Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza a enzimelor

Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza a enzimelor

Elaborarea și industrializarea tehnologiilor de biosinteza a enzimelor se realizeaza parcurgand o serie de faze necesare constand in:

cercetari la nivel de laborator,

stație pilot,

stație industriala experimentala,

unitate experimentala de producție.

Faza de laborator. Procesul de baza din tehnologia de biosinteza a enzimelor este proces microbiologic, cercetarile incep prin izolarea din diferitele habitate de diferite microorganisme cunoscute sau presupuse a elabora enzimele dorite. Tehnicile de izolare și purificare a culturilor de microorganisme cele mai frecvent utilizate sunt tehnica diluțiilor și tehnica granulelor de sol.

Deseori sunt create condiții selective de cultura a microorganismelor pe medii solide sau lichide conținand anumite principii cu ajutorul carora se pot evidenția unele caracteristici fiziologice.

Dupa etapa de izolare și realizare a culturilor pure prin tehnici directe de micromanipulare sau indirecte, se trece la trierea tulpinilor luate in lucru dupa criterii calitative și cantitative conform scopului urmarit.

Drept teste calitative pentru izolarea tulpinilor celor mai productive pentru α - amilaza se utilizeaza metoda amiloplastica.

Pentru izolarea produșilor de proteaze se utilizeaza metoda Frazier.

Principiul acestor teste calitative consta in cultivarea microorganismelor in placi Petri pe medii solidificate cu agar-agar conținand substraturile naturale ale enzimelor dorite. Dupa dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzeaza in gelul de agar-agar atacand substratul inclus in mediu.

Interpretarea rezultatelor se face dupa adaugarea unui reactiv specific substratului (amidon, lugol-cazeina, reactiv TCA sau Frazier), prin apariția unei zone de hidroliza in jurul coloniei.

Cu cat aceasta zona este mai intinsa, cu atat microorganismul respectiv este mai bun producator.

Faza de stație pilot. În aceasta faza tehnologia elaborata la nivel de laborator este verificata și optimizata in instalații de biosinteza avand capacitați mai mari. Biosinteza enzimelor se desfașoara in reactoare biologice in culturi de suprafața sau submerse in funcție de fiziologia producatorului urmarind economicitatea procesului.

În aceasta faza se aleg modalitațile cele mai potrivite pentru prelucrarea mediului de cultura și prepararea/obținerea preparatelor enzimatice.

Cercetarile sunt continuate in instalații industriale experimentale pentru a se putea studia comportarea microorganismelor precum și stabilirea bilanțurilor de materiale și energetice.

În aceasta faza se stabilesc și prețurile de cost orientativ ale produsului.

Pe baza rezultatelor obținute, stațiile pilot și instalațiile industriale experimentale se elaboreaza tehnologia industriala de producție și proiectul pentru construcția unitații industriale.

Utilaje și biotehnologii pentru obținerea produselor de biosinteza utilizate in industria alimentara

Bioreactoarele à reprezinta reactoare chimice elaborate pentru realizarea operațiilor specifice necesare in vederea dezvoltarii culturilor de microorganisme și a sintetizarii de catre acestea a enzimelor.

În consecința trebuie sa fie dotate cu aparatura de reglare, masura și control care este destinata pentru:

stabilirea compoziției a concentrației mediului de cultura;

cunoașterea temperaturii, presiunii, pH-ului;

cunoașterea oxigenului dizolvat, a parametrilor reologici ai mediului, precum și a utilitaților consumate.

O caracteristica esențiala a funcționarii bioreactoarelor consta in necesitatea asigurarii unei asepsii riguroase pe tot parcursul funcționarii, precum și de aer steril.

Clasificarea bioreactoarelor. Bioreactoarele se pot clasifica in funcție de modul de lucru, principiul de realizare a biosintezei, starea fizica a mediului de cultura și prin modul de asigurare a aerarii.

Dupa modul de funcționare se disting:

bioreactoare continue;

bioreactoare discontinue.

Primele pot fi de tip deschis sau inchis, echipate pentru strat omogen sau eterogen.

