PRACTICE MICROBIOLOGIE

PRACTICE MICROBIOLOGIE

L.P. 6/

CARACTERE DE CULTURA, BIOCHIMICE SI METABOLICE: TIPURI DE COLONII, HEMOLIZA, CAPACITATEA FERMENTATIVA, ALTE CARACTERE BIOCHIMICE SI METABOLICE PE MEDII DIFERENTIALE, SELECTIVO- DIFERENTIALE SI MULTITEST

* INSAMANTAREA PRELEVATELOR PATOLOGICE:

tampon,

ansa,

pipeta Pasteur,

seringa (sange/ hemoculturi),

bagheta,

* INCUBARE:

- temperatura: 22ºC, 35ºC, 37ºC, 42ºC, 44ºC, 56ºC etc,

- umiditate: 70- 80%,

- atmosfera: aeroba, microaerofilie (70-80% azot, 15 - 20%CO2, 5% O2), anaerobio-   

za (lipsa O2),

- timp: 24h, 48h, 72h, 5 zile (levuri), 60 zile (Mycobacterium tuberculosis)

* EXAMINAREA CULTURILOR:

- in scopul identificarii (prezumptive, a agentului etiologic)

a) Aspectul cultural pe medii solide:

- aspectul coloniilor,

- numarul coloniilor (chiar absenta lor pe mediul de cultura are semnificatie: pacient tratat cu antibiotice),

● aspectul coloniilor:

- forma: punctiforma, circulara, neregulata,

- marime: mm in diametru,

-profilul coloniei: plate, convexe, ombilicate, conopidiforme/ "R", escavate (Str. pneumoniae),

margini: regulate, neregulate,

- suprafata: neteda, lucioasa, bombata (convexa), mamelonata/ acuminata, neregulata, rugoasa etc.

♠ forma "S"= "Smooth" : colonii rotunde, cu suprafata neteda, lucioasa, margini regulate, se omogenizeaza usor in in ser fiziologic si apartin, de obicei, formelor virulente,

♠ forma "R"= "Rough": colonii cu suprafata si marginile neregulate, rugoase, nu se omogenizeaza usor in ser fiziologic si sunt caracteristice bacteriilor nevirulente.

-opacitate: opace, semitransparente, translucide, transparente (ca picatura de roua/ Vibrio cholerae),

- consistenta: cremoasa, mucoasa, vascoasa, friabila,

- aderenta la mediu: aderenta, inclavata in mediu sau se desprinde usor,

- miros caracteristic: flori de tei (Pseudomonas aeruginosa),

-pigment caracteristic- pigment alb, citrin, portocaliu/ auriu (Staphylococcus spp), pioverdina, picianina, piorubrina (Pseudomonas aeruginosa) etc.,

- gradul de suspensionare in ser fiziologic: in tehnica de aglutinare pe lama- formeaza suspensie omogena sau suspensie granulara (grunji in ser fiziologic),

● prezenta hemolizei:

- tipul hemolizei: completa (beta/ ), incompleta (alfa/

- raportul intre marimea coloniei si aria zonei de hemoliza:

Streptococcus pyogenes: colonie punctiforma sau 0,5 - 1 mm, rugoasa sau mucoasa (forma virulenta, capsulata), cu zona larga de hemoliza completa in jur,

- Staphylococcus aureus: colonie 1- 2 mm, cremoasa, suprafata lucioasa, margini regulate, bombata, pigmentata, cu zona f subtire, imperceptibila de hemoliza in jur,

● pe medii diferentiale (AABTL), selectiv - diferentiale (MacConkey cu lactoza, MacConkey cu sorbitol, ADCL, Chapman) :

colonii lac(+): galbene pe AABTL, roz opace pe MacConkey, ADCL,

lac (-): translucide, de culoarea mediului,

sorbitol (+): rosii,

sorbitol (-): roz translucide, culoarea mediului,

colonii manita(+): galbene, cu virarea mediului in galben (Staphylococcus aureus),

colonii manita(-): roz, culoarea mediului, care ramane nevirat (Staphylococcus spp)

