. S-au discutat doua exemple, imprintingul genomic, in care expresia diferita a genelor mostenite de la genomul matern si patern este mediata prin metilarea diferentiata a celor doua genomuri si vernalizarea, in care conditiile de mediu reprezinta un semnal ce induce o schimbare in metilare care, la randul sau, duce la initierea infloririi. Metilarea ADN este probabil resetata in fiecare generatie, dar mecanismele sale la plante sunt mai putin cunoscute decat cele de la animale. De asemenea, la plante, rolul metiltransferazelor in stabilirea si mentinerea modelelor de metilare nu este pe deplin inteles. Plantele au cel putin trei familii de metiltransferaze (fata de una singura la animale), si au fost identificate si proteine implicate atat in controlul structurii cromatinei, cat si in metilarea ADN.