Bioreactoarele continue prezinta avantajele reducerii volumului, concentrației și a duratei procesului, a utilizarii eficiente a mediului de cultura cu creșterea randamentului de sinteza și a posibilitații automatizarii ușoare a procesului.

De asemenea se evita timpii morți pentru umplere, golire, curațire, sterilizare și racire.

În multe cazuri insa aplicarea este greoaie sau imposibila din cauza condițiilor diferite de regim solicitate de catre microorganisme in decursul diverselor faze ale procesului de inmulțire, a adaptarii greoaie a culturilor, cat și degenerarii acestora.

Bioreactoarele cu funcționare discontinua difera sub aspectul modului constructiv și al dotarii cu armaturi și echipamente, cat și a starii fizice a mediului de cultura.

Exista bioreactoare:

verticale și orizontale;

staționare sau rotative;

echipate cu dispozitive pentru sterilizarea mediului de cultura in exterior sau in corpul agregatului.

Sterilizarea mediului de cultura in exterior implica dotarea suplimentara cu coloane de barbotare sau injectoare de abur, menținatoare la cald și racitoare rapide, procesul putand fi realizat și cu schimbatoare de caldura cu placi. Acestea prezinta avantajul degrevarii bioreactorului de operațiuni secundare de pregatire a mediului, marirea productivitații, reducerea oscilațiilor mari de consum de abur și evitarea degradarii mediului.

Pentru combaterea eficienta a spumarii se construiesc bioreactoare cu spargatoare mecanice, cuplate sau nu de agitator cu distrugerea spumei in afara recipientului cu injecție de antispumanți, marirea presiunii și alte mijloace.

La starea fizica a mediului bioreactoarele sunt echipate deosebit pentru folosirea de medii lichide, semisolide sau solide.

În cazul culturilor de suprafața microorganismele se dezvolta de preferința in medii lichide, pe tavi aerate, grosimea stratului de microorganisme este de pana la 2 cm, iar a celui de mediu de pana la 20 cm.

Tavile pot fi dispuse pe rastele sau carucioare ce se deplaseaza in tunele ventilate cu aer steril.

În astfel de condiții se obține acid citric cu culturi de Aspergilus Niger sau cheag microbian, iar in cazul culturilor solide microorganismele se dezvolta atat pe suprafața, cat și in interiorul mediului de cultura. Acesta este de obicei granulat, conținand tarața de grau sau orez.

Culturile semisolide se realizeaza in agregate cu tambur și se folosesc medii care nu prezinta tendințe de aglomerare.

Sisteme de biosinteza a enzimelor

Biotransformarile cuprinzand procese de biosinteza sau biodegradare pot avea loc in condiții oxibiotice, anoxibiotice sau fermentative. În mod impropriu termenul generic de fermentație este folosit in practica și pentru unele procese bazate pe cultivarea microorganismelor in condiții de aerobioza riguroasa.

Se considera ca termenul de fermentație trebuie limitat la acele reacții producatoare de energie in care substanțele organice acționeaza atat ca donor, cat și ca acceptor de electroni. Prin aceasta delimitare fermentațiile sunt absorbite pe de o parte de respirația anaeroba a microorganismelor, iar pe de alta parte de respirația aeroba in care ultimul acceptor de electroni este reprezentat de oxigenul molecular.

Din aceste motive este mai corect ca și aparatele in care se realizeaza dezvoltarea microorganismelor sa fie denumite reactoare biologice sau bioreactoare. Procesele biotehnologice se pot clasifica dupa:

felul culturii (suprafața sau submers);

tipul de operare și reactor;

modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului de cultura.

În ceea ce privește conducerea procesului de obținere a enzimelor se deosebesc:

1. Procedeul de biosinteza in culturi de suprafața, semisolide și solide.
2. Procedeul de culturi submerse.

În cazul culturilor de suprafața microorganismele se dezvolta pe suprafața unui suport lichid sau solid, iar in cazul culturilor solide microorganismul se dezvolta atat pe suprafața, cat și in interiorul mediului de cultura.

