Studii de expresie genica pe diferite tesuturi de Carassius Auratus Auratus - Biochimie si Biologie Moleculara

Master Biochimie si Biologie Moleculara

ANUL I

Studii de expresie genica pe diferite tesuturi de Carassius Auratus Auratus

Scopul acestui experiment a fost urmarirea efectului tratamentului cu Mn (II) asupra expresiei genelor (heat shock protein) hsp70 si hsp30 la Carassius auratus auratus , realizata prin Real Time PCR, pe diferite tipuri de tesuturi prelevate dupa realizarea tratamentului cu 75 µg Mn²⁺/l, intervale diferite de timp. Astfel, a fost determinat nivelul relativ de expresie al genelor respective fata de nivelul de expresie al genei pentru ARNr 18s (gena de referinta), in tesuturile prelevate din pestii intoxicati fata de tesuturile obtinute de la pestii din lotul martor.

Loturile de Carassius auratus auratus luate in studiu au fost formate din 10 pesti / lot, intervalele de tratament cu 75 µg Mn²⁺/l au fost de 7, 14, 21 si 28 de zile. Pe parcursul experimentului pestii nu au fost hraniti. Dupa terminarea tratamentului pestii au fost sacrificati si a fost recoltat tesut hepatic, renal, creier, muschi alb, muschi rosu si sange (recoltat pe solutie anticoagulanta), tesuturile fiind conservate rapid la - 80 °C pana in momentul realizarii extractiei ARN.

Din tesuturile prelevate de la pestii intoxicati si martor s-a extras ARN total. Acesta a fost revers-transcris in ADNc cu care s-au realizat reactii PCR in vederea cuantificarii expresiei genice.

Mod de lucru

1. Extractia ARN total

Se ia cate 0.1 g de tesut (muschi alb, muschi rosu si branhii) decongelat care se lizeaza intr-un 1ml de reactiv de liza Trizol (TRI) folosindu-se Potterul. Dupa acest process tesutul lezat va fi transferat intr-un tub Eppendorf si apoi lasat pe ghiata(5 minute) pentru o disociere mai buna a nucleotidelor. Dupa, se adauga 200 μl de cloroform agitand proba pentru 15 secunde urmata de incubare timp de 15 minute pe ghiata si urmata de centrifugare la 14000rpm/20'. Dupa adaugarea cloroformului in urma centrifugari s-a obtinut 3 faze: faza apoasa care contine ARN; interfaza-AND si faza organica reprezentata de catre proteine.

Se transfera faza apoasa-ARN intr-un Eppendorf adugandu-se 600μl de izopropanol, tubul se agita usor si se lasa timp de 5 minute pe ghiata, apoi centrifugat la 14000rpm/15'. Precipitatul obtinut se spala cu un 1ml de etanol 75% si este recentrifugat la 14000rpm/15'. Dupa uscare peletul de ARN va fi resuspendat in apa tratata cu dietilpirocarbonat (DEPC) pentrua inhiba ribonucleazele astfel: probele de muschi alb si rosu in 50 μl de DEPC si proba de branhii in 100 μl de DEPC.

2. Puritatea si concentratia ARN total

Stabilirea concentratie si a puritatii ARN s-a efectuat pentru fiecare proba prin citirea la spectofotometru a absorbantei la 260nm si 280nm. Efectuandu-se raportul dintre DO260nm/DO280nm care trebuie sa fie mai mare sau egal cu 1.7; daca este mai mic se realizeaza o purificare suplimentara a ARN.

3. Reactia de revers-transcriere

In reactia de revers transcriere se utilizeaza ARN total extras din muschi alb, muschi rosu si branhii atat de la pestii intoxicati cat si de la cei sanatosi utilizandu-se o iScript revers transcriptaza . iScript revers transcriptaza este o AND polimeraza ARN dependenta ce sintetizeaza o catena de AND avand ca matrita o catena de ARN.

Pentru ca reactia sa aiva loc in amestecul de reactie trebuie adaugati si primerii care pot fi reprezentati de catre secvente aleatoare a cate 6 nucleotide care se vor lega intamplator pe catena de ARN matrita.

Protocolul de lucru al reactiei de revers-transcriere:

v    Volumul final al reactiei trebuie sa fie de 25μl

v    Pentru fiecare proba de ARN se realizeaza diluti pana la o concentratie de 1μg intr-un volum final de 4μl in H2O RNaze free

v    Se realizeaza un amestec de reactie care va contine pentru fiecare proba urmatorii reactivi: amestec de revers-transcriere 5x-4μl; iScript revers-transcriptaza 1μl si se complecteaza cu apa pana la un volum final de 20μl

Dupa realizarea protocolului reactiei de revers-transcriere probele au fost incubate intr-un termocycler iCycler IQ timp de 5 minute la 25sC, 45 de minute la 42sC si 10 minute la 95sC, probele fiind apoi patrate la 4sC pana la efectuarea reactiei PCR.

Cuantificarea expresiei genice prin Real-Time PT-PCR

Rezultatul obtinut prin revers-transcriere ADNc este amplificat prin reactia PCR utilizandu-se o iTaq AND polimeraza care catalizeaza reactia de polimerizare a nucleotidelor in ADN dublu catenar, in directia 5'-3'in prezenta ionilor de magneziu.

PCR este o reactie in lant, produsul unui ciclu de ampilificare servind ca matrita pentru urmatoarul ciclu, astfel cantitatea de produs de reactie creste exponential si se dubleaza la fiecare ciclu de amplificare.

