PROPRIETATILE MICROORGANISMELOR PATOGENE

PROPRIETATILE MICROORGANISMELOR PATOGENE

Din numarul mare de microorganisme existente in natura, un numar limitat sunt capabile sa se dezvolte in asociatie cu organismele superioare, iar dintre acestea, un numar restrans (cateva sute) sunt patogene.

Bacteriile patogene au doua proprietati definitorii: patogenitatea si virulenta. Cei doi termeni au semnificatie distincta: patogenitatea defineste capacitatea potentiala a unui microorganism de a initia un proces infectios, dar nu o face decat daca este suficient de virulent pentru a depasi barierele de aparare a organismului si a patrunde in tesuturi.

Patogenitatea

Patogenitatea este proprietatea unui microorganism de a determina in conditii naturale sau experimentale, aparitia unui proces infectios, decelabil din punct de vedere clinic, la o gazda receptiva.

In mod obisnuit, patogenitatea este asociata, inexact, cu modul de viata parazitara a microorganismelor, dar calitatea de patogen nu se asociaza totdeauna cu parazitismul. Majoritatea bacteriilor patogene sunt parazite, iar in vitro se dezvolta ca saprobionte pe medii organice, uneori cu compozitie chimica complexa. Unele bacterii, desi sunt strict saprobionte, adica se dezvolta pe materia organica in mediile naturale (de exemplu, Cl. botulinum), dar nu sunt parazite, produc totusi efecte patologice prin intermediul exotoxinelor pe care le secreta.

Patogenitatea este un caracter de specie. De exemplu, B. anthracis, C. diphteriae, S. typhi, M. tuberculosis sunt patogene, chiar daca unele sunt conditionat patogene, adica determina aparitia unui proces infectios numai daca sunt inoculate in doze foarte mari sau daca organismul are o rezistenta generala scazuta. Alte specii nu sunt niciodata patogene, pentru ca nu au capacitatea de a stabili interactiuni cu organismele superioare: Azotobacter, Nitrobacter, Acetobacter etc.

Patogenitatea implica existenta a patru proprietati esentiale:

a)capacitatea de a patrunde si de a se localiza in organismul gazdei;

b)proprietatea de a se multiplica in tesuturile acesteia si de a le invada;

c)rezistenta la mecanismele de aparare ale gazdei;

d)producerea leziunilor tisulare care se pot exterioriza clinic.

Una din trasaturile esentiale ale unui microorganism patogen este capacitatea de a receptiona permanent conditiile de mediu si de a coordona activitatea genelor in raport cu informatiile primite. De exemplu, agentii patogeni care se transmit prin apa sau prin alimente trebuie sa se adapteze conditiilor mediului extern, cat si celor din organismul sensibil. Adaptabilitatea patogenilor este ilustrata de Ps. aeruginosa (bacilul piocianic), care traieste in sol si apa, dar si in tesuturile organismului uman.

Virulenta

Virulenta este capacitatea unei tulpini a unui microorganism patogen aflat intr-o anumita faza de crestere, de a se localiza (a coloniza), de a se multiplica si eventual de a invada celulele si tesuturile gazdei si/sau de a produce toxine, determinand o stare patologica la o gazda receptiva.

Virulenta este o proprietate multifactoriala, care exprima cantitativ gradul de patogenitate a unei tulpini pentru o anumita gazda.

Virulenta este o proprietate biologica corelata cu anumite caractere de structura (prezenta flagelilor, fimbriilor), cu prezenta unor proteine membranare sau cu unele particularitati celulare fiziologice si de sinteza (ca de exemplu sinteza exotoxinelor sau a exoenzimelor.

Bacteriile utilizeaza mecanismele de receptie a modificarilor mediului prin intermediul chemosenzorilor si de raspuns, prin inducerea transcrierii genelor de virulenta.

Virulenta bacteriilor patogene este conditionata de trei factori:

infectiozitatea (sau capacitatea de colonizare)

agresivitatea (sau invazivitatea)

toxigenitatea

a)Infectiozitatea

Infectiozitatea reprezinta capacitatea unui microorganism de a depasi mijloacele de aparare a organismului, de a se implanta si de a coloniza tesuturile sanatoase, adica de a stabili o localizare si de a forma un focar primar de infectie.

Colonizarea tesutului de catre un microorganism patogen este o faza initiala critica pentru evolutia procesului patologic si este un fenomen complex, care implica atat implantarea cat si utilizarea substantelor nutritive disponibile in mediul gazdei.

Bacteriile produc o larga varietate de factori, care usureaza capacitatea lor de a invada gazda, de a se raspandi in tesuturi si de a supravietui mecanismelor de aparare ale gazdei. Moleculele au fost grupate in 4 clase: adezine, invazine, agresine si impedine.

Adezinele sunt proteine bacteriene care mediaza interactiunea celulei bacteriene cu o varietate de celule ale gazdei, in special epitelii, ca o prima treapta de colonizare a gazdei. Invazinele sunt proteine bacteriene care permit celulei sa intre in celula eucariota. Agresinele sunt molecule, de exemplu toxine si proteaze, care produc leziuni ale gazdei ori favorizeaza raspandirea infectiei. Impedinele sunt componente bacteriene care inhiba actiunea mecanismelor de aparare, fara sa produca leziuni.

Aderenta celulelor bacteriene de celulele gazdei

Adeziunea specifica a anumitor microorganisme la suprafete particulare implica interactii intre molecule complementare prezente atat la suprafata bacteriilor cat si pe suprafata de atasare a acestora. Adeziunea bacteriilor la celulele animale este un asfel de fenomen (Ofek si Beachy 1980). Legarea bacteriilor patogene de celulele sensibile este etapa initiala a procesului infectios. Aderenta impiedica indepartarea bacteriilor prin fluxul secretiilor, prin tuse, prin motilitatea cililor sau prin peristaltism.

In 1990 von Loosdrecht identifica patru etape ale fenomenului de aderenta bacteriana Aceste etape sunt:

1. Etapa de transport in care microorganismele ajung in vacinatatea substratului, deplasarea lor realizandu-se prin mai multe mecanisme: a) deplasarea prin difuziune (consecinta miscarii brawniene a celulelor bacteriene, lente si aleatorie in privinta contactului microorganismelor cu substratul; difuziunea este activa in conditii de mediu linistit, ceea ce favorizeaza procesul de sedimentare); b) deplasare prin curenti de convectie

(bacteriile sunt deplasate datorita curentului de lichid, cu viteza mai mare decat in cazul difuziunii); c) miscare activa (modalitatea cea mai rapida in care contactele intamplatoare sau orientate chimiotactic se afla intr-un gradient de concentratie in regiunea interfaciala).

2.Etapa adeziunii initiale este o etapa reversibila, bacteriile depuse pe suprafata suportului pastrandu-si miscarile browniene si flagelare, putand fi indepartate usor prin agitare sau chiar prin propria lor mobilitate. Adeziunea initiala se bazeaza pe legaturile covalente, fortele Van der Waals , tensiunea superficiala (forte de atractie), fortele de repulsie electrostatica. Energia potentiala rezulta din interactiunea variabila a bacteriilor Gram + si Gram - cu electrolitii.

3. Etapa legarii ireversibile (permanente) consta in incetarea miscarii browniene si imposibilitatea indepartarii bacteriilor aderente prin agitare. In aceasta etapa, microorganismele isi consolideaza adeziunea prin producerea "de novo" de exopolizaharide si glicoproteine. Necesitatea unei activitati metabolice cu sinteza de proteine "de novo" explica de ce bacteriile in faza exponentiala de crestere sunt mai active pentru aderenta decat cele din faza stationara. Multe alte molecule cu functie de adezine sunt utilizate in aceasta etapa (apendice filamentoase fimbrii sau flageli) ele interactionan cu receptori specifici, iar exprimarea lor se realizeaza in functie de mediu .De exemplu, in cazul bacteriei Vibrio cholerae El Tor pilul toxin-coreglat este utilizat in atasarea si colonizarea epiteliului intestinal in timpul procesului infectios, in timp ce hemaglutinina manozo-sensibila este adezina primara folosita pentru ancorarea de suprafetele din mediul acvatic. Glicocalixul sintetizat pericelular actioneaza din punct de vedere functional asemanator rasinilor schimbatoare de ioni.

4. Etapa colonizarii: odata bacteriile atasate ireversibil la suprafata, acestea cresc si se multiplica rapid, generand, intr-o prima etapa, un strat continuu monocelular care acopera toata suprafata expusa a substratului. Ulterior celulele stabilesc si legaturi strase intre ele, constituind asfel microcolonii si biofilme. Potentialul de crestere al biofilmelor bacteriene este limitat de catre nutrientii disponibili din mediu si perfuzarea acestor nutrienti catre celulele ce au creat biofilmul, si de catre indepartarea produsilor toxici de metabolism. In plus, exista un flux hydrodinamic optim peste biofilm care favorizeaza rata de crestere si perfuzare si care erodeaza straturile cele mai din exterior. Alti factori care controleaza maturatia biofilmului include pH-ul intern, perfuzia oxigenului, sursa de carbon si osmolaritatea. Deasemenea, biofilmele ating o masa critica si este atins un echilibru dinamic, la care stratul cel mai extern (cel mai indepartat de substrat) incepe sa genereze microorganisme planctonice. Aceste microorganisme sunt libere sa scape din biofilm si sa colonizeze alte suprafete. Celulele din apropierea suprafetei (din straturile profunde ale biofilmului) devin pasive sau mor secundar din lipsa de nutrienti, scazand pH-ul si pO₂, sau prin acumularea de metaboliti toxici.

Recent s-a sugerat faptul ca dezvoltarea primara, maturarea si destramarea biofilmelor pot fi reglate prin nivelul densitatii populatiei bacteriene, dependent de exprimarea unor gene ce controleaza sinteza unor molecule de semnalizare celula-celula de tipul homoserin-lactonelor acilate (intalnite la bacteriile Gram negative). Fenomenul poarta denumirea de "quorum sensing" si este un sistem de reglare ubiquitar in lumea bacteriana, implicat in semnalizarea si comunicarea interbacteriana, comunicare necesara supravietuirii bacteriilor.

Majoritatea fenomenelor de "quorum sensing" sunt implicate in interactiunile bacterie-organism eucariot gazda, atat in cele de tip lezional (A. tumefaciens, Paeruginosa, Erwinia sp.) cat si in cele benefice, mutuale (V. fischeri, R. leguminosarum). In acest sens, studiile se vor concentra asupra gasirii unor madalitati de control si manipulare ale sistemelor de "quorum sensing" asfel incat sa se poata combate efectele patologice in favoarea incurajarii relatiilor mutuale.

Odata maturat complet, un biofilm genereaza patternuri modificate ale cresterii bacteriene, cooperare fiziologica si eficienta metabolica, toate acestea sustinand o forma de coordonare functionala comuna care mimeaza un tesut eucariotic primitiv. In 1994 Costerton si in 1995 Andrews observau si ei acest comportament diferit al agregatelor bacteriene: de la unul foarte individual, la unul quasisocial, asemanator unui tesut biologic. (poze de scanat).