● fenomenul de invazie:

- caracteristic pentru genul Proteus (Proteus mirabilis si Proteus vulgaris): crestere a culturii in cercuri concentrice, invazia poate ocupa toata suprafata placii. Invazia poate fi oprita, inhibata, prin adaugarea in mediu de saruri biliare (MacConkey, ADCL), thiosulfat de sodiu (AABTL), ceea ce permite obtinerea de colonii izolate. Daca se insamanteaza doua tulpini diferite de Proteus, la intalnirerea zonelor de invazie, se formeaza o linie de demarcatie (Fenomen Dienes).

b) Aspectul cultural in medii lichide:

* aprecierea dezvoltarii florei bacteriene in eprubetele cu mediu lichid:

- absenta cresterii,

- crestere saraca,

- crestere moderata,

- crestere abundenta,

* gradul de turbiditate:

- turbiditate absenta,

- turbiditate prezenta:

- turbiditate moderata sau intensa,

- sub aspect granular sau sub forma de flocoane,

* formare de depozit:

- depozit absent,

- depozit prezent:

- cantitativ: putin, abundent,

- depozit floconos, aderent de fundul tubului, cu mediu clar deasupra (Bacillus anthracis),

- granular, dezintegrabil sau nu prin agitare, cu pastrarea mediului clar deasupra lui, (Streptococcus spp)

* formare de val:

- val absent,

- val prezent: in ●meningita tuberculoasa, mentinerea la frigider (+4ºC) a 2-3 mL LCR, permite formarea unui val membranos, a unei membrane groase, plisate, la suprafata lichidului, format din fibrina, celule inflamatorii si bacili BAAR. Etalarea valului pe lama de microscop si colorarea lui Ziehl - Neelsen, permite vizualizarea BAAR.

●val subtire la suprafata mediului: Vibrio cholerae,

* crestere in suprafata:

- absenta,

- prezenta:

- crestere uniforma, cu inel aderent de pereti, la suprafata mediului (Escherichia coli),

- pelicula aderenta, uscata, la suprafata (bacilli aerobi sporulati/ Bacillus subtilis),

miros:

- absent,

-prezent: aromat (Ps. aeruginosa), de indol (Enterobacteriaceae), de "corn ars" (anaerobi, Clostridium tetani), fecaloid (E. coli)

* culoare

- verde: pigment eliberat de Ps. aeruginosa,

- rosu: Serratia marcescens etc

c) Caractere culturale, biochimice si metabolice, pe medii de identificare:

Testul sensibilitatii la bacitracina:

pe mediu geloza sange berbec se insamanteaza confluent o tulpina de streptococ beta hemolitic, se aplica un comprimat de bacitracina 0,04 UI si se termostateaza 24 ore la 37 ºC,

scopul este de a diferentia streptococii beta hemolitici de grup A (bac+, bacitracina - sensibili) de streptococii de grup non- A (C, G, F, bac -, bacitracina- rezistenti),

Interpretare:

* Test (+): orice zona de inhibitie a cresterii in jurul discului de bacitracina (tulpina sensibila la bacitracina, este inhibata cresterea ei, nu mai elibereaza hemolizine, hematiile raman integre in jurul discului, rezulta zona circulara, rosie, in jurul comprimatului de bac),

* Test (-): tulpina de streptococ beta hemolitic este rezistenta la bacitracina, cultura creste pana in marginea discului impregnat cu bacitracina, elaboreaza hemolizine, lizeaza hematiile din mediu, rezulta zona clara de hemoliza beta in jurul comprimatului).