N = N₀ x 2ⁿ

N = numarul de molecule amplificate dupa n cicluri

N₀ = numarul initial de molecule

Reactia PT-PCR poate fi urmarita in timp real prin utilizarea unui amestec de compusi fluorocromi. Aici s-a folosit in amestecul reactiei de amplificare un compus fluorocrom numit SYBR Green I, care este un agent intercalant si se leaga la fosa minora aADN dublu catenar. Reactiile au fost efectuate cu ajutorul unui termocycler iCycler iQ folosind filtre specifice excitatie/emisie pentru SYBR Green I.

Deoarece, in primele cicluri de amplificare cantitatea amplimerului este mai mica si emisia fluorescentei SYBR Green I este mai scazuta. O data cu cresterea ciclurilor si cantitatea de amplimer este mai mare.

Ct reprezinta momentul in care reactia PCR intra in faza exponentiala, atunci cand intensitatea fluorescentei depaseste o valoare de baza.

In reactia de revers-transcriere s-a folosit aceeasi cantitate de ARN total pentru toate probele, insa eficenta acestui proces variaza rezultand o variatie a Ct.

Nivelul relativ al expresiei genelor hsp 27 si hsp 70 este calculate in functie de nivelul de expresie al genei pentru ARNr 18s din tesutul intoxicat fata de cel din martor, ecuatia fiind:

Este necesara testarea specificitatii reactiei PCR deoarece SYBR prezinta afinitate pentru toate speciile de AND dublu catenar. Aceasta testare consta in realizarea curbei de topire efectuata automat la finalul reactiei PCR prin cresterea temperaturi din 0.5 in 0.5 sC de la 50 sC la 95 sC citindu-se intensitatea semnalului fluorescent. O data cu crestrea temperaturii are loc denaturarea ADN si scaderea brusca a semnalului fluorescent ajungandu-se la temperatura de melting a amplimerului, care reprezinta derivata inversa -dF/-dT in functie de temperature. Din probele rezultate din revers-transcriere s-au realizat dilutii pana la o concentratie AND dorita , in volum final de 5μl.

S-a realizeaza un amestec de reactie PCR care contine: iQ SYBR Green 1x; primeri 400nM si apa MilliQ pentru complectarea pana la volumul final. Din volumul de 20μl s-a distribuit in probe 5μl de ADNc.

In final amestecul a fost incubat in termocycler avand urmatorul program de amplificare:

v    Denaturare initiala la 95sC/4'

v    45 de cicluri de amplificare denaturare timp de 30" la 95sC

v    hibridizare 30" la 54sC

v    elongre si observarea semnalului fluorescent 30" la 72sC

v    program de determinare a curbei de topire: 85 de cicluri a cate 10" cu variatii crectoare din 0.5 in 0.5sC a temperaturii de la 55sC.

Rezultate si concluzii

Verificarea puritatii si concentratiei ARN total

In tabel sunt prezentate rapoartele si concentratiile ARN total obtinute pentru fiecare proba dupa citirea absorbantei.

Proba muschi alb martor fost diluata 5x. Raportul 260/280 al probei de muschi alb martor se incadreaza in valorile normale ale raportului 260/280 ale ARN

Reactia de revers-transcriere

In tabelul de mai sus sunt prezentate dilutiile efectuate pentrru fiecare proba de ARN total care urmeaza fi amplificata. Reactia de revers-transcriere a fost facuta in 2 tuburi: in primul s-a efectuat o dilutie 10x a ARN total, iar in al doilea o dilutie 10x din primul tub de reactie. In fiecare proba s-a adaugat cate 4µl mixt RT si 1µl RNaza. Volumul final fiind de 20µl.

Cuantificarea expresiei genice prin intermediul RT-PCR

In finalul reactiei de revers-transcriere a DNA complementar s-au adaugat primerii pentru hsp27 si hsp70 pentru ambii folosindu-se cat un primer forword si unul revers; folosindu-se doua mixturi de reactie una de amplidicare a hsp27 si alta pentru amplificarea hsp70; iar gena de referinta fiind ARNr 18s.

Pentru fiecare proba au fost efecturate cate 4 citiri.

Mai jos este prezentat tabelul cu valorile obtinute in urma reactiei PCR :

In primul tabel sunt aratate rezultatele pentru hsp 27:

In al doilea tabel sunt valorile obtinute pentru hsp 70:

Valorile 2^-ddCt sunt reprezentate graphic fata de un martor considerat 1 pentru a evidentia cresterea sau scaderea nivelului de expresie al genei.

S-a realizat cate un grafic pentru fiecare proba hsp 27 cat si pentru hsp70.

Grafic 1. Reprezinta variatia expresiei genice relative in probe a exprimari genei hsp 27.

Graficul 2. Reprezinta variatia expresiei genice relative in probe a exprimari genei hsp 70.

Concluzii: Dupa cum se observa din cele doua grafice probele de muschi rosu respectiv probele de branhii prezinta o expresie a genelor hsp 27 si hsp 70 mai mare decat probele de muschi alb.

In timpul tratamentului branhiile si muschii rosii au fost mai expusi la intoxicatia cu Mn(II) decat muschii albi deoarece atat branhiile cat si muschii rosii au nevoie mai mare de oxigen fiind mai puternic atacati de substanta . In muschii albi Mn( II) a ajuns mai greu , de aceea expresia genica este mai mica, aproape de valoarea normala.

In concluzie, organismul a raspuns cum era de asteptat la intoxicatia cu Mn (II) prin cresterea expresiei genelor hsp 27 si hsp 70m la nivelul tesuturilor de interes.