Studiile efectuate preponderent pe bacterii din familia Enterobacteriaceae (mai exact, pe bacteria Escherichia coli) au permis clasificarea acestora in functie de patternurile de aderenta la celule in cultura. Desi rezultatele au depins de modul de lucru, se poate afirma ca exista trei patternuri principale de aderenta la monostratul celular:

a. aderenta localizata (AL) caracterizata prin aderenta individuala a bacteriilor la suprafata celulelor eucariote, numarul de bacterii aderate fiind redus; tulpinile cu aderenta localizata sunt adesea incriminate ca determinand procese de patogenitate.

b. aderenta difuza (AD) caracterizata prin formarea clusterelor de aderenta, asociatii de bacterii care adera impreuna la suprafata aceleiasi celule eucariote.

c. aderenta agregativa (Aagg) caracterizata prin formarea unor lanturi de bacterii care adera atat la celulele vii din cultura cat si la substratul inert; atasarea la substratul inert denota o hidrofobicitate ridicata a peretelui celular bacterian.

Exprimente de aderenta s-au realizat ulterior, utilizand si alte specii bacteriene, constatandu-se ca aceste patternuri de aderenta pot fi considerate general valabile pentru toate bacteriile care prezinta capacitate de aderare. (poze de scanat).

Bacteriile poseda molecule de legare, numite generic adezine, care sunt capabile sa se lege stereospecific cu receptorii de pe membrana celulei gazda.in maniera analoga interactiei antigen-anticorp sau lectine-zahar.

Interactiunea celor mai multe adezine cu receptorii de suprafata ai celulei sensibile este specifica si selectiva. Structurile bacteriene de aderenta, anatomice sau moleculare sunt, de cele mai multe ori, adaptative. Ele dispar prin cultivarea succesiva in vitro. De aceea, tulpinile bacteriene de laborator sunt mai putin aderente de suport, comparativ cu izolatele bacteriene recente.

Aderenta asigura colonizarea anumitor situsuri din organism, multiplicarea bacteriilor, sinteza toxinelor si desfasurarea reactiei inflamatorii de aparare.

Bacteriile adera in special de epiteliile mucoaselor, dar si de epiteliile keratinizate, de endotelii, oase, dinti etc. Aderenta implica interactiunea situsurilor complementare de pe suprafata celor doua tipuri de celule: epiteliala si bacteriana.

Cele mai multe bacterii au o sarcina neta negativa a suprafetei lor, dar au si zone limitate electropozitive, precum si molecule cu caracter hidrofob. Prezenta gruparilor cu sarcini opuse si a moleculelor hidrofobe, asigura interactiunea celulei bacteriene cu suprafata celulei epiteliale.

Aderenta reprezinta un avantaj ecologic major pentru bacteriile patogene, cu privire la asigurarea nutrientilor, protectia fata de anticorpi si lizozim etc. Multiplicarea lor, dupa aderenta, are loc cu o rata net superioara fata de a celulelor neaderente.

Mecanismele aderentei bacteriene in vivo au fost studiate in special pentru bacteriile generatoare de carii dentare. Aderenta celulelor bacteriene patogene, de celulele sensibile implica participarea a doi factori: o adezina localizata pe suprafata bacteriei si un receptor de pe suprafata celulei gazda.

Adezinele

Principalele tipuri de adezine. Adezinele bacteriene se impart in doua mari categorii: a)adezine de natura proteica; b) adezine neproteice.

Adezine ale bacteriilor Gram pozitive.

Proteice

Majoritatea bacteriilor gram pozitive nu exprima structuri ca pilii caracteristici gram negativilor, ci mai degraba utilizeaza proteinele de suprafata ancorate la peretele celular, pentru a adera fie la matrixul extracelular, fie le alte componente prezente in tesutul gazda. Hook si colaboratorii au adat numele de MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) proteinelor de suprafata care se leaga de componentele matricei extracelulare (ECM), proteine prezente la majoritatea bacteriilor gram pozitive.

Structura modulara si domenii de legare comune sugereaza faptul ca acestea deriva dintr-o serie de evenimente de recombinare genetice si transfer orizontal de gene.

Multe MSCRAMMs sunt capabile sa lege mai mult de o componenta a matricei, iar o singura specie poseda adesea proteine diferite care leaga aceeasi componeta a gazdei. De exemplu, Streptococcus pyogenes are, cel putin, trei proteine capabile sa lege fibronectine (SfBI, prtF, GADH), in timp ce Streptococcus dysgalactiae si unele tulpini de Staphylococcus aureus au doua (FnBA si FnBB, respectiv FnBPA si FnBPB).

Corelatia dintre specia bacteriana implicata in aderenta, adezina caracteristica si receptorul specific al ECM poate fi urmarita in tabelul de mai jos:

Alte proteine de suprafata leaga un numar variabil de proteine serice, incluzand albumina, factorii de reglare ai complementului, formele solubile de fibrinogen si fibronectina, molecule preinflamatorii plasminogen si kininogen.

Ex. proteina A stafilococica care leaga domeniul Fc al IgG (blocand opsoninofagocitoza).

Proteine bacteriene de suprafata leaga molecule prezente pe suprafata celulei gazda, o functie care poate ajuta bacteriile fie sa adere, fie sa invadeze celula respectiva. Proteinele de suprafata care leaga moleculele serice sau moleculele de suprafata ale celulelor nu sunt denumite tehnic drept MSCRAMMs, chiar daca ele au rol in aderarea la tesutul gazda.

Proteina M6, caracteristica grupului A streptococic (GAS), mediaza aderenta la substrat celular HEp-2 si keratinocite. Legarea proteinei M6 la la substratul celular tip HEp-2 pare sa necesite o glicoproteina ce contine fucoza. Pe de alta parte, ligandul de pe suprafata keratinocitelor responsabil de legarea proteinei M a fost identificat ca fiind cofactor proteic membranar (MCP sau CD46).

Adezine neproteice la gram -+

Acidul teicoic, un polimer de glicerol sau glicerolfosfat legat la membrana sub forma de acid lipoteicoic. Rolul acizilor teicoici din peretele celular ete multiplu, ei furnizand specificitate antigenica, confera rigiditate peretelui celular si virulenta crescuta bacterilor opunandu-se procesului de fagocitoza, sunt implicati in trasportul ionilor in si in afara celulei. Sunt structuri moleculare filamentoase, foarte asemanatoare fimbriilor, cu rol de aderenta la substrat. La Str. pyogenes, acizii lipoteichoici au efect sinergic cu proteina M.

Structuri externe reprezentate de un polizaharid extern legat covalent (exemplu: hidrocarbonatul C de la Streptococcus) sau de proteine (proteina M de la Streptococcus). Aceste structuri superficiale au rol e adezine specifice fiind responsabile de fenomenul de adeziune la suprafete specifice.

Peretele celular functioneaza deasemenea, ca o structura de suprafata care permita bacteriilor gram pozitive sa interactioneze cu mediul lor inconjurator, in particular cu tesuturile gazdei infectate. Toate aceste functii necesita ca proteinele de suprafata si enzimele sa fie tintite propriu-zis pe suprafata anvelopei.

Sortarea peretelui celular implica atasarea covalenta a proteinelor de suprafata la peptidoglican prin intermediul semnalului de sortare C-terminal, care contine o secventa consens LPXTG, secveta inalt conservata. Au fost identificate mai mult de 100 de prteine care poseda semnal de sortare pe peretele celular, incluzand proteina M (Streptococcus pyogenes), proteina A (Staphylococcus aureus), internalinele (Listeria monocytogenes). Tintirea (cell wall targeting) peretelui celular implica atasarea necovalenta a proteinelor la suprafata celulei prin intermediul domeniilor de legare specializate. Multe dintre aceste domenii de legare de perete par sa interactioneze cu polimeri secundari ai peretelui, care sunt asociati peptidoglicanilor, asa cum sunt acizii teicoici si polizaharidele.

Ancorarea proteinelor de suprafata

Adezinele la gram -

Adezine ale bacteriilor Gram negative.

Spre deosebire de bacteriile Gram pozitive, bacteriile Gram negative au o anvelopa constituita dintr-un invelis multiplu, lipsit insa de acizi teicoici. Pretele celular este alcatuit astfel din doua structuri majore: membrana externa in structura careia intra proportii aproximativ egale de fosfolipide (35%), proteine (15%) si lipopolizaharide (50%) si un complex peptidoglican-lipoproteina.

Fosfolipidele alcatuiesc dublul strat al membranei externe in care sunt inclavate prateine si lipopolizaharide (LPS). LPS prezinta doua structuri : lipidul A inclus in membrana si cu structura similara mai multor specii bacteriene si polizaharidul O (antigenulO), atasat lipidului A si dispus spre exterior, cu structura si compozitie chimica variabila fiind responsabil de specificitatea antigenica a celulei. (poza de scanat manual Microboilogie)

Adezine proteice

Majoritatea adezinelor caracterizate la bacteriile gram negative par sa actioneze asemanator lectinelor, recunoscand structuri carbohidrate de pe tesuturile gazda

Fimbriile. Acestea sunt structuri filamentoase, neflagelare ale suprafetei celulare si sunt diferite de pilii participanti la conjugare. Fimbriile fac parte din categoria lectinelor si se gasesc numai la bacteriile Gram negative. Ele se leaga de receptori specifci ai membranei celulare. Fimbriile care apartin aceluiasi tip sunt formate din molecule proteice identice. Diferitele variante fimbriale se deosebesc prin lungimea filamentului si prin gr. mol. a monomerilor polipeptidici constitutivi.

Acesti apendici sunt structuri lineare compuse din subunitati proteice majore repetitive, cu structura in a-helix. Subunitatile proteice minore, prezente in cantitate stoechiometrica scazuta in comparatie cu subunitatile majore, apar periodic de-a lungul structurii fimbriale. Diferite asfel de subunitati minore mediaza aderenta specifica a tipurilor fimbriale carora apartin, asa cum este cazul pililor Pap (pyelonephritis-associated-pili) si fimbriilor tip 1 si tip 3. Subunitatile majore pot avea un dublu rol: structural si adeziv, ca de exemplu fimbria K99 de la E. coli.

Cele mai bine caracterizate lectine sunt fimbriile tip 1 caracteristice E. coli, care se leaga preferential la glicoproteinele de suprafata care contin manaza si P-pili codificate de operonul pap, descoperite tot la E. coli enteropatogenice si care leaga specific secventa Gal a (1-4) Gal.

Fimbriile tip 1 au fost descoperite la majoritate tulpinilor de E. coli dar ele sunt prezente la un numar mare de membri ai familiei Enterobacteriaceae (Klemm & Krogfeld, 1994), fiind implicate in procese patologice prin conferirea capacitatii de aderare a acestor tulpini bacteriene la tractul urinar.

Tipuri de adezine la bacteriile gram negative

In aceiasi categorie sunt incluse o categorie de proteine din structura membranei externe a bacteriilor Gram negative, care indeplinesc functia de adezine.

Pe langa fimbrii si pili, functii de adezine pot avea si o serie de proteine bacteriene de suprafata, un asfel de exemplu fiind proteina A de pe Aeromonas salmonicida si proteine Yad A prezenta la Yersinia enterocolitica si Yersinia pseudotuberculosis.

BAdezine comune la Gram-+ cit si la Gram-

Grupul adezinelor neproteice. Cele mai comune adezine neproteice sunt polizaharidele care intra in structura unei retele de tip glicocalix, de tip capsular sau a unei structuri neorganizate de tipul stratului mucos. Ele sunt prezente la bacteriile Gram pozitive si Gram negative.

