Microscopia electronica

Microscopia electronica

Microscopul electronic reprezinta un instrument de vizualizare directa a ultrastructurilor celulare, cu o putere de rezolu ie mult mai mare decat a microscopului fotonic. Microscopul electronic functioneaza la fel ca si un microscop optic, diferenta fiind ca in loc de fotoni se folosesc electroni ca sa iluminam proba de investigat, iar in loc de lentile de sticla se folosesc lentile electromagnetice si/sau electrostatice.

Microscopul electronic este constituit dintr-o sursa de lumina (tun de electroni) care ilumineaza proba, iar apoi 'lumina' transmisa prin proba este proiectata cu ajutorul unui sistem optic pe un ecran fluorescent sau pe o camera CCD.

Descriere mod de organizare i func ionare

Microscopul electronic se bazeaza pe proprietatea electronilor de a fi devia i de un camp elecrostatic sau electromagnetica. Daca se plaseaza un filament (catodul) intr-un tub cu vid, dupa care filamentul se incalze te, el emite electroni ce pot fi accelera i, prin intermediul unei diferen e de poten ial.

Fluxul de electroni astfel realizat are proprieta i similare luminii, prezinta caracteristici corpusculare i vibratorii, insa lungimea de unda este mult mai mica in compara ie cu lumina alba. Acest flux trece printr-o bobina electromagnetica (cu rol asemanator unui condensator) prin care electronii se concentreaza in direc ia obiectivului.

Lungimea de unda    a unui flux de electroni este in func ie de tensiunea de accelerare la care ace tia sunt supu i i se poate calcula dupa formula lui Broglie:

Λ= h/mv

Λ= lungimea de unda

h = constanta lui Plank

v = viteza electronului

m= masa electronului

Instrumentul mai prezinta o bobina electromagnetica cu func ii similare lentilei obiectivului prin care se ob ine o imagine marita a obiectului, iar una care func ioneaza ca i ocular sau lentila de proiec ie. Aceasta permite o marire suplimentara a imaginii.

Limitele de rezolu ie calculate pentru microscopul electronic sunt cuprinse intre 3-5Å. In cercetarea biologica aceasta limita de rezolu ie este de 10Å. Un microscop electronic ce prezinta o marire ini iala a obiectului de 100x, poate mari imaginea de 200x, cu ajutorul bobinei proiectoare, ceea ce echivaleaza cu o marire totala de 20.000x. Instrumentele perfec ionate pot realiza mariri suplimentare de 160.000, iar imaginea poate fi fotografiata la 1.000.000x marire i chiar 80 milioane x.

Cel mai performant microscop din lume, este la acest moment instalat la Berkeley Lab si are o rezolutie de 0.5 Å. Diametrul  unui atom este intre 1Å si 5Å. Microscopul de la McMaster este aproape identic (diferentele sunt minore) cu cel de la Berkeley si are specificatiile de rezolutie, mai bune de 1 Angstrom, dar in practica s-a putut obtine o rezolutie de 0.65Å in TEM si 0.79Å in STEM. Microscopul are doua corectoare de aberatie de sfericitatete, unul pentru partea de iluminare (de formare a fasciculului) si un corector pentru partea de imagine. In afara de cele doua corectoare, are un monochromator pentru fascicolul de electroni, un spectrometru de electroni de inalta rezolutie, detector de raze X (EDX) si citeva camere CCD. Microscopul de Universitatea McMaster Hamilton, Ontario, Canada este cel mai performant microscop instalat intr-o universitate. Cel mai puternic microscop din lume (Titan), nu studiaza scara nano (adica grupari de cativa atomi), ci scara nano-nano, adica a mia parte din un proton.

Microscopul are doua corectoare de aberatie de sfericitatete, unul pentru partea de iluminare (de formare a fasciculului) si un corector pentru partea de imagine. In afara de cele doua corectoare, are un monocromator pentru fascicolul de electroni, un spectrometru de electroni de inalta rezolutie, detector de raze X (EDX) si citeva camere CCD.

Formarea imaginii

In microscopia fotonica formarea imaginii este data de devierea razelor de lumina de catre preparatul biologic, cu densita i diferite. In cazul preparatelor colorate, colorantul fixat pe diferite structuri absoarbe o parte din radia iile luminoase, iar imaginea este rezultatul radia iilor reziduale ce dau culoarea complementara.