Culturile semisolide à se realizeaza in tamburi rotativi pe medii semisolide care nu se aglomereaza. Tamburul de forma cilindrica așezat orizontal se rotește in jurul axului, iar in interior este prevazut cu palete care antreneaza mediul in timpul invartirii asigurand o buna aerisire. Aerul sterilizat necesar aerarii mediului se introduce prin ax.

Aparatul poate fi sterilizat cu aburi și lucreaza sub presiune de aer.

Procedeele de suprafața necesita instalații numeroase, sunt costisitoare, greu manipulabile și greu sterilizabile.

Procedeele submerse necesita instalații care permit amestecarea perfecta a componentelor solide, lichide și gazoase, alimentare adevarata cu aer, fiind echipate cu aparatura de masura și control.

Acest procedeu ofera o serie de avantaje fața de cultura in suprafața printre care:

randamentul ridicat in produs,

se preteaza automatizarii,

economie de spațiu și forța de munca.

Industrial cultura submersa a microorganismelor se poate organiza prin procese discontinue sau continue, acestea din urma conducand la utilizarea de aparate mai mici in care se pot obține parametrii optimi de biosinteza cu investiții mai mici și economie de timp.

Bioreactoare pentru procedeul culturilor de suprafața à pentru astfel de culturi se preteaza in special urmatoarele tipuri de bioreactoare:

Boidin Effront conceput pentru sinteza α-amilazei, deși de inalțime mica, acesta este echipat cu sisteme eficiente de aerare, termostatare și sterilizare;

Drews destinat pentru producerea de amilaza fungica, cheag microbian și celulaza, este echipat cu dispozitive suplimentare de climatizare și transport și permite realizarea unor grosimi mai mari pentru mediul de cultura;

Microgerm de tip universal și capacitate mica a fost elaborat de Institutul de Chimie Alimentara București și poate fi utilizat pentru biosinteza tuturor preparatelor enzimatice destinate produselor alimentare.

Procedeul Boidin și Effront à reprezinta o veche realizare. Înca din 1916, ei au realizat biosinteza α-amilazei in culturi de suprafața pe medii lichide intr-o instalație construita in Franța.

Mediul natural dupa sterilizare și inoculare cu o cultura pura de Bacillus Subtilis era introdus in tavile instalației formata dintr-un tanc cilindric de oțel așezat vertical. Instalația este prevazuta cu sisteme de aerare, termostatare, sterilizare, procedeul cu camere de biosinteza este utilizat și la fabricarea acidului citric pe mediul din melasa.

Procedeul Drews à utilizeaza medii de cultura solide ca tarațe de grau sau de orez umectate in raport de 1:1 cu apa potabila. Mediul se sterilizeaza cu vapori direcți, iar dupa racire se inoculeaza cu o suspensie de spori și este repartizat in tavi de inox cu fund de sita in straturi groase de 2-3 cm.

Tavile conținand materialul insamanțat se introduc in camere climatizate, camerele de incubare termostatandu-se la temperatura dorita introducandu-se in același timp aer umidificat pentru menținerea higroscopicitații necesare.

În timpul dezvoltarii microorganismului ca urmare a proceselor intens exoterme mediul de cultura are tendința de a se supraincalzi, ceea ce ar crea pericolul inactivarii enzimelor.

Excesul de caldura este indepartat prin insuflare de aer sterilizat in camerele climatizate.

Dupa dezvoltarea microorganismului și biosinteza enzimei, mediul de cultura este utilizat ca atare sau este supus extracției și prelucrarii ulterioare pentru obținerea unor preparate enzimatice purificate.

Acest procedeu este intrebuințat pentru fabricarea amilazei fungice, cheagului microbian, celulazelor.

Bioreactorul Frigs à consta dintr-un turn umplut cu așchii de lemn sau piatra ponce, pe acest material microorganismele formeaza o bioderma, iar sub sustratul supus biotransformarii este agitat de sus in jos.