Exopolizaharidele formeaza structuri capsulare la multe bacterii patogene si au consistenta de geluri hidratate. Ca factori de virulenta, exopolizaharidele au doua roluri majore:

a)Aderenta de substratul tisular. Dupa Gristina si colab. (l985), atat suprafata celulei bacteriene cat si a substratului tisular sunt polianionice. Sarcinile electrice asemanatoare determina respingerea celulei bacteriene de catre substratul tisular. Fortele de respingere sunt contracarate de fortele de atractie London-van der Waals. Ele permit realizarea unor interactiuni hidrofobe intre moleculele suprafetei bacteriene si ale celulei gazda. Exopolizaharidele bacteriene intensifica interactiunile dintre liganzii bacterieni si tisulari. Astfel, tesutul este acoperit de un biofilm, in care agregatul de celule bacteriene, inconjurat de o matrice moleculara adera strans de substrat.

b)Protectia celulei bacteriene fata de sistemele de aparare a gazdei. Capsula impiedica fagocitarea pentru ca bacteriile capsulate formeaza microcolonii si inglobarea lor de catre fagocite devine dificila. Cu cat suprafata celulei bacteriene este mai hidrofila, cu atat este mai greu fagocitata. Pe de alta parte, complementul si anticorpii nu au acces la suprafata celulei. Unele specii bacteriene produc o capsula, a carei compozitie chimica este asemanatoare componentelor tisulare. O astfel de capsula camufleaza celula bacteriana fata de sistemul imunitar. De exemplu, capsula de la Str. pyogenes si Pasteurella multocida contin acid hialuronic.

Matricea moleculara polizaharidica, cu structura fibroasa favorizeaza cresterea celulelor si stabilitatea biofilmului. Stabilitatea biofilmului asigura formarea continua de microcolonii, persistenta si extinderea infectiei cronice. Din structura sa "scapa" periodic celule bacteriene care trec in sange sau in lichidele tisulare adiacente, favorizand extinderea infectiei.

Adezinele neproteice sunt mai putin eficiente in medierea proceselor de aderenta bacteriana, comparativ cu adezinele proteice. Polizaharidele capsulare, in anumite cazuri favorizeaza aderenta, iar alteori au efect invers (de exemplu, polizaharidele impiedica aderenta celulelor de H. influenzae, N. meningitidis sau P. multocida tip A).

Receptori de adezine

Interactiunea dintre celula epiteliala sensibila si adezinele bacteriene este mediata de receptorii de adezine si se bazeaza pe principiul complementaritatii spatiale. Uneori, interactiunea este nespecifica, ceea ce explica faptul ca unele specii bacteriene (Salmonella, Yersinia) infecteaza atat celulele intestinale umane, cat si liniile celulare de Drosophyla. Alteori, interactiunea are un grad inalt de specificitate. De exemplu, Str.pyogenes se localizeaza la nivelul epiteliului faringian si foarte rar in tractul urinar, iar E. coli colonizeaza epiteliul intestinal si al cailor urinare, dar foarte rar pe cel respirator.

Helicobacter pylori, un patogen specific uman, adera de celulele epiteliale ale mucoasei gastrice, dar nu de celulele profunde ale mucoasei sau ale colonului. Pe celulele epiteliului, H. pylori recunoaste antigenul de grup sanguin Lewis, dar probabil si alte molecule, deoarece H. pylori infecteaza si indivizi negativi pentru acest antigen. Un factor esential pentru colonizare este ureaza, pe care H. pylori o produce in cantitati foarte mari. In vitro, celulele de H. pylori hidrolizeaza ureea, eliberand amoniul care neutralizeaza aciditatea si permite colonizarea initiala. Amoniul generat prin hidroliza ureii produce NH₄OH care se disociaza si ionul OH^- produce leziuni ale mucoasei.

Atasarea bacteriilor la tesutul gazda presupune trei mecanisme de interactie adezina-receptor:

legarea la matricea extracelulara;

legarea directa la receptorul de pe membrana celulei gazda;

legarea indirecta prin intermediul unei "punti de legatura".

Receptorii de adezine ai celulelor epiteliale sunt molecule din familia integrinelor, care indeplinesc functii fiziologice importante: leaga proteine plasmatice, dar si proteine din matricea extracelulara (fibronectine, fibrinogen, laminina, colagenul de tip I etc.).

Recunoasterea integrinelor ca o familie de receptori de suprafata de larga exprimare s-a facut in anul 1987. La acea data se puteau indentifica circa 10 integrine distincte. Integrinele sunt clasificate in trei mari subfamilii in functie de subunitatea b continuta, deoarece fiecare subunitate b se poate asocia cu diferit subunitati a

-b1-integrinele : cu prototipul VLA1-6 (very late activatione);

-b2-integrinele : cu membrii LFA-1 (lymphocyte function associated antigen- CD11a/CD18), MAC-1 ( CD11b/CD18), si p150, 95 (CD11c/CD18);

-b3-integrinele: cu complexul glicoproteic trombocitar IIb/IIIa, receptorul vibronectinei; se mai numesc si citoadezine;

-b4-integrina: a6b4 exprimat la nivel epitelial.

Bacteriile interactioneaza doar cu o familie de integrine leucocitare, b2-integrinele. Aceasta familie de integrine este restrictionata pe leucocite si participa in fagocitoza particulelor invelite (opsonizate) de complement si in transmiterea leucocitelor din sange in tesut. b2-integrinele au fost tintite de catre bacterii probabil, pentru ca ele mediaza preluarea in interiorul fagocitelor fara o explozie oxidativa.

Lucrari recente sugereaza faptul ca bacteriile coopteaza reteaua de integrine pentru a adera si a invada celulele umane. Ele utilizeaza astfel trei strategii care sa le permita invadarea si supravietuirea intracelulara:

1. Legarea directa a adezinelor bacteriene la situsul de recunoastere al secventei RGD (arginina-glicina-acid aspartic) de pe integrinele CD18. Acest mecanism este cel mai evident cand adezinele bacteriene contin un triplet RGD in secventa lor. Cele mai directe indicii privind implicarea tripletului (sau a altei regiuni care se comporta ca un triplet RGD) in recunoasterea integrinelor este slabirea aderentei in cazul unei mutatii la nivelul tripletului. De axemplu, legarea hemaglutininei filamentoase (FHA) de la Bordetella pertussis la CR3 implica o secventa RGD. Mutantele bacteriene la care secventa RGD este schimbata in RAD nu adera. Slabirea aderentei indica asfel participarea secventei RGD la aderare, mimand recunoasterea naturala a liganzilor RGD de catre integrine.

2. Legarea directa a adezinelor bacteriene la situsuri accesorii, care sunt situsuri non-RGD (ca de exemplu carbohidratii de pe integrinele glicozilate).

3. Legarea la proteina bacteriana de suprafata a unei proteine serice (C3bi), care se comporta ca o punte de legatura intre bacterie si integrina CD18 (fenomenul poarta denumirea si de "mascare"). Patogeni ca Legionella si Mycobacterium captureaza C3bi pe suprafata lor si asfel se leaga la CR3. Pentru a determina daca bacteriile utilizeaza un produs de degradare a componentei C3 ca punte de legare de CR3, bacteriile sunt incubate 20 minute, la 37^o C in ser proaspat neimun inactivat (fresh or heat-inactivated nonimmune serum). Bacteriile sunt spalate apoi de doua ori cu P.B.S. (fosfat buffer salin) fara Ca²⁺ si Mg ²⁺, inainte de a fi utilizate in studii de aderenta. Daca bacteriile incubate in ser proaspat exprima o aderenta crescuta la macrofage in comparatie cu cele incubate in ser inactivat (heat-inactivated serum), aceasta este o dovada clara ca opsonizarea cu complement este un factor important pentru aderenta.

E-cadherinele

E-cadherina este o glicoproteina transmembranara de 120kDa care este exprimata pe toate celulele epiteliale embrionare si adulte si pe alte cateva tipuri de celule, numite melanocite, monocitele precursoare ale monoclastelor si celulele dendritice. E-caderina formeaza un complex cu cateninele, proteine citoplasmatice care sunt legate de numerose alte proteine-receptor sau nonreceptor. Interactiile extracelulare sunt, majoritatea, homofile (cu alta E-caderina) si homotipice (cu celule de acelas tip), ambele tipuri de interactii fiind deasemenea demonstrate. Este evident ca acest complex E-cadherina/catenina serveste nu numai la adeziunea celulara ci si ca semnal al transductiei.

Parazitii nu exprima E-cadherina. Cadherinele clasice E, N, P se pare ca apar la celulele vertebratelor (F. Nollet). Sistemul putativ cadherina/catenina fondat pe baza omologiei de secventa la Caenorhabditis elegans a avut o functie in morfogeneza diferita de cea de la vertebrate.

In timpul invaziei bacteriene E-cadherina de pe celula gazda serveste ca promotor al invaziei. Paradigma este bacteria Listeria monocytogenes imobila. Invazia pleaca de la interactia cu membrana plasmatica a celulei gazda, prin fenomenul de aderenta bacteriana, determinand inducerea fagocitozei. Dupa internalizare, membrana fagocitului este dizolvata si bacteria, acum libera in citosol, asambleaza filamentele de actina. E-cadherina este receptorul de suprafata al celulei gazda pentru proteina bacteriana de suprafata, numita internalina A (InlA), de care este nevoie in invazia intracelulara. Legatura E-cadherina/ internalinaA (IlnA)a fost demonstrata prin cromatografie de afinitate. Implicate in aceasta interactie heterofila dintre E-cadherina si InlA sunt domeniile de repetitie bogate in leucina ale IlnA legate de regiunea EC1 a E-cadherinei. Aici prolina din pozitia 16 a E-cadherinei este esentiala, asa cum evidentiaza mutatiile din regiunea EC1 sau din domeniile repetate bogate in leucina.

Din punct de vedere chimic, receptorii de adezine sunt glicoconjugate: glicoproteine ale membranei celulare sau ale stratului mucopolizaharidic si glicolipide din structura membranei.

Glicoproteinele si glicolipidele proemina la suprafata membranei celulare si expun la exterior catene oligozaharidice mai mult sau mai putin complexe, cu rol de receptori de adezine.

Glicoproteinele din stratul mucopolizaharidic au gr. mol. cuprinse intre 2 x l0⁵ - l5 x l0⁶ si sunt formate din catene polipeptidice legate prin punti S-S. Catena oligozaharidica este formata din N-acetil-galactozamina, N-acetil-glucozamina, fucoza, galactoza si acid sialic. Glicoproteinele din mucus se gasesc si in secretii (salivara, digestive).

Glicoproteinele membranare se deosebesc de cele din mucus: N-acetil-galactozamina lipseste, locul ei fiind luat de manoza si de acizii uronici. Catenele glicoproteice ale mucusului si ale suprafetei celulare sunt asemanatoare cu cele ce se gasesc pe suprafata eritrocitelor si formeaza antigenele de grup sanguin. Asa se explica proprietatile hemaglutinante pe care le poseda anumite adezine bacteriene, daca receptorul lor celular se gaseste pe hematii.

Glicoconjugatele pot avea rol de receptori pentru toxine. De exemplu, glicolipidul GM₁, prin componenta sa oligozaharidica este receptor specific al toxinei holerice.

Detectarea localizarii receptorilor glicoproteici si glicolipidici pe suprafata celulei este posibila prin utilizarea lectinelor. Lectinele sunt glicoproteine ce se combina specific cu un rest oligozaharidic. Lectinele cuplate cu un derivat fluorescent sunt utilizate pentru a studia repartitia receptorilor suprafetei celulare.