In microscopia electronica, formarea imaginii este rezultatul dispersiei electronilor, determinata de    mai multe motive. Cauza principala a dispersiei electronilor este data de grosimea i densitatea moleculara a obiectului biologic i in special de numarul atomic i    natura atomilor ce intra in constitu ia sa. Cu cat este mai mare numarul atomic, cu atat este mai mare dispersia.

Majoritatea atomilor care intra in constitu ia materiei vii au numar atomic scazut i din acest motiv este nevoie sa se fixeze atomi grei pe structurile biologice pentru a putea fi vizualizate.

De asemenea, imaginea depinde i de grosimea sec iunii. Daca sec iunile sunt prea sub iri apare o deviere mica, iar imaginea este lipsita de contrast, daca grosimea este prea mare imaginea devine neclara.

Avantaje i dezavantaje

Microscopul electronic este un instrument ideal pentru studiul structurilor submicroscopice celulare, al unor constituien i chimici celulari sau macromolecule purificate. Se poate urmari structura in relief a moleculelor din structurile biologice, deosebit de folositoare pentru a lamuri aranjamentele moleculare ale membranelor plasmatice i citoplasmatice.

Deoarece fluxul de electroni nu are o mare putere de penetra ie, pentru observarea la microscopul electronic a structurilor celulare este necesara utilizarea unor preparate biologice foarte fine. Daca grosimea materialului biologic depa este 5000 Å (0,5 microni), opacitatea este totala. Obiectul de studiu trebuie pus pe o grila metalica fina.

Microscopul electronic, prin utilizarea vidului in interiorul lor, nu permite studierea directa a celulelor vii. Limitarea este datorata i faptului ca preparatele biologice trebuiesc fixate, deshidratate i colorate, procedee ce produc o serie de alterari ale structurilor celulare.

De asemenea, bombardamentul cu electroni induce alterari de ordin structural sau chimic care in unele cazuri poate duce la calcinarea preparatului.

Confectionarea preparatelor biologice

Pentru analiza preparatelor biologice se folosesc mai multe tehnici:

studiul pe sectiuni ultrafine

prelevarea materialului

fixarea materialului Tipul de fixator, procedeul de fixare i durata depind de materialul biologic si de scopul urmarit

deshidratarea eliminarea apei din tesuturile fixate pe cale chimica sau fizica (acetona, al. Etilic, propilenoxidul sunt agenti de deshidratare)

includerea in rezine sintetice Cele mai uzitate sunt rasinile poliesterice (vestopal) i cele epoxidice (epon 812, epon 562) i medii de includere hidrofile (durcopanul) Includerea se face in capsule de gelatina sau polietilena (se tin la termostat la 600C 24-48 h pentru polimerizarea materialului de includere

sectionarea la ultratom -permite realizarea de sectiuni foarte fine invizibile ochiului liber.

etalarea pe grila a sectiunilor Sunt folosite suporturi confectionate pe cale electrolitica din cupru, nichel, otel inox,    argint, aur, platina, molibden

colorarea i contrastarea sectiunilor Se folosesc acetat de uranil i citrat de plumb (Sol Reynolds)

observarea

fotografiere i obtinerea imaginilor pozitive.

studii prin colora ie negativa a preparatelor depuse de grila (organite celulare, virusuri, etc.)

preparatul biologic este introdus intr-o solu ie care con ine un pigment intunecat, pigmentul nu interac ioneaza cu preparatul. Prin aceasta tehnica se pot studia structurile tridimensionale ale biomoleculelor, virusurilor, organitelor celulare purificate.

Metalizarea este o metoda de marire a contrastului . Metoda consta in evaporarea unui metal sub vid (aur, platina) si depunerea pulberii atomice sub un anumit unghi pe preparatul biologic.

Aplica ii

Stabilirea legaturilor genetice dintre organisme

Biosinteza de proteine si structurile implicate in acest proces

Structura si configuratia macromoleculelor proteice

Configuratia moleculara a acizilor nucleici si stabilirea greutatii lor moleculare

Procese de filtrare prin membrane

Transportul ionic in celule

Localizarea reactiilor imunologice si a activitatilor enzimatice

Structura suprafetelor tesuturilor, celulelor, biomoleculelor

Alcatuirea moleculara a virusurilor si mecanismele infectiei virale

Procese de transcriptie si translatie in codul genetic

Ultrastructura    diferitelor tipuri de celule si a componentelor acestora in stare normala i patologica.