Bioreactoare pentru procedeul culturilor submerse

Din punct de vedere constructiv cele doua tipuri de bioreactoare difera sub aspectul modului de realizare a etanșeitații, cat și cel de aerare a mediului.

Pentru produsele alimentare se folosesc bioreactoare echipate cu dispozitive destinate procedeelor aerobe astfel incat in cele ce urmeaza se vor prezenta numai aceste tipuri de agregate:

bioreactoarele cu agitare à folosesc energia fazei gazoase pentru agitarea mediului; in ceea ce privește modul de introducere a gazului de amestecare a mediului de cultura se disting:

bioreactoare prin barbotare;

prin injecție: daca injecția are loc cu aer ele poarta denumirea de airlift, altfel numindu-se gazlift.

Amestecarea are loc in flux continuu sau pulsatoriu. Pentru distibuția fina a aerului și a gazului, bioreactoarele pot fi prevazute cu talere, umpluturi sub forma de bile sau inele.

bioreactoare ce utilizeaza energia fazei lichide pentru amestecare și dispersia gazului in speța a aerului à acestea sunt prevazute cu agitatoare autoaspirante sau cu pompe de recirculare, uneori recircularea și distribuirea fina a aerului se efectueaza prin intermediul unor efectoare care sunt dispozitive care asigura și omogenizarea buna in condițiile inglobarii unei cantitați mari de oxigen in masa mediului de cultura.

În ultimul caz bioreactoarele pot funcționa cu jet scufundat sau inecat. Exista și distribuitoare de aer de tip rotativ in forma de elice de avion cu deschideri pe una din laturi prin care se sufla aer.

Ele sunt prevazute cu mai multe palete dispuse radial. Sistemele de autoaspirație și de turbionare pe principiul elicei de avion pot realiza transferuri de oxigen de pana la 12g/l mediu și ora la un consum de energie de 0.45 kWh/kg oxigen transferat.

Randamentul de solubilitate a oxigenului admis cu aerul este de pana la 50%.

bioreactoare cu dispozitive mecanice de amestecare de tipul agitatoarelor à sunt prevazute cu palete sau turbina. Alegerea depinde in mare masura de insușirile reologice ale mediului de cultura. Ele urmaresc transportul eficient al oxigenului și al substanțelor nutritive din mediu la microorganismele cu consum minim de energie in condițiile realizarii unei dispersii fine și a omogenizarii avansate.

Spre deosebire de bioreactoarele precedente care pot realiza performanțe energetice mai bune acestea permit menajarea microorganismelor protejandu-le de solicitarile mecanice ce apar la ejecție și la dispersia sub vid.

Indiferent de tipul constructiv sub agitator se gasește o zona libera in care se introduce distribuitorul de aer. Acesta poate fi alcatuit din simple tuburi inelare perforate sau talere cu clopot.

Puterea absorbita variaza intre 0.1-1.4kW/m de mediu. Ea este puternic influențata de turația agitatorului și mai puțin de natura microorganismului, cat și de dimensiunile constructive ale bioreactorului.

La proiectarea de generații noi de bioreactoare se ține cont de destinația acestora, cat și de capacitatea de producție avuta in vedere. Astfel se observa apariția de bioreactoare universale construite cu piese standardizate modulate la prețuri reduse alaturi de agregate unicate specializate pentru anumite tehnologii realizate cu preturi mult mai mari.

Sub aspectul capacitații, tendința se indreapta spre bioreactoare de mare volum la care consumurile specifice de utilitați sunt mult mai mici decat la cele cu productivitate redusa.

În cadrul ICA București s-au elaborat bioreactoarele din seria biofor, caracterizate prin posibilitatea schimbarii capacitații recipientului, a tipului de agitator și a variației turației acestuia, in felul acesta, cu aceeași instalație se poate proceda la obținerea preparatelor enzimatice in trepte prin culturi submerse și cu posibilitatea realizarii de inocule pentru toate tipurile de bioreactoare de mare capacitate.