Modularea expresiei proprietatilor de aderenta se poate face, teoretic, prin interventie la nivelul receptorilor celulari, blocand direct activitatea lor, cu analogi structurali ai adezinei bacteriene. A II-a modalitate de interventie este blocarea activitatii adezinei, cu anticorpi specifici anti-adezina, fie utilizand antibiotice la doze subinhibitorii. De exemplu, aderenta streptococilor poate fi inhibata in vitro, daca la mediul de reactie se adauga acid lipoteichoic, analogul structural al adezinelor acestor bacterii.

Inhibitia aderentei prin utilizarea analogilor structurali ai receptorilor celulari s-a demonstrat pentru S. typhimurium si Sh. flexneri. D-manoza, adaugata in mediul de reactie inhiba aderenta lor de eritrocitele de cobai. Bacteriile poarta fimbrii de tip I, al caror receptor celular este manoza.

Blocarea partiala sau totala a adezinei prin intermediul anticorpilor specifici este considerata ca o modalitate eficienta de protectie. Astfel, starea imunitara postvaccinala sau consecutiva unei infectii, asigura o protectie buna fata de o infectie ulterioara cu acelasi agent sau cu alti agenti care au adezine comune.

Utilizarea antibioticelor la doze subinhibitorii este o modalitate de a modifica expresia adezinelor. Dozele subinhibitorii blocheaza partial sau total, biosinteza unor constituienti ai suprafetei celulare, antrenand si modificari ale anumitor proprietati, inclusiv a celor de aderenta.

Receptorii celulari de adezine se modifica, atat cantitativ cat si calitativ.

Modificarile receptorilor celulei gazda pot favoriza aderenta si invazia tisulara. Un exemplu este infectia severa produsa de Str. pneumoniae, care colonizeaza 10 din 25 de indivizi umani si determina infectii clinice(pneumonie, otita medie, septicemie) la 1 din 200 indivizi. Sensibilitatea la infectie creste foarte mult consecutiv unei infectii virale a tractului respirator. Citochinele gazdei activeaza receptorul pentru PAF(platelet activating factor), pe suprafata celulelor epiteliului pulmonar. Pneumococii ambelor tipuri de colonii(transparente si opace) adera de suprafata celulei pulmonare, dar cei ce produc colonii transparente invadeaza circulatia sistemica prin capilarele pulmonare ori prin vasele limfatice. Asa se explica predispozitia pacientilor infectati cu virus, la complicatiile consecutive pneumoniei pneumococice(meningita, septicemie).

Interactia unui patogen cu celula gazda nu este mediata totdeauna de receptori celulari. Adeseori, bacteriile patogene activeaza caile de semnalizare ale celulei, direct prin componentele celulare sau prin intermediul citochinelor inflamatorii.

Sideroforii ca factori de virulenta

4.5.Activitatea fier (III) reductazica:

Se stie ca Fe este un element absolut necesar pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor. De aceea organismele superioare au dezvoltat o serie de proteine care leaga Fe cu foarte mare afinitate facindu-l inaccesibil pentru microrganisme. Cu toate acestea, microorganismele au dezvoltat diferite sisteme de preluare a Fe: sideroforii si sistemele enzimatice inductibile.

Sideroforii sunt compusi organici cu masa moleculara relativ mica, produsi de bacterii si microfungi, care au capacitatea de a lega specific Fe(III), facindu-l disponibil microorganismului iNeilands, 1995s. Sunt sintetizati atunci cind concentratia Fe din mediu scade foarte mult.

A doua strategie o constituie sinteza unor enzime extracelulare (libere sau ancorate de suprafata celulara) care manifesta activitate Fe(III) reductazica. O astfel de activitate enzimatica este intilnita la:

bacterii: Streptococcus mutans iEvans si colab., 1986s, Legionella sp. iJohnson si colab., 1991s

fungi: Candida albicans iMorrissey si colab., 1996s, S. cerevisiae iEide si colab., 1992s etc.

In cazul speciei L. monocytogenes s-au descris trei mecanisme de preluare a Fe: activitatea Fe(III) reductazica extracelulara iBarchini si Cowart, 1996s, un sistem inductibil de preluare a citratului feric iAdams si colab., 1990s si un sistem ce permite folosirea transferinei umane ca unica sursa de Fe iHartford si colab., 1993s

In afara de faptul ca este un nutrient esential pentru microorganisme, Fe mai este folosit de acestea si ca un semnal ce permite reglarea expresiei diferitelor gene ce codifica factori de virulenta. Astfel la multe specii bacteriene exista o proteina denumita ferric uptake regulator (Fur) care sesizeaza nivelul de Fe din mediul extracelular si astfel permite reglarea expresiei diferitelor gene de virulenta.

Sideroforii sunt molecule mici, care au in structura lor, grupari caracteristice de tipul catechol, fenolat sau hidroxamat. Ei au o structura moleculara caracteristica, definita functional ca o "cusca moleculara", cu rolul de a lega Fe.

Fe este legat in centrul sideroforilor cu o afinitate echivalenta celei de legare cu transferina. Sideroforii pot prelua ionii de Fe chiar din compusi minerali, ca hematita.

Multiplicarea bacteriilor in tesuturile gazdei este limitata de mecanismele de aparare ale gazdei si este conditionata de prezenta obligatorie a Fe²⁺ (forma accesibila metabolismului). Fe este necesar desfasurarii unor variate reactii enzimatice, esentiale pentru crestere, fiind un cofactor de sine statator sau parte a unui grup prostetic, in special de tip hem. Fe este un component esential al catenei de transport al electronilor in membrana celulara.

In mediile naturale, ca si in organismul uman si animal, Fe se gaseste in cantitati suficient de mari pentru a asigura cresterea microorganismelor, dar este in forme inaccesibile. Astfel, concentratia normala a Fe in plasma mamiferelor (mai mica de lo uM) este satisfacatoare pentru cresterea si multiplicarea bacteriilor, dar numerosi factori il fac inaccesibil microorganismelor. Practic, Fe disponibil lipseste. Un deficit partial al Fe are efect bacteriostatic, iar deficitul major are efecte letale, prin inhibitia sintezei proteinelor. Fe anorganic este insolubil in aerobioza la pH fiziologic.

In mediile naturale, Fe este legat de agenti chelatori (compusi chimici in care un ion metalic multivalent este captat, sechestrat si legat in structura ciclica a agentului chelator). In organismul uman si animal, Fe este legat in complexe organice cu proteinele (feritina, hemosiderina, gruparea hem din hemoglobina, sau din mioglobina), cu glicoproteine extracelulare (lactoferina din lapte, saliva, lacrimi), precum si cu transferina din sange si limfa. Toate aceste molecule au o mare afinitate de asociere cu Fe si in mod normal sunt partial saturate. Transferina, proteina majora de transport a Fe in plasma sanguina are ocupata numai 30% din capacitatea sa de legare. In ser, hemoglobina (Hbg) este complexata cu alte proteine cu alte proteine ca haptoglobina, iar cantitati mici de hem pot fi legate de albumina sau de hemopexina. Fierul intracelular poate fi asociat cu Hbg, transferina sau cu lactoferina sau este depozitat sub forma feritinei.

Proteinele de legare reduc concentratia Fe³⁺ liber in organism, la valori foarte scazute. Nivelul Fe biodisponibil este estimat la 10^-18 M, de cateva ori mai mic decat nivelul cresterii normale. Dupa administrarea parenterala a Fe la cobai, sensibilitatea la infectia cu K pneumoniae a crescut dramatic, ceea ce demonstreaza rolul aprovizionarii cu Fe asupra patogenezei bacteriilor. De aceea, serul sanguin uman este bacteriostatic.

Din aceste cauze, bacteriile si-au elaborat mecanisme adaptative prin care mobilizeaza Fe si il disponibilizeaza pentru activitatile celulei. Bacteriile cu localizare intracelulara dobandesc Fe din rezerva celulei. L. monocytogenes produce un reducator care reduce Fe³⁺ la Fe²⁺ si astfel Fe este eliberat din glicoproteinele chelatoare intracelulare.

Fe intracelular poate fi obtinut prin liza celulei gazda, mediata de citolizine sau hemolizine. Se elibereaza Fe, hemul sau Hbg. Unele bacterii folosesc Fe din celulele care degenereaza la suprafata epiteliilor mucoase. Neisseria si Prevotella (Bacteroides) elimina proteaze specifice care degradeaza transferina si elibereaza Fe.

Cel mai raspandit mecanism prin care bacteriile isi obtin Fe in organismul gazda, este sinteza agentilor chelatori care intra in competitie cu mecanismele gazdei care sechestreaza Fe. Denumirea generala a agentilor chelatori bacterieni este cea de siderofori.

In conditiile deficitului de Fe, enterobacteriile sintetizeaza o varietate de siderofori, care apartin la doua grupuri chimice: de tip fenolat sau de tip hidroxamat. Grupul cel mai comun este de tip fenolat, cel mai cunoscut reprezentant fiind enterobactina (enterochelina). La E. coli, in conditiile de restrictie a Fe, translocatia Fe³⁺ in celula si conversia sa in forma utilizabila (Fe²⁺) se face prin doua mecanisme:

l)Sinteza si secretia sideroforilor. Sideroforii sunt agenti chelatori ai Fe, cu gr. mol. mica (600 D), de mare afinitate, capabili sa preia competitiv Fe legat de proteinele gazdei. Complexul Fe³⁺ - siderofor este recunoscut de un receptor situat in membrana externa si nu poate trece prin canalele membranei celulei bacteriene datorita dimensiunilor sale. Transferul membranar al Fe³⁺ mediat de receptor, este asociat cu reducerea lui la forma feroasa (Fe²⁺), iar sideroforul ramane la nivelul receptorului.

Sideroforii se gasesc nu numai la bacteriile patogene, ci constituie mecanisme eficiente de preluare a Fe in tot regnul procariotelor. In functie de specie, ei sunt factori cu diferite grade de virulenta.

2)Un alt mecanism de preluare a Fe este propriu unor bacterii patogene care colonizeaza mucoasele (Neisseria, Bordetella). Ele nu secreta siderofori, dar preiau Fe pe o cale directa, prin contactul selectiv intre componentele membranei externe, cu proteinele care leaga Fe (transferina, lactoferina sau chiar hemoglobina). Neisseria sp. si H. influenzae utilizeaza ca surse de Fe numai transferina si lactoferina umana, ceea ce ar explica specificitatea lor pentru gazdele primate.

Fe are nu numai un rol fiziologic deosebit, dar multe bacterii il utilizeaza pentru activarea unor factori de virulenta: toxine, adezine, invazine.

b)Agresivitatea (Invazivitatea)

Puterea de invazie (agresivitatea sau invazivitatea) reprezinta capacitatea agentilor patogeni de a depasi prin mecanisme specifice, barierele epiteliale, de a patrunde in tesuturile gazdei si de a se multiplica, producand efecte patologice. Microorganismele invazive au capacitatea de a patrunde prin mijloace proprii in tesuturile gazdei sau de a stimula functia endocitara a substratului si de a-si pastra viabilitatea in mediul gazdei.

Invazia este modalitatea prin care microorganismele infectioase sparg barierele epiteliale ale gazdei. Multe bacterii patogene au capacitatea de a supravietui in interiorul celulei eucariote. Ele patrund in celule care, in mod obisnuit nu sunt fagocitare(celulele mucoase, celulele endoteliale ale vaselor sanguine). Mediul intracelular ofera protectie microorganismului, care ori se replica ori persista.