Testul sensibilitatii la optochin:

diferentiaza Streptococcus pneumoniae (optochin sensibil) de streptococci viridans (rezistenti la optochin),

pe o placa cu geloza sange se efectueaza sectoare din colonii izolate, cu aspect morfologic cultural sugestiv pentru pneumococ, se aplica cate un disc impregnat cu optochin 5 µg,

incubare la 37ºC, 24 ore, in atmosfera imbogatita cu 5% CO2,

Interpretare:

* Test (+): sensibilitate la optochin: zona de inhibie a cresterii cu diametrul >= 14 mm, Streptococcus pneumoniae,

* Test (-): rezistenta la optochin, fara zona de inhibitie a cresterii (streptococci viridans),

Aspectul cultural pe medii de identificare multitest:

TSI (three sugar, iron):

testeaza fermentarea glucozei (cu sau fara gaz), a lactozei, zaharozei, precum si producerea de hidrogen sulfurat,

- acest mediu agarizat, solidificat prin racire, in coloana si panta, contine glucoza, lactoza, zaharoza, o sursa de sulf, indicator de pH si unul pentru H2S,

- panta este cea care diferentiaza fermentarea lactozei si zaharozei de fermentarea glucozei,

- mediul contine de 10 X mai putina glucoza decat lactoza si zaharoza, ca atare, si metabolitii acizi rezultati din degradarea zaharurilor, vor fi cantitativ, corespunzatoare,

- in coloana, glucoza va fi degradata in absenta oxigenului, fermentativ, cu producere de cataboliti acizi, virare a mediului spre pH acid (culoarea roz a mediului devine galbena),

- daca bacteria nu degradeaza glucoza, mediul din coloana ramane roz (bacterii glucozo- nefermentative/ Pseudomonas aeruginosa),

- la nivelul pantei, vor fi degradate oxidativ (in prezenta O2) lactoza si zaharoza,

- bacteriile lactozo (+), degradeaza lactoza cu producere de cataboliti acizi, scade pH- ul si are loc virarea de culoare de la roz la galben (panta galbena, coloana galbena/ E. coli),

bacteriile lactozo (-) nu degradeaza lactoza din mediu, panta ramane roz, nemodificata (coloana galbena, panta roz/ Shigella dysenteriae),

+/ - gaz,

- +/ - hidrogen sulfurat (coloana galbena, cu mai mult sau mai putin H2S/ Proteus, Salmonella etc).

* MIU (mobilitate, indol, uree):

mediu utilizat pentru triajul bacteriilor din familia Enterobacteriaceae, in ceea ce privesc: producerea de ureaza, indol si a mobilitatii,

- mediul contine: uree, peptone, triptofan, rosu fenol drept indicator de pH,

- este solidificat in coloana, ca geloza moale, care permite vizualizarea mobilitatii microorganismului insamantat, prin opacizarea mediului ,

- hidroliza ureei (producerea de ureaza/ la Proteus, Providencia, Morganella) alcalinizeaza mediul (din roz, culoarea vireaza in rosu portocaliu intens),

- producerea de indol este evidentiata prin inrosirea benzii impregnate cu reactiv Kovacs.

(indol+ la E. coli, Proteus vulgaris)

Citire, interpretare:

opacifiere numai in lungul traiectului de insamantare: bacterie imobila,

coloana de mediu opacifiata: bacterie mobile,

coloana alcalinizata (rosie): ureaza pozitiva,

culoarea coloanei nemodificata: ureaza negative,

inel rosu limitat la suprafata mediului: alcalinizare nespecifica,

hartia indicator rosie: indol pozitiv,

hartia galbena, nemodificata: indol negativ.

Caracterul cultural (in special al coloniilor izolate, cu morfologie caracteristica pe medii corespunzatoare, nutritive sau diferentiale) poate oferi elemente suficiente pentru un diagnostic prezumptiv, foarte important pentru orientarea in instituirea tratamentului empiric.

In continuare, se face:

a) selectionarea coloniilor si repicarea lor in functie de:

aspectul coloniei,

natura prelevatului,

diagnosticul clinic,

rezultatul examenului bacterioscopic al produsului patologic,

b) identificarea speciei bacteriene (corelarea caracterelor morfologice, culturale, metabolice, antigenice si de patogenitate).