Microbiologie - indicatiile antibiogramei

MICROBIOLOGIE

DEFINITIE : metoda de testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice si substante chimioterapice, a unei tulpini bacteriene izolate si identificate, dintr-un prelevat patologic.

INDICATIILE antibiogramei :

in infectii cu etiologie bacteriana, determinate de germeni cu sensibilitate variabila la antibiotice,

in infectii bacteriene severe, sistemice (septicemii, endocardite, meningite, peritonite etc) care necesita spitalizare si tratament de lunga durata, cu scheme variate de tratament antibiotic (conditii care selecteaza suse bacteriene cu mecanisme multiple si complexe de rezistenta castigata genetic, la diverse clase de antibiotice),

in infectii bacteriene localizate cu tendinta la cronicizare (infectii urinare, biliare, otice, osteomielite, escare etc) in care exista riscul selectarii de tulpini rezistente la antibiotice, datorita persistentei indelungate in organism si supuse permanent presiunii selective a diverselor scheme de administrare a antibioticelor,

in infectii intraspitalicesti : determinate de tulpini bacteriene (Staphylococcus aureus meticilino- rezistent/ MRSA ; Enterococcus faecium rezistent la vancomicina/ VRE ; E. coli, Klebsiella pneumoniae producatoare de beta lactamaze cu spectru extins/ ESBL ; Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa multultidrog rezistenti etc,) selectate in sectii de terapie intensiva sau diverse profile chirurgicale, datorita tratamentelor cu antibiotice cu spectru larg si de lunga durata,

CONTRAINDICATIILE ANTIBIOGRAMEI :

agentul etiologic microbian are o sensibilitate cunoscuta si deocamdata constanta : Ex : sensibilitate la penicilina a tulpinilor de Streptococcus pyogenes (Str. beta hemolitic grup A),

GENERALITATI 

Principiul metodei : consecutiv depunerii de microcomprimate cu antibiotic pe suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc urmatoarele procese fizico - chimice :

- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei antimicrobiene active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce conditioneaza difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constanta a gradientului de concentratie, de la marginea discului spre periferie.

Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si constanta.

Exista pentru un anumit antibiotic o relatie inversa intre diametrul zonei de inhibitie, apreciata difuzimetric si concentratia minima inhibitorie/CMI, determinata prin diverse metode.

Atributul de tulpina intermediara se acorda situatiilor in care germenul poate fi inhibat in doze masive, accesibile sau este sensibil prin concentrarea antibioticului in produsul respectiv : bila, urina, materii fecale.

Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru :

Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta diametrul zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.

1. Mediul de cultura geloza Mueller - Hinton

asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida,

nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni,

contine concentratii adecvate de Ca si Mg,

este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii,

compozitie definita,

asigura reproductibilitate de la lot la lot,

compozitie standard si consistenta corespunzatoare,

pH

grosimea stratului de geloza : 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90 mm),

2. Germenul de testat :

agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura,

contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta,

efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e o constanta dinainte previzibila,

se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea care au tendinta de a castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic,

antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile si contaminate cu un singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina),

antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul ; stocarea indelungata duce la aparitia determinantilor de rezistenta.

* Inoculul : - sa fie reprezentativ, preparat din 4 - 6 colonii identice,

marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (densitate 0,5 unitati MacFarland al inoculului),

insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii,

cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii diferite, pana la acoperirea uniforma a suprafetei mediului,

placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului inainte de depunerea microcomprimatelor,

daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura bacteriana uniform confluenta.

3. Substante antimicrobiene :

sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul respectiv,

conservarea microcomprimatelor : la adapost de lumina, caldura, umiditate,

inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare termica,

interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit,

selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma :

2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite :

unul pentru germeni Gram - pozitivi,

unul pentru germeni Gram - negativi,

unul pentru infectii urinare,

asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni,

depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand usor fiecare microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu cultura sau cu ajutorul unui dispozitiv numit « dispencer »,

se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre comprimate,

pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.

In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, ale    

caror antibiotice sunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizarea

infectiei.

Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor

se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al puritatii si densitatii,

citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in mm, de 2-3 ori, in diferite directii, cu o rigla,

pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in lumina reflectata,

daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata, in lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.

Se iau in consideratie :

colonii mari, bine dezvoltate, aparute in zona de inhibitie, colonii ce reprezinta mutante rezistente in cadrul unei populatii microbiene, predominant sensibile.

astfel de colonii se vor rerepica, identifica, retesta sensibilitatea la antibiotice.

Control de calitate : tulpini de referinta -

ATTC Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa.

Exprimarea rezultatelor in buletin :

se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei germenilor la antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului NCCLS,     CLSI 2008.

Surse de eroare :

alt mediu decat geloza Mueller - Hinton,

mediu necontrolat din punct de vedere al pH - ului,

folosirea microcomprimatelor cu termen de valabilitate depasit,

inocul nestandardizat,

depasirea intervalelor de timp intre prepararea inoculului si insamantare, intre insamantare si aplicarea comprimatelor, intre aplicarea lor si incubare,

perioada de incubare prea scurta,

testarea pe culturi mixte, produse pluricontaminate, pe germeni cu dezvoltare lenta,

citire inexacta a diametrelor zonelor de inhibitie sau transcrierea lor eronata,

lipsa controlului de calitate, cu tulpini de referinta.