In general, organismele invazive adera de celula gazda, prin intermediul unei clase de molecule de adezine, denumite invazine, care orienteaza intrarea bacteriei in celula. Mecanismele de aderenta declanseaza sau stimuleaza semnalele celulare, care direct sau indirect usureaza intrarea bacteriei. Invazia este un eveniment activ, sustinut de functiile normale ale celulei. Suportul procesului de invazie si inglobare este citoscheletul celulei gazda.

Un numar mic de specii bacteriene par sa forteze intrarea directa in celula gazda, printr-o digestie enzimatica locala a membranei celulei gazda, dupa aderenta. De exemplu, R. prowazecki secreta fosfolipaze care produc degradarea localizata si controlata a membranei celulei gazda. Prin leziunile membranare, agentul patogen intra direct in citoplasma.

In categoria invazinelor intra o categorie de proteine asociate suprafetei celulare, dar si apendicele celulare evidentiate la microscopul electronic (fimbrii si flageli) sau cele care constituie un strat fin, inalt organizat, pe suprafata celulei. Invazinele usureaza raspandirea bacteriilor in organism, dupa fixarea si multiplicarea lor la poarta de intrare.

Flagelii ca organite de motilitate sunt in acelasi timp invazine, deoarece confera un avantaj evident celulelor bacteriene care trebuie sa traverseze stratul vascos de mucus, pentru a ajunge la celulele epiteliale ale tractului digestiv sau respirator.

Fimbriile, la bacteriile patogene, au rol de adezine bacteriene, dar in aceiasi masura ele constituie si un factor de agresivitate, deoarece confera un grad de protectie a celulei fata de factorii de aparare a gazdei.

Unele invazine produc efect necrotic sau determina alte modificari care favorizeaza colonizarea tisulara progresiva. De exemplu, unele bacterii produc hialuronidaza si alte enzime cu efect hidrolitic fata de polimerii din substanta fundamentala a tesutului conjunctiv, favorizand astfel intrarea bacteriilor in vasele sanguine si limfatice. Enterobacteriile au mecanisme proprii de invazie. Agentii patogeni enterici strapung bariera mucoasei intestinului subtire, prin motilitate flagelara, la nivelul unor celule epiteliale specializate, denumite celule M (Microfold). Ele acopera placile Peyer si pinociteaza material luminal sub forma solubila, pe care il transfera macrofagelor subiacente. Macrofagele prelucreaza antigenele si le prezinta limfocitelor adiacente. Celulele M sunt considerate ca un sistem timpuriu de avertizare a sistemului imunitar. Ele sunt acoperite cu un strat mucos subtire, microvili scurti, dar sunt foarte active din punct de vedere al pinocitozei, comparativ cu celulele epiteliale columnare. Au putini lizosomi si materialele inglobate nu sunt supuse degradarii. Desi celulele M au evoluat ca un sistem protector strategic, proprietatile lor functionale le confera calitatea unor adevarate porti de intrare - un calcai al lui Achile al intestinului, deoarece bacteriile patogene dobandesc acces spre structurile profunde.

S. typhi, adeseori produce perforatii intestinale si probabil, leziunile cauzate la nivelul placilor Peyer sunt sursa acestor perforatii. Celulele M emit pseudopode si inglobeaza bacteriile in vacuole membranare.

La nivelul intestinului gros, a nazofaringelui si a bronhiilor se gasesc structuri echivalente celulelor M, situsuri la care are loc invazia agentilor patogeni.

Bacteriile care au o mare putere de invazie produc, in general, infectii generalizate ale organismului. Capacitatea de invazie poate lipsi la unele bacterii, care fiind foarte toxigene pot produce efecte letale prin intoxicatie.

c)Toxigenitatea

Toxigenitatea (toxigeneza) reprezinta capacitatea unui agent patogen de a elabora in cursul cresterii sale, una sau mai multe substante toxice. Toxigeneza este o proprietate esentiala a patogenitatii bacteriene.

Sub denumirea de toxina sunt cuprinse toate substantele toxice de provenienta biologica (sintetizate de bacterii, fungi, celule vegetale sau animale). Termenul de "toxina" deriva din cuvantul grecesc "toxicon", care inseamna otrava.

Se cunosc circa 140 de toxine proteice, din care 2/3 sunt produse de bacteriile Gram pozitive. Unele specii bacteriene produc intre 5 si l0 tipuri de toxine.

Capacitatea de a elabora toxine nu este limitata la bacteriile patogene propriu-zise. Numeroase saprobacterii produc substante toxice, uneori foarte puternice (de exemplu, toxina botulinica produsa de Cl. botulinum). Toxigenitatea bacteriana variaza in cadrul aceleiasi specii si este dependenta de conditiile de mediu.

Clasificarea toxinelor

Pentru a-si exercita efectul, toxinele trebuie sa se elibereze din celule si sa se solubilizeze in umorile organismului. Dupa sinteza, toxinele pot ramane asociate permanent sau temporar cu celula sau sunt eliminate la exterior. Aceste diferente sunt dependente, in primul r@nd de specia producatoare, precum si de fazele succesive ale evolutiei unei populatii bacteriene: faza exponentiala, stationara sau de declin. Chiar toxinele care in faza exponentiala a culturii bacteriene sunt asociate celulei, in faza de declin se gasesc libere in mediul extracelular datorita lizei celulelor. Din aceasta cauza, studiul raportului topologic intre celula si toxina are semnificatie numai pentru faza de evolutie a culturii bacteriene. Din acest punct de vedere se disting urmatoarele categorii de toxine:

a)toxine localizate in celula (citoplasmatice) produse de bacterii Gram negative (Sh. dysenteriae, Y. pestis, B. pertusis, E. coli etc.) si Gram pozitive (enterotoxina produsa de Cl. perfringens, streptolizina S, pneumolizina produsa de S. pneumoniae, o toxina sintetizata de Cl. difficile). Toate sunt de natura proteica;

b)toxinele constitutive ale peretelui celular, produse numai de bacteriile Gram negative si care corespund endotoxinelor clasice. Din punct de vedere chimic, endotoxinele sunt complexe glicolipidice sau glicolipoproteice. Ele nu sunt niciodata eliberate in cursul fazei de crestere exponentiala, ci numai prin dezagregarea peretelui celular;

c)toxinele eliminate in mediul extern sau exotoxinele propriu-zise sunt de natura proteica si sunt produse mai frecvent de bacteriile Gram pozitive (toxina difterica, toxinele stafilococice, toxina de B. anthracis etc.), dar si de cele Gram negative (V. cholerae, Ps. aeruginosa);

d)toxinele cu localizare mixta (endocelulara si exocelulara), in functie de faza de evolutie a culturii bacteriene. In faza exponentiala, toxinele sunt secretate partial in mediu, dar o fractie semnificativa ramane in interiorul celulei si este eliberata prin autoliza (toxinele tetanica, botulinica).

Mult timp s-a considerat ca exotoxinele sunt de natura proteica, iar endotoxinele - de natura lipopolizaharidica. Aceasta diferentiere nu este neta, deoarece unele toxine proteice apartin categoriei endotoxinelor, fiindca raman asociate celulei producatoare si invers, uneori, toxinele de natura lipopolizaharidica sunt eliminate la exterior ca exotoxine. De aceea, clasificarea toxinelor trebuie sa se faca dupa criteriul compozitiei chimice. Din acest punct de vedere, majoritatea sunt de natura proteica, iar majoritatea endotoxinelor sunt de natura lipopolizaharidica.

In raport cu tropismul lor se disting neurotoxine, enterotoxine, cardiotoxine, cu efecte limitate la tesutul respectiv sau toxine pantrope, cu efecte asupra multor categorii de tesuturi.

Exotoxine

Comparativ cu alte substante toxice, exotoxinele bacteriene au o toxicitate foarte inalta, atat in stare bruta sub forma filtratelor de cultura, dar mai ales in forma purificata. Astfel, toxina botulinica de tip D este de trei milioane de ori mai puternica dec@t stricnina luata ca etalon. Efectul toxic este variabil nu numai in functie de specia bacteriana producatoare, ci si de tulpina, chiar pe medii optime. In multe cazuri, toxigeneza se atenueaza sau chiar dispare prin subcultivare repetata.

In general, efectul toxinelor este variabil in functie de natura, v@rsta, greutatea, sexul si linia genetica a animalelor pe care sunt testate, ca si de tehnica si calea de administrare folosite.

Datele referitoare la toxigeneza se refera la administrarea lor parenterala, deoarece cu exceptia enterotoxinelor, toxinele uzuale sunt distruse de modificarile de pH sau de activitatea enzimelor digestive.

Potentialul toxic al toxinelor este ilustrat de date teoretice:

1)toxina botulinica de tip A purificata si cristalizata ar contine intr-un miligram, 1 2oo ooo DLM (doze limite mortale) pentru un kg corp cobai, ceea ce inseamna ca 1 mg de toxina poate sa omoare l 2oo tone de cobai sau doua milioane de soareci;

2)200 g neurotoxine (botulinica sau tetanica) ar putea omor@ intreaga populatie a globului.

Potentialul toxic al toxinelor bacteriene este dependent de calea de administrare. Dozele letale pentru caile respiratorie si digestiva sunt de loo - looo de ori mai mari dec@t pentru caile intravenoasa, intramusculara, intraperitoneala sau subcutanata. Pielea intacta este o bariera eficienta fata de toxine.

Determinismul genetic al sintezei toxinelor

Sinteza toxinelor bacteriene este codificata de gena tox, a carei localizare este cromosomala, plasmidiala sau fagica. La V. cholerae, subunitatile toxinei holerice sunt codificate de gene cromosomale, asociate cu alte gene ce codifica alti factori de virulenta. Astfel de grupe de gene de virulenta se numesc insule de patogenitate. Secventa lor difera mult de a altor gene cromosomale, ceea ce denota ca ele sunt achizitii relativ recente in evolutie. Ar putea sa aiba originea prin integrarea unui element genetic exogen - fagul.

La Cl. botulinum, gena tox, cu situs cromosomal, prezinta mai multe alele, care codifica sinteza a 7 serotipuri de toxina (notate A --- G), care nu dau reactie incrucisata semnificativa cu anticorpii obtinuti fata de una dintre ele.

Enterotoxinele si hemolizinele de E. coli, toxina dermo-exfoliativa stafilococica sunt codificate de gene plasmidiale.

Gena tox, codificatoare a toxinei difterice este localizata in genomul unor bacteriofagi ADN (beta, P, 1, W). Activitatea ei este controlata de o gena situata pe cromosomul bacterian.

Fagii purtatori ai genei tox se gasesc in celulele de C. diphteriae in stare integrata (profag), de fag virulent replicativ sau sub forma de replicon autonom represat. Este cunoscut modul de functionare a genei tox, purtata de fagul beta, ce se integreaza ca profag. Ea se gaseste aproape de situsul de insertie a genomului fagic in cromosomul bacterian, dar are propriul sau promotor si se poate exprima independent de alte gene fagice, dar poate fi represata fara sa afecteze biosinteza altor proteine fagice. Aceasta gena nu pare a fi esentiala pentru genomul fagc. Modificarea ei mutationala nu afecteaza ciclul de replicare a fagului. Se considera ca gena tox a acestui fag este de origine bacteriana, care a fost mobilizata prin procesul de transductie fagica.

