Organizarea si expresia genomului - gene si cromozomi

ORGANIZAREA SI EXPRESIA GENOMULUI

Introducere

Gene si cromozomi

Genele sunt localizate in cromozomi

Primele harti genetice au fost realizate prin experiente de analiza genetica

Organizarea genomului nuclear

Elemente transpozabile

Concluzii

Introducere

Toate caracteristicile unei specii, de la cele morfo-fiziologice pana la timingul senescentei sunt inscrise in genomul speciei respective. La cele mai simple organisme exista mii de gene in care este codificata toata informatia genetica. Dintre plante, Arabidopsis thaliana, de exemplu, are un genom alcatuit numai din 5 perechi de cromozomi, cu aproximativ 26.000 gene. Organizarea genelor in cromozomi este determinata prin cercetari de genetica moleculara. In acest capitol vom prezenta in special organizarea genelor in interiorul cromozomilor.

Cea mai mare parte a genelor se gasesc in ADN nuclear. Plastidele si mitocondriile contin si ele ADN si, implicit, gene care codifica pentru produsi necesari functionarii si replicarii lor; unele caracteristici codificate de gene organitice sunt utile in reproducere - de exemplu, androsterilitatea citoplasmatica la sorg si porumb. Trasaturile determinate de gene organitice se recunosc prin transmiterea lor in descendenta: mitocondriile si cloroplastele sunt mostenite numai pe linie materna.

Intelegerea organizarii genomului si a reglajului genetic, din perspectiva istorica, atesta valabilitatea descoperirilor clasice. Descoperirile lui Gregor Mendel, la mazare (Pisum sativum) au marcat inceputurile geneticii moderne. Din legile elaborate de el a rezultat ca exista niste asa-numiti "factorii ereditari", ce determina caracterele