Dupa tipul respirator al microorganismelor utilizate in procesele biotehnologice, reactoarele biologice se impart in:

bioreactoare pentru procedeul submers anaerob;

bioreactoare pentru procedeul submers aerob.

Bioreactoare pentru procedeul submers anaerob - se utilizeaza in general tancuri simple gazate cu N sau CO, pentru a impiedica patrunderea oxigenului in mediu ele sunt prevazute cu sisteme de amestecare și termostatare.

Fermentatoarele sunt recipienți rezistenți la presiune cu posibilitați de inchidere etanșa. Ele sunt prevazute cu dispozitive de reglare a presiunii CO care ia naștere in proces.

Bioreactoare pentru procedeul submers aerob - sunt asemanatoare cu cele pentru procesele anaerobe, dar sunt prevazute intotdeauna cu dispozitive de aerare. Se construiesc incepand de la volume de 0.5l pana la 200 m.

Sunt sterilizabile, iar in procesul de biosinteza se lucreaza cu o ușoara suprapresiune pentru menținerea condițiilor de asepsie.

Amestecul componentelor de reacție solide, lichide, gazoase se realizeaza prin agitare utilizand diferite sisteme de construcție.

a) Bioreactoare cu vibromixer - sunt utilizate pentru cultura submersa a microorganismelor ale caror celule sunt foarte sensibile la amestecarea cu turbina.

b) Bioreactor pentru culturi in strat subțire unde microorganismele sunt cultivate pe valțuri in straturi subțiri formand o bioderma. Valțul este imersat in soluția nutritiva in care se rotește asigurand o buna aerare.

c) Bioreactorul coloana cu bule - este format dintr-o coloana prevazuta la partea inferioara cu o sita prin care se injecteaza aer.

Se pot utiliza și unele materiale de umplutura. Aceste bioreactoare sunt adecvate in special pentru procesele biotehnologice in care substratul are o densitate mare sau este vascos.

d) Bioreactorul airlift - este format dintr-un cilindru exterior prevazut la interior cu un alt cilindru cu pereți subțiri avand rolul de corp de conducere a curentului.

Aerul este introdus pe la partea inferioara strabatand spațiul interior al corpului de conducere.

e) Bioreactorul standard - este utilizat indeosebi bioreactorul universal care este echipat cu agitatoare turbina cu palete plane. La aceste aparate puterea necesara agitarii depinde foarte mult de tipul microorganismului.

f) Bioreactorul cu jet inecat - consta in principal dintr-un recipient cilindric și un sistem de pompare. Pompa este de construcție speciala, asigurand transportul și amestecarea fazelor de lucru in 3 zone ale mediului.

Sistemul este lipsit de orice formare de spuma facand inutil adaosul de substanțe antispumante. Acest bioreactor se caracterizeaza printr-un transfer de masa eficient, productivitate ridicata și cheltuieli de investiție și exploatare reduse.

Execuția este simpla deoarece nu sunt necesare echipamente ca compresoare, dispersatoare de spuma, sisteme de racire.

Dupa tipul de operare se deosebesc sisteme omogene și heterogene.

Primele au compoziție uniforma, celelalte au gradiente de celule sau substrate. Sistemele heterogene pot fi monofazice sau multifazice.

În sistemul heterogen microorganismele din diferite zone ale sistemului sunt expuse la diferite condiții de mediu, vor avea diferite cicluri de viața și vor fi in diferite stari fiziologice.

Chiar la o operare continua in stare staționara microorganismele care trec printr-un sistem heterogen se comporta ceva asemanator ciclului de dezvoltare din cultura discontinua.

De asemenea trebuie facuta deosebirea dintre sistemele inchise și deschise. Sistemele inchise sunt acelea in care celulele microbiene sunt reținute in totalitate in sistem fie printr-o membrana semipermeabila prin aderența sau prin recirculare continua.

Sistemele deschise sunt acelea in care celulele trec continuu in efuent.

În toate sistemele inchise componentele nutritive intra in sistem sau il parasesc fara ca celulele sa-l paraseasca. Astfel numarul de celule din sistem va continua sa sporeasca pana cand un factor (altul decat lipsa de componente nutritive), ex: lipsa de oxigen determina oprirea dezvoltarii.