Sinteza toxinei eritrogene streptococice (scarlatinoasa), precum si a toxinelor botulinice C si D este codificata de fagi temperati. La Cl. perfringens, toxigeneza este legata temporal de procesul sporularii. Sporularea este o conditie obligatorie, dar insuficienta pentru producerea toxinei. Toxina pare a fi un produs al unei gene de sporulare si este o proteina de structura a tunicii sporale.

Sinteza si eliberarea toxinelor

Majoritatea toxinelor de natura proteica sunt exotoxine. Ele sunt sintetizate si eliberate numai de celulele care cresc, aflate in faza logaritmica si de incetinire a ritmului de crestere. Exotoxinele apar in mediul extracelular imediat dupa debutul sintezei, sau dupa o anumita perioada, dar concentratia lor in mediul extracelular nu creste semnificativ in faza stationara sau cea de declin.

Sinteza lor pare sa se faca dupa un mecanism comun cu sinteza enzimelor extracelulare: ambele tipuri de molecule se sintetizeaza pe ribosomii ce tapeteaza fata interna a membranei citoplasmatice.

Exotoxinele se sintetizeaza sub forma unor molecule precursoare, mai lungi decat proteinele-toxine extracelulare. Molecula precursoare are o secventa semnal hidrofoba, N-terminala de l5-30 de aminoacizi, cu rol de mediator al transferului membranar al moleculei. Secventa semnal este excizata de o peptidaza membranara. Rezulta proteina hidrofila, activa functional.

Dupa sinteza, molecula de toxina este transferata prin peretele celular, adica prin reteaua mureinica, iar la bacteriile Gram negative si prin membrana externa. Moleculele de exotoxine sunt mici, au putine legaturi disulfidice si o rigiditate scazuta, ceea ce favorizeaza transferul lor prin invelisurile celulare.

Eliberarea endotoxinelor, componente ale peretelui celular la bacteriile Gram negative este conditionata de autoliza sau distrugerea pe cale fizica sau chimica a celulei bacteriene.

Receptori celulari pentru toxine

Interactiunea toxinelor cu celulele sensibile, asemenea altor biomolecule (hormoni, antigene, lectine, fatori reglatori etc.) este mediata de molecule specifice denumite receptori, situate in stratul extern al membranei citoplasmatice. Celulele sensibile nu au receptori specifici pentru toxine, deoarece ele nu-si programeaza structuri moleculare pentru a se sinucide. Toxinele imprumuta receptorii, care in mod obisnuit au rolul de a ingloba molecule utile metabolismului celular.

Se cunosc receptorii prin intermediul carora, cateva toxine interactioneaza cu suprafata celulei. De exemplu, receptorul celular pentru streptolizina O este colesterolul, iar alte cateva toxine au ca receptori, moleculele de gangliozide. Acestea sunt glicolipide, mai abundente in neuroni, alcatuite dintr-o componenta oligozaharidica legata de un ceramid (acid stearic si sfingozina). Gangliozidele difera intre ele, prin numarul si secventa resturilor glucidice componente, in special a acidului N-acetil neuraminic (NANA) sau acid sialic.

Toxina tetanica se leaga de gangliozide, in special de di- si tri-sialo-gangliozide, care contin doua si respectiv trei resturi de acid sialic, atasate de galactoza. Intre toxina tetanica si hormonul tireostimulator (TSH) exista o competitie de legare strict reciproca, pe membrana celulelor tiroidiene. Astfel s-a dedus ca receptorul neuronal pentru toxina tetanica este asemanator cu receptorul celulei tiroidiene pentru TSH.

Receptorul celular pentru toxina holerica este o molecula glicolipidica (GM₁). S-a observat o corelatie directa intre continutul membranar in GM₁ si sensibilitatea tisulara la toxina.

Toxina termolabila de E. coli, foarte asemanatoare toxinei holerice are acelasi receptor membranar (glicolipidul GM₁).

Receptorul celular al toxinei de B. pertusis pare a fi tot o gangliozida care contine acid sialic, iar receptorul toxinei difeterice ar fi o glicoproteina.

In raport cu localizarea tintei lor moleculare se disting doua nivele de actiune a toxinelor:

cele care au tinta finala la nivelul membranei;

toxine a caror tinta finala este citoplasmatica.

Tinta finala este structura a carei interactiune cu toxina produce efectul toxic, in timp ce receptorul are uneori rolul de tinta intermediara, desi alteori este chiar tinta finala.

Toxinele care actioneaza la nivelul membranei sunt active prin modificari structurale ale membranei citoplasmatice, urmate de ruperea acesteia. Consecinta este citoliza ori moartea celulei. Toxinele care consecutiv actiunii lor produc dezorganizarea membranei se numesc citolizine (respectiv hemolizine, daca celula tinta este eritrocitul).

Toxinele a caror tinta finala este intracelulara, mai intai traverseaza membrana si ajung in citoplasma.

Patrunderea moleculelor de toxina in celula

Toxinele bacteriene a caror tinta este intracelulara sunt molecule bifunctionale, ca si toxinele vegetale (ricina, abrina), bacteriocinele sau hormonii glicoproteici. Toate acste categorii de molecule sunt alcatuite dupa acelasi model functional: sunt monomere (de exemplu, toxina difterica, exotoxina de P. aeruginosa) sau sunt dimere (de exemplu, enterotoxina holerica si cea termostabila de E. coli). Cele monocatenare au un segment COOH-terminal, prin care se leaga la nivelul receptorului si un segment NH₂-terminal, care patrunde in citoplasma si interactioneaza cu tinta intracelulara. Pentru toxinele dublu catenare, functiile de legare (B-Binding) si de activitate propriu-zisa (A-Activity) sunt realizate separat de fiecare catena.

Patrunderea moleculei de toxina in celula se face prin unul din urmatoarele mecanisme; a)endocitoza mediata de receptori; b)pinocitoza nespecifica in faza lichida; c)transferul direct al moleculei prin membrana citoplasmatica.

Inglobarea prin mecanismul endocitozei mediate de receptori confera specificitate si eficienta actiunii moleculelor mari. Receptorii celulari glicoproteici, dupa interactiunea cu moleculele de toxina sufera o dinamica accentuata. In mod normal, moleculele cu rol de receptor sunt uniform distribuite in planul membranei sau sunt concentrate in teritorii specializate denumite zone tapetate cu clatrina (coated pits), un invelis d natura proteica pe fata citoplasmatica a membranei. Dupa legarea moleculei de toxina, complexele receptor-toxina se aglomereaza in zonele tapetate cu clatrina, situate la baza microvilozitatilor. Zonele respective se invagineaza si formeaza vezicule acoperite cu clatrina, cu rol de transport. In citoplasma, invelisul de clatrina se dezorganizeaza si receptorii celulari deveniti disponibili sunt reciclati spre suprafata celulei, iar molecula de toxina este eliberata spre un situs intracelular specific.

Rolul exotoxinelor in patogeneza bacteriana

Efectul biologic al exotoxinelor este specific si este datorat afinitatii lor caracteristice pentru anumite celule-tinta ale organismului.

Unele toxine (tetanica, difterica, botulinica, holerica, eritrogena) au un rol determinant in patogenitatea bacteriana. Primele patru enumerate mai sus, sunt factori unici ai patogenitatii pentru bacteriile producatoare. In cazul holerei, gravitatea infectiei este consecinta efectelor fiziopatologice nespecifice ale toxinei asupra mucoasei intestinale ce constau in pierderea apei si sarurilor minerale la acest nivel.

Eritemul specific scarlatinos, produs de Streptococcus pyogenes se datoreaza efectului primar al toxinei eritrogene streptococice.

Enterotoxinele stafilococice si enterotoxina produsa de Cl. perfringens produc efecte la nivelul mucoasei intestinale, ca rezultat al intoxicatiei alimentare.

Toxina produsa de Sh. dyzenteriae este cauza dizenteriei, deoarece enterocitele si celulele endoteliale ale vaselor mici se lizeaza sub actiunea toxinei , rezultatul fiind ulcerarea mucoasei intestinale.

Exotoxina de B. anthracis produce un edem local si hemoragie, iar in cazul septicemiei, efectul letal pare a fi datorat neurotropismului sau, cu actiune in special asupra centrului bulbar al respiratiei.

Uneori, toxine foarte asemanatoare, cauzeaza boli foarte diferite. De exemplu, toxina botulinica este ingerata oral si produce paralizia flasca a muschilor striati, prin blocarea transmiterii potentialului la nivelul placii motorii. Toxina tetanica, produsa in ranile profunde infectate cu Cl. tetani, produce paralizia spastica, prin SNC. Ambele toxine actioneaza prin acelasi mecanism: blocheaza eliberarea mediatorilor sinaptici, prin clivajul proteolitic al sinaptobrevinelor, care sunt proteine componente ale veziculelor sinaptice. Ambele toxine sunt metaloproteaze cu Zn

Efectele biologice ale toxinelor se produc la nivelul diferitelor structuri celulare. De exemplu, hemolizinele si leucocidinele actioneaza la nivelul membranei citoplasmatice, iar alte toxine sunt active asupra organitelor, asupra catenei transportoare de electroni s.a.m.d.

Endotoxinele

Termenul de "endotoxina" (introdus de Pffeifer, l892) este impropriu, deoarece lipopolizaharidele (LPS) sunt componente ale suprafetei bacteriilor Gram negative, dar este totusi folosit pentru ca, spre deosebire de exotoxine semnifica asocierea LPS cu celula.

Factorul toxic al bacteriilor Gram negative a fost extras de Boivin si Mesrobeanu (l933). Ei au identificat complexul glico-lipidic, cu antigenul somatic (O) al bacteriilor ce formeaza colonii netede (S-Smooth).

Endotoxinele LPS sunt componente structurale ale peretelui celular, la toate bacteriile Gram negative patogene si se elibereaza dupa dezintegrarea celulei. Sunt relativ termo-stabile si mai putin toxice decat exotoxinele, iar efectele lor sunt lipsite de specificitate. Din punct de vedere chimic, endotoxinele LPS sunt macromolecule complexe ce contin fosfolipide si polizaharide. Toxicitatea lor rezida in fractia fosfolipidica. Nu se denatureaza si nu rezulta anatoxine.

Endotoxinele LPS reprezinta 25% din moleculele de suprafata ale celulei si sunt esentiale pentru integritatea membranei externe.

Structura chimica a moleculei de LPS

Molecula de LPS este alcatuita dintr-un complex poliozidic si o parte lipidica. De aici deriva proprietatile amfipatice ale acestui agregat molecular, conferit de grupari polare hidrofile si grupari apolare hidrofobe.

La microscopul electronic, filamentele LPS au o structura trilaminara, corespunzatoare celor doua straturi poliozidice si stratului lipidic.

Cele mai studiate LPS sunt cele produse se tulpinile de Salmonella. Din punct de vedere chimic, molecula LPS, dupa extractia cu amestecul fenol-apa, cuprinde trei regiuni distincte:

regiunea polizaharidica externa, ce confera specificitate serologica moleculei de endotoxina;

regiunea centrala, reprezentata de oligozaharidul R;

regiunea interna hidrofoba - lipidul A, prin care molecula LPS se ancoreaza in membrana externa.

Componenta lipidica confera moleculei LPS, calitatea de toxina.

Oligozaharidul regiunii R si lipidul A sunt relativ invariabile si au constituienti similari la diferite specii de bacterii Gram negative.

Polizaharidul regiunii externe este un polimer de unitati oligozaharidice repetitive si confera specificitate serologica de grup, diferitelor variante antigenice de Salmonella. Unitatile oligozaharidice contin 2-4 componente monozaharidice: D-manoza, D-galactoza, L-ramnoza, o dezoxihexoza, o didezoxihexoza. Didezoxihezozele sunt zaharuri care nu exista in stare libera in natura, dar intra frecvent in structura polizaharidului enterobacteriilor si au primit denumiri care deriva de la speciile de origine: abequoza, tiveloza, paratoza, colitoza.

Variatia antigenica a polizaharidului regiunii externe se amplifica pe urmatoarele cai:

schimbari ale pozitiei legaturilor (de exemplu, 1-4 in loc de 1-6)

configuratii moleculare modificate

inlocuiri la nivelul diferitelor subunitati repetitive

deletia sau substitutia unui rest glucidic din subunitatile oligozaharidice.

Regiunea centrala a LPS ("miezul" R) are o variabilitate chimica mult mai restransa si confera specificitate de gen. Oligozaharidul este legat de lipidul A printr-un trizaharid, 2-ceto-3-dezoxioctonat (KDO).

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii centrale R. La Salmonella, lipidul A este alcatuit din dizaharide de D-glucozamina legate beta 1-6, interconectate la randul lor prin punti pirofosforice. Gruparile -OH si -NH₂ ale glucozaminei sunt substituite de acizi grasi: lauric, palmitic, miristic.

Tulpinile care formeaza colonii R sintetizeaza o endotoxina incompleta, careia ii lipseste polizaharidul regiunii externe, iar regiunea centrala are un continut scazut de glucide.

Efectele endotoxinelor LPS

Termenii de "LPS" si "endotoxina" sunt folositi cu sensuri echivalente, dar LPS semnifica moleculele purificate, iar denumirea de "endotoxina" desemneaza complexul format din LPS si proteinele asociate din membrana externa.

LPS sunt molecule amfifile, cu o parte hidrofoba, capabila sa se dizolve in lipidele membranare si o parte hidrofila, care poate ramane in faza apoasa. O prima treapta a actiunii LPS o constituie interactiunea dintre molecula amfifila si suprafata celulei sensibile. Molecula LPS poate fi inserata in membrana celulei prin jumatatea hidrofoba sau se ataseaza de receptorii membranari prin jumatatea hidrofila. O modalitate distincta a interactiunii LPS cu macrofagele, este aceea mediata de o proteina plasmatica de faza acuta denumita LBP (LPS binding protein).

Sursele majore de endotoxine sunt urmatoarele: 1)septicemia cu bacterii Gram negative; 2)bacterii originare in microbiota intestinala, datorita leziunilor mucoasei.

O particularitate a LPS, in contrast cu actiunea exotoxinelor, consta in aceea ca simptomele toxice nu se datoreaza actiunii lor directe asupra celulelor sensibile, ci sunt mediate, in mare parte, de citochinele sintetizate de novo de macrofage, ca raspuns la LPS.

LPS sunt molecule foarte imunogene. Anticorpii au specificitate fata de polizaharidul extern si precipita LPS, dar nu neutralizeaza efectele lor toxice. Raspunsul imun este de tip primar, cu sinteza prelungita de IgM, un titru minim de IgG si se activeaza chiar in absenta limfocitelor T, deoarece molecula de LPS este un antigen timo-independent, cu grupari antigenice repetitive.

Endotoxinele sintetizate de variantele coloniale "rugoase" sunt mai putin imunogene, datorita structurii lor mai simple.

Lipidul A are proprietati imunogene, iar anticorpii specifici reactioneaza incrucisat cu lipidul A al altor endotoxine, datorita uniformitatii structurii sale.

Antigenul polizaharidic, obtinut prin hidroliza acida isi pastreaza proprietatea de specificitate, dar nu este imunogen, avand proprietatea de haptena.

Efectele endotoxinei se manifesta atat in stare fizica legata de celula, cat si dupa ce a fost eliberata. Endotoxinele se elibereaza prin moartea si liza celulei sau printr-un proces de "inmugurire", care nu afecteaza viabilitatea acesteia. Din aceasta cauza, cele doua stari, endotoxemia si bacteriemia pot sa coexiste sau sa se manifeste in etape distincte ale procesului infectios. Proprietatile endotoxice ale celulelor bacteriene, vii sau omorate sunt aceleasi cu ale preparatului de endotoxina. In organismul infectat nu este o corelatie lineara intre nivelul bacteriemiei si endotoxemiei si respectiv, intensitatea efectelor endotoxice. Capacitatea organismului de a detoxifica este un factor modulator esential al manifestarilor endotoxice. Glucocorticoizii au efect protector anti-endotoxic, probabil prin modificarea permeabilitatii capilare.

Endotoxinele nu au rol in colonizarea si penetrarea suprafetei mucoase, deoarece lipidul A are o localizare profunda in membrana externa. Tulpinile invazive si neinvazive de Salmonella produc cantitati similare de endotoxina. Endotoxina are rol in initierea infectiei, probabil prin inducerea unei scaderi tranzitorii a capacitatii de aparare a gazdei, prin intarzierea declansarii unui raspuns inflamator.

Dozele mici de toxina maresc rezistenta organismului la infectiile bacteriene si virale prin stimularea activitatii fagocitare si respectiv, a producerii de interferon.

Endotoxinele initiaza calea alterna a activarii complementului, dar efectul nu este bacteriocitoliza, deoarece reactia se produce la distanta de membrana externa. LPS stimuleaza raspunsul imun mediat humoral, prin stimularea nespecifica, policlonala a limfocitelor B, iar in vitro au efect mitogenic asupra limfocitelor B. LPS au proprietati adjuvante, deoarece stimuleaza raspunsul imun specific fata de un antigen administrat simultan.

Dozele mari de endotoxine determina o serie de manifestari patologice sistemice, nespecifice:

hipertermie (febra), prin actiunea lor asupra centrilor termoreglarii, chiar dupa administrarea unor doze minimale. Inducerea febrei este semnul marcat al toxicitatii LPS. Febra este efectul indirect al actiunii LPS asupra macrofagului, care secreta cateva citochine: IL-1, TNF alfa, IFN beta, cu actiune directa asupra hipotalamusului. Starea febrila se instaleaza brusc, este monofazica, mediata de prostaglandine;

leucopenie urmata de leucocitoza. Efectul se exercita direct si rapid asupra leucocitelor. Ele parasesc patul vascular si se retrag aproape instantaneu in plaman si in alte tesuturi, in proportie de circa 60%. Dupa circa 4 ore, numarul leucocitelor circulante creste peste limitele normale. Creste numarul hematiilor circulante, datorita eliberarii in circulatie a rezervelor celulare din centrele de formare si depozitare a eritrocitelor;

modificari cardiovasculare: legarea endotoxinei de celulele hepatice sau de alte celule induce eliberarea rapida a aminelor biogene (histamina, serotonina) si a peptidelor (bradikinina) din depozitele celulare. Aminele produc o hipertensiune tranzitorie, urmata de hipotensiune severa, hipovolemie si formarea cheagurilor vasculare de fibrina. Endotoxinele activeaza sistemul de coagulare sanguina;

efecte metabolice: inhiba sistemele enzimatice ale gluconeogenezei si ale sintezei glicogenului.

Din punct de vedere clinic, dozele mari de endotoxina produc urmatoarea secventa de modificari: frison, febra, somnolenta, dispnee, modificari ale dinamicii tranzitului intestinal, diaree sanguinolenta, hiperglicemie incipienta urmata de hipoglicemie, paralizie, coma, moarte. Acest tablou de modificari se succede in circa 24 de ore dupa injectarea preparatului la animalele sanatoase si corespund starii de soc endotoxic, consecinta a endotoxemiei. Endotoxemia este rezultatul supraincarcarii celulelor cu rol de aparare, ca urmare a revarsarii endotoxinelor in circulatie. Starea de endotoxemie nu este totdeauna urmata de soc si moarte. Nu se cunosc cauzele marilor diferente de raspuns si reactivitate, la starea de endotoxemie. Socul fatal este consecinta interactiunii endotoxinei cu sistemul de coagulare a sangelui, pe care il activeaza si il amplifica. S-a emis ipoteza ca instalarea socului ireversibil este favorizata de absorbtia in sange a endotoxinelor produse de microbiota intestinala. In mod normal, mecanismele de detoxifiere a organismului sunt eficiente, dar starea de soc se instaleaza consecutiv diverselor tulburari functionale, care impiedica o reactivitate optima fata de infectia cu bacterii Gram negative.

Relatia dintre patogenitate si parazitism

Relatiile dintre bacteriile patogene si organismele gazda sunt foarte variabile. Multe bacterii infectioase pot sa se dezvolte in mediile naturale si sa intre in competitie cu microorganismele indigene. Alteori insa, bacteriile patogene sunt strict dependente de o gazda animala pentru perpetuarea lor in natura, dar pot supravietui perioade relativ lungi in mediile naturale.

Dependenta absoluta de gazda are mai multe cauze, cea mai probabila fiind determinata de existenta unor exigente nutritionale complexe.

Modul de viata parazitara implica pierderea functiilor ce asigura supravietuirea in mediile naturale. Evolutia dependentei de gazda tinde spre o adaptare cat mai eficienta a cresterii in vivo. Situatia exrema a acestei adaptari este toleranta reciproca ce evolueaza in directia unei simbioze.

Bacteriile patogene, cel mai bine adaptate sunt cel mai adesea capabile de crestere intracelulara, iar cele oportuniste sau facultativ parazite au o localizare extracelulara. Pe aceasta baza s-au descris trei categorii de bacterii parazite: parazite extracelulare, facultativ intracelulare si obligat intracelulare.

Bacteriile parazite extracelulare colonizeaza in mod normal, pielea si mucoasele, desi unele specii invadante se pot dezvolta in sange si in limfa. Supravietuirea lor in vivo este conditionata de rezistenta la fagocitoza. Ele colonizeaza zone inaccesibile fagocitozei sau sintetizeaza substante cu actiune antifagocitara: leucocidine si polizaharide capsulare.

Leucocidinele sunt factori de virulenta care omoara fagocitele profesioniste. Au fost descrise la S. aureus, Str. pyogenes, Ps. aeruginosa.

Capsula exercita actiune antifagocitara pe mai multe cai:

este o bariera fizico-chimica, impiedicand legarea factorilor opsonizanti pe suprafata celulei bacteriene;

blocheaza contactul celulei bacteriene cu receptorii fagocitelor;

are efect chimiotactic negativ.

Bacteriile patogene parazite facultativ intracelular se multiplica atat extracelular, dar pot patrunde si in celulele gazdei. Unele se multiplica in fagocitele "neprofesioniste" sau in alte tipuri de celule, dar nu si in macrofage (de exemplu, Shigella, N. gonnorhoeae). Altele sunt capabile sa se multiplice in fagocitele "profesioniste", dar si "neprofesionoiste". Ele rezista atacului enzimelor litice in vacuolele fagosomilor. Rezistenta bacteriana se datoreaza prezentei lipopolizaharidelor pe suprafata celulei.

Bacteriile parazite obligat intracelulare se dezvolta exclusiv in celulele vii, dar pot supravietui si in mediile extracelulare: micobacteriile, Chlamydia, Rickettsia, Coxiella.