Majoritatea celulelor fiind sortite morții. Sistemele inchise nu pot atinge o stare staționara. În sistemele deschise celulele parasesc continuu sistemul cu aceeași rata cu care se formeaza celulele noi putandu-se atinge starea staționara.

Pe baza tipurilor de operare sistemele de cultura continua se subdivid in doua grupe principale deschise și inchise. La randul lor acestea pot fi omogene, heterogene sau mixte cu un singur stadiu sau mai multe stadii.

Dupa modul de transformare al componentelor nutritive, componentele proceselor de biosinteza se clasifica in:

a)     procese simple à in care componentele nutritive (substratul) se transforma in produse de reacție fara acumulare de intermediar in mediu (exemplu: dezvoltarea drojdiilor prin metabolizarea hidraților de carbon simpli);

b)    procese simultane à componentele nutritive (substratul) se transforma in diferite proporții in produsele de reacție fara acumulare de intermediari in mediu. Vitezele relative de acumulare ale produselor de reacție depind de concentrația componentelor nutritive;

c)     procese consecutive à componentele nutritive (substratul) se transforma in intermediar inainte de transformarea in produse de reacție (ex: oxidarea glucozei la acid catogluconic cu acetobacter sub oxidanți, glucoza se transforma in totalitate in acid gluconic care se oxideaza ulterior), componentele nutritive se transforma in produse de reacție intr-o secvența determinata (ex: mediul de biosinteza conține hexoze și pentoze).

E. coli utilizeaza hexozele in totalitate și ulterior pentozele. Majoritatea proceselor de biosinteza sunt insa mult mai complicate printre altele și datorita complexitații mediilor utilizate.

O clasificare mai generala este cea elaborata de Gaden:

a)     procese de biosinteza in care formarea produselor depinde direct de utilizarea substratului (ex: biosinteza alcoolului etilic);

b)    procese de biosinteza in care formarea produselor depinde indirect de utilizarea substratului (ex: biosinteza acidului citric);

c)     procese de biosinteza in care formarea produselor este aparent independenta de utilizarea substratului (ex: biosinteza penicilinei).

Implicațiile ingineriei genetice in biotehnologia de obținere a preparatelor enzimatice microbiene

Ingineria genetica a patruns in biotehnologie soluționand probleme dificile legate de producerea de antibiotice, acizi organici, aminoacizi carburanți, produse chimico-farmaceutice și alimentare.

Extinderea biotehnologiei in industrie a fost favorizata de costurile reduse ale majoritații materiei prime provenite din produse secundare de origine vegetala cu utilizari minore (tarațe, paie, șroturi), la aceasta se adauga capacitatea culturilor de microorganisme de multiplicare in ritm rapid și cu o eficiența ridicata de biocataliza a enzimelor.

În consecința preparatele enzimatice microbiene se produc la costuri mult mai mici decat cele de proveniența vegetala sau animala.

Procedee de ameliorare a bioproducatorilor microbieni

Bioproducatorii microbieni pot fi ameliorați prin mutageneza, heterocarioza, transformari genetice, fuziuni de protoplaști.

Mutageneza consta din izolarea de microorganisme cu insușiri dorite și multiplicarea lor in vederea obținerii de bioproducatori ameliorați. Aceasta se efectueaza fie prin selecția de mutante avantajoase care apar spontan intr-o populație microbiana sau prin suprimarea mecanismelor de reglare inducand mutații cu ajutorul unor tratamente fizice sau chimice.

Heterocarioza reprezinta un fenomen parasexual de ameliorare a unor bioproducatori microbieni (miceliul unor fungi filamentoși putand conține doua tipuri de nuclee care nu fuzioneaza, fiecare provenind de la un parinte). Pe aceasta cale s-au obținut Penicilum Crisogenum care produc cantitați mari de penicilina.

Transformarea genetica consta in transferul unei cantitați limitate de ADN liber extras prin metode adecvate dintr-o celula donatoare și transmis intr-o alta celula receptoare. Pe aceasta cale s-a reușit creșterea producției de α-amilaza prin sinteza extracelulara la culturi de Bacilus subtilis cu transfer de gene.

Prin fuziuni de protoplaști sau utilizand celule intacte apare posibila transferarea de gene (tehnici aplicate pentru drojdii și fungi filamentoși) astfel prin aceasta fuziune la drojdii s-a reușit asimilarea de dextrine de catre acestea. În acest scop s-a extras și s-a purificat ADN din Sacharomices Diastaticus care a fost inoculat cu receptori de Sacharomices Uvarum și Sacharomices Cerevizae.

Cinetica procesului de biosinteza

Creșterea și multiplicarea microorganismelor

Procesul de creștere este rezultatul sintezei specifice echilibrate pornind de la substanțele nutritive din mediu a unor compuși noi care sunt apoi asamblați pentru a forma copii fidele ale constituenților celulari.

Creșterea bacteriilor se realizeaza prin depunerea uni- sau tridimensionala de substanța noua ceea ce determina marirea celulei bacteriene in sensul uneia dintre dimensiunile ei sau in sensul tuturor celor trei dimensiuni.

Marirea volumului celular se face la bacterii nu numai prin sinteza de substanța organica ci și prin oprirea consecutiva accentuata a conținuturilor de apa.

Se admite astazi ca activitatea normala a microorganismelor este condiționata de existența unui anumit raport intre volumul celulei care consuma și suprafața ei prin care se face absorbția substanțelor nutritive și eliminarea cataboliților.

În cursul creșterii celulei raportul suprafața/volum se modifica datorita faptului ca in timp ce suprafața crește cu o rație patratica volumul ei se marește dupa o rație cubica ceea ce determina o diminuare relativa a suprafeței celulei.

Pe masura ce dimensiunile celulei se maresc echilibrul ei se acumuleaza intru-cat circulația substanței prin difuziune in ambele sensuri spre interior și spre exterior devine mai dificila. Datorita acestor fenomene atunci cand disproporția dintre suprafața și volum atinge un anumit punct critic raportul lor adecvat se stabilește prin diviziunea celulei ajunsa la limita ei de creștere.

Studiul creșterii și multiplicarii microorganismelor producatoare are o importanța deosebita pentru reușita și eficiența tehnologiilor industriale. Spre deosebire de organismele pluricelulare la care multiplicarea celulelor duce la marirea taliei individului la toate celelalte organisme unicelulare ea are ca rezultat creșterea numarului de indivizi.

Multiplicarea celulelor bacteriene se realizeaza pe doua cai dintre care una este diviziunea simpla, directa sau binara, iar cealalta inmugurirea sau ramificarea este caracteristica unui numar relativ mic de specii bacteriene. Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepțional de mare, durata unei generații, adica intervalul de timp dintre doua diviziuni succesive este tipica pentru fiecare specie, dar poate varia la aceeași specie in funcție de condițiile de mediu, fiind in general cuprinsa in limitele a 20-30 minute.

Numeroși cercetatori apreciaza capacitatea de creștere și multiplicare a bacteriilor prin timpul de generație definit ca intervalul de timp necesar pentru dublarea masei celulare.

Actinomicetele - sunt bacterii gram pozitive tranzitoriu sau constant filamentoase și ramificate, se multiplica prin diviziune directa, iar speciile sporogene formeaza 4 tipuri de spori:

oidiospori;

conidi;

sporangiospori;

clamidospori.

Levurile sau drojdiile incadrate in filumul eumicetes (fungi adevarați) - se prezinta in mod obișnuit și dominant in forma unicelulara și au o organizare interna de tip eucariot. Se inmulțesc asexuat prin inmugurire și ocazional prin diviziune simpla.

Mucegaiurile - sunt fungii filamentoși cu structura celulara de tip eucariot, se reproduc prin spori asexuați (zoospori, sporangiospori, conidiospori, clamidospori, oidiospori) și spori sexuați (ascospori, bazidiospori și zigospori).

Dinamica multiplicarii populațiilor bacteriene

În condiții experimentale dinamica multiplicarii populațiilor bacteriene evolueaza intr-o serie de faze succesive.

1 - Faza de latența/ lag este cuprinsa intre momentul introducerii germenului in mediul de cultura (inoculare) și momentul in care celulele acestuia incep sa se multiplice.

În cursul acestei faze numarul bacteriilor din inoculum ramane neschimbat, cultura nu este vizibila macroscopic și aceasta faza dureaza in medie cateva ore (2 ore).

Se observa in modul cel mai evident atunci cand bacteriile insamanțate provin din culturi vechi.

Populația fiind alcatuita in principal din forme de rezistența, iar celulele sunt deficiente in enzime sau produși intermediari de metabolism.

Faza de latența apare deci ca o perioada de adaptare la condiții noi de cultura in care bacteriile viabile iși acumuleaza in celula metaboliții esențiali și sistemele enzimatice necesare creșterii in cazul in care aceste componente biochimice le lipseau și datorita condițiilor de viața anterioare insamanțarii.

2 - Faza de multiplicare exponențiala/ de creștere logaritmica este caracterizata prin faptul ca dupa o scurta perioada de accelerare a ritmului de creștere in care multiplicarea se produce cu o viteza marita acest ritm devine constant pentru un organism dat in anumite condiții de cultura, durata unei generații fiind minima.

Celulele aflate in faza exponențiala de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetari de genetica și fiziologie bacteriana.

Diviziunile sunt destul de bine sincronizate și numarul celulelor viabile se dubleaza brusc și la intervale regulate.

Din aceasta faza se pot realiza biosintezele in culturi continue.

Dupa un timp relativ scurt tendința de multiplicare rapida scade progresiv datorita epuizarii substanțelor nutritive din mediu și acumularii a produselor de catabolism in concentrații cu efect inhibitor.

3 - Faza staționara maxima este faza in care numarul celulelor viabile este maxim și ramane constant o perioada de timp care dureaza de la cateva ore la cateva zile in funcție de sensibilitate bacteriilor la condiții favorabil de mediu.

În cazurile in care intrarea culturilor in faza staționara este determinata de epuizarea substanțelor nutritive din mediu celulelor nu se mai multiplica, iar numarul total al indivizilor populației este constant și egal cu numarul celulelor viabile.

Atunci cand este vorba de o lipsa parțiala de substanțe nutritive sau de acumularea unor produși toxici multiplicarea persista in ritm incetinit, dar este contrabalansata de o mortalitate cu ritm echivalent. Adica numarul celulelor viabile ramane constant in timp ce numarul total al bacteriilor din cultura (atat vii, cat și moarte) crește.

4 - Faza de declin corespunde unei scaderi progresive a numarului celulelor viabile mergand pana la sterilizarea bacteriologica a culturii.

La un moment dat numarul bacteriilor viabile scade in progresie geometrica in raport cu timpul datorita morții unui numar foarte mare de celule.

Creșterea unei populații bacteriene se poate aprecia direct prin mai multe metode ca determinarea substanței uscate a masei celulare, dozarea intr-o cultura a unuia dintre constituenții bacterieni elementari, carbon sau azot, intr-o cultura și aprecierea cantitativa a unei enzime sau a unui produs metabolic și evaluarea numarului total al celulelor bacteriene (vii și moarte) cu ajutorul celulei microscopice de numarat sau a numarul celulelor viabile (capabile de multiplicare) prin insamanțare pe medii de cultura solidificate.

Ca metode indirecte se folosesc aprecierea gradului de turbiditate al suspensiei bacteriene intr-un mediu lichid in raport cu o scara etalon sau la fotocolorimetru prin determinarea absorbției razelor UV.

Spre deosebire de bacteriile propriu-zise actinomicetele cresc sub forma de colonii și in mediile lichide deoarece la aceste microorganisme singurele celule individuale sunt conidiile.