Mecanisme de supravietuire a bacteriilor patogene in celula gazda

Majoritatea bacteriilor, inclusiv multe bacterii patogene, dupa ce sunt fagocitate de macrofage sau de polimorfonuclearele neutrofile (PMNN) sunt omorate. Unele bacterii patogene au elaborat strategii, care le permit sa supravietuiasca si sa se multiplice in interiorul fagocitelor. Sh. flexneri, L. monocytogenes si rickettsiile dizolva vacuola initiala, de origine membranara si astfel dobandesc acces la citoplasma bogata in substante nutritive. Salmonella, Mycobacterium si Legionella evita sau inhiba fuziunea fagosomului cu lizosomii.

Majoritatea bacteriilor patogene internalizate sau fagocitate in vacuole raman incluse in aceste structuri pe durata vietii intracelulare. Ele si-au elaborat strategii pentru anihilarea mecanismelor celulei gazda destinate sa omoare agentul invadant.

Factorii de virulenta care determina rezistenta la enzimele lizosomale si maresc capacitatea de supravietuire intracelulara sunt:

invelisul protector la suprafata celulei (capsula, LPS);

enzimele bacteriene care neutralizeaza radicalii toxici ai O₂ si enzimele proteolitice care degradeaza enzimele lizosomale ale gazdei.

Celulele de Salmonella sunt fagocitate intr-un fagosom spatios, atat in celulele fagocitare cat si nefagocitare si raman in interiorul vacuolei. Pentru initierea multiplicarii, ele necesita pH acid.

Micobacteriile patogene si Legionella pneunophila impiedica acidifierea fagosomului sau sunt inglobate de la inceput intr-o vezicula celulara cu pH neutru.

Chlamidiile sunt bacterii intracelulare, ce raman in vacuola neacida, in tot ciclul intracelular si evita fuziunea cu lizosomii. Ele se diferentiaza in doua forme: una care creste in celulele infectate si formeaza corpul reticulat si o alta infectioasa - corpul elementar extracelular. Vacuola ramane o structura distincta fata de caile de endocitoza si exocitoza ale celulei, dar se pare ca agentul infectios exporta proteine care sunt incorporate in membrana vacuolei.

Unii agenti patogeni intracelari parasesc vezicula de fagocitoza, trec in citoplasma si se multiplica. Cele mai studiate sunt L. monocytogenes si Shigella, dar si unele specii de Rickettsia folosesc aceiasi strategie. Aceste bacterii degradeaza membrana veziculara ce inconjura invadantul, trec in citoplasma, unde deplasarea este asigurata de componentele citoscheletului. In citoplasma, agentul patogen nu mai este expus actiunii enzimelor lizosomale, dar are acces direct la nutrienti.

Dupa ce este inglobata in celulele fagocitare si nefagocitare, L. monocytogenes scapa din vacuola fagocitara, prin intermediul listeriolizinei O, o hemolizina activata la pH scazut si a doua tipuri de fosfolipaza C. Toate vacuolele care contin celule de Listeria sunt acidificate, dar numai l4% dintre celule scapa, restul fiind omorate. Celulele libere in citoplasma determina condensarea actinei, ce deplaseaza bacteriile in citoplasma si probabil chiar in celulele vecine. Sh. flexneri utilizeaza un mecanism similar pentru iesirea din vacuola fagocitara.

Factorii de virulenta bacteriana sunt reglati permanent. Bacteriile virulente exprima genele adecvate pentru fiecare mediu celular. Expresia fenotipica a factorilor de virulenta este coordonata de diferite semnale din mediu: temperatura, concentratia ionica, osmolaritatea, nivelul Fe, pH, disponibilitatea sursei de carbon, nivelul O₂. Daca un singur parametru al mediului este nefavorabil, exprimarea factorilor de invazivitate este represata.

Exprimarea factorilor de virulenta, in afara gazdei, de obicei nu este necesara. Exista insa factori la fel de importanti pentru supravietuirea bacteriei in mediul extern sau in organismul gazdei. De indata ce bacteria patogena intalneste gazda sa si detecteaza anumiti parametri biochimici si fizici (temperatura, pH) se produc ample modificari ale activitatii genelor: este indusa sinteza unei cascade de factori de virulenta, unele gene sunt activate, iar altele trec in faza de stop. De exemplu, genele pentru expresia invazinelor sunt necesare timpuriu in infectie, dar sunt represate in interiorul celulei gazda.

Interactiunea agentilor patogeni cu sistemul imunitar

Sistemele de aparare locala a gazdei constituie prima linie de rezistenta si sunt in legatura stransa cu sistemul imunitar humoral. Microorganismele care supravietuiesc contactului primar cu gazda, activeaza functia imunitara. Sistemul imunitar al mamiferelor este specializat pentru a detecta componentele specifice celulei procariote: LPS si mucopeptide. Agentii patogeni si-au elaborat strategii prin care evita sau previn mecanismele de aparare a gazdei:

unii agenti patogeni altereaza componentele raspunsului imun al gazdei (celule sau citokine) si moduleaza acest raspuns;

altii eludeaza mecanismele de supraveghere ale sistemului imunitar. De exemplu, agentii patogeni care sunt localizati pe suprafetele mucoase si in straturile celulare superficiale (coci piogeni Gram pozitivi) leaga proteine ale gazdei pe suprafata lor si astfel isi mascheaza antigenele suprafetei sau altereaza proteinele suprafetei lor pentru a deruta si a ingreuna detectarea de catre efectorii sistemului imunitar. Multi agenti patogeni leaga proteine ale membranei bazale, ca fibronectina si colagenul. H. influenzae si N. meningitidis au receptori pentru proteinele care leaga Fe - transferina si lactoferina. Desi se crede ca aceste proteine constituie un mecanism prin care bacteriile dobandesc Fe, acestea au rol in mascarea suprafetei bacteriene. S. aureus leaga IgA, prin intermediul proteinelor A si G, ceea ce confera protectie fata de anticorpii specifici si fata de complement;

agentii patogeni pot sintetiza o molecula de suprafata ce mimeaza un component norm,al al gazdei. De exemplu, H. pylori exprima un component glucidic pe suprafata sa, Lewis X, care diminua raspunsul limfocitelor T fata de acest antigen, prezent si pe celulele mucoasei gastrice ale indivizilor infectati;

agentii patogeni produc factori care inhiba legarea anticorpilor si a complementului pe suprafata lor. Patogenii mucoaselor (H. influenzae, Str. pneumoniae, E. coli K₁, N. meningitidis) produc material capsular protector fata de liza cu proteinele complementului, fata de legarea anticorpilor si fata de fagocite. Catenele prea lungi de LPS activeaza cascada complementului la o distanta prea mare de suprafata celulei;

Ps. aeruginosa si Str. aureus produc proteaze ce degradeaza moleculele gazdei, iar N. meningitidis, H. influenzae, Str. sanguis secreta o proteaza ce degradeaza IgA;

Unii agenti patogeni produc enzime care degradeaza componentele complementului. De exemplu, Str. pneumoniae degradeaza si inactiveaza C₃, iar streptococii de grup A si B au o C₅ ce blocheaza proprietatile sale de chemoatractant;

altii altereaza celulele efectoare ale sistemului imunitar si diminua raspunsul imun. De exemplu, S. aureus produce superantigene toxice, asociate cu sindromul socului toxic si cu liza limfocitelor;

patogenii oportunisti "pandesc momentul" in care fortele de aparare a gazdei sunt diminuate.

Variatia antigenica

Unii agenti patogeni isi modifica periodic componentele structurale de suprafata: fimbrii, flageli, LPS, straturi S, proteine ale membranei externe, precum si cateva proteine secretate.

La bacteriile patogene cu localizare intracelulara, variatia antigenica este mai restransa.

Speciile de Neisseria isi modifica permanent structurile de suprafata prin mecanisme genetice. Cea mai variabila structura, din punct de vedere biochimic este fimbria. Numarul genelor care codifica proteinele fimbriale este de peste 5o, dar la un moment dat este exprimata una singura. Pe masura ce celulele bacteriene cresc in vivo (in uretra) sau in vitro, tipul antigenic al fimbrilinei se modifica prin mecanisme genetice. Printr-un proces de recombinare - via Rec A, gena exprimata este inlocuita cu o copie a altei gene si se sintetizeaza o molecula de fimbrilina cu o noua specificitate antigenica.

Variatia antigenica are loc la o specie de Borrelia (B. hermsii) ce produce febra recurenta. Aceste organisme poarta plasmide lineare care contin copii multiple ale genelor ce codifica proteinele variabile majore.

Microorganismele oportuniste

Sub aceasta denumire sunt reunite bacterii, microfungi, protozoare care produc infectii la gazde compromise sub raportul capacitatii de aparare.

Conceptul de "microorganism oportunist" este ambiguu, deoarece definitia nu exclude producerea infectiei la o gazda, ale carei capacitati de aparare sunt depasite de doza infectanta sau de virulenta crescuta a microorganismelor.

Pentru microorganismele oportuniste, starea de functionalitate a mecanismelor de aparare este determinanta in ceea ce priveste rezultatul interactiunii sale cu gazda. Aceste organisme nu au mijloacele eficiente pentru a depasi mecanismele de aparare. Oportunistii pot fi foarte adaptati sa produca infectii, dar datorita situsului preferat de crestere (de exemplu, suprafata mucoasei) si a unor conditii preferabile de crestere (de exemplu, conditii de microaerofilie), rareori au sansa sa produca procesul patologic.

Dupa von Graevenitz ( l977) microorganismele oportuniste pot produce trei tipuri de infectii:

unele produc infectii exclusiv la gazdele compromise imunologic (Mycobacterium avium, Corynebacterium equi);

altele produc infectii cu o frecventa mai mare la gazdele imuno-compromise (Staphylococcus, Salmonella):

cele care produc infectii mai severe la gazdele imuno-compromise (Mycoplasma pneumoniae, Salmonella).

Microorganismele care produc infectia clinica numai la gazde neimunizate (de exemplu, Corynebacterium diphteriae) nu sunt oportuniste.

Microorganismele oportuniste formeaza o categorie distincta de a celor saprobionte. Cele saprobionte traiesc pe materia organica in descompunere si nu intra in competitie cu microbiota normala a organismului. Cele oportuniste pot fi saprobionte, nu fac parte din microbiota normala, dar intra in competitie cu microbiota normala a organismului. Unii membrii ai acesteia pot sa produca infectii oportuniste.

Pentru ca un agent sa fie incadrat in categoria microorganismelor oprtuniste, von Graenevitz ia in consideratie urmatoarele conditii:

microorganismul sa fie izolat de mai multe ori din leziuni clinice, de la gazde cu deficit la functiei imuntare;

sa fie mai frecvent prezent si izolat de la gazde compromise imunologic, decat de la restul populatiei;

prezenta sa intr-un proces patologic sa nu se datoreze unor cauze indirecte.

Ps. aeruginosa supravietuieste in diferite solutii, in care substantele nutritive se gasesc in cantitati infime si chiar in solutiile dezinfectante. Organismul uman, in mod obisnuit, impiedica colonizarea pseudomonadelor, dar la persoanele imunocompromise si in ranile provocate de arsuri sau de traumatisme, ca si in plamanii pacientilor cu fibroza chistica, Ps. aeruginosa este prezent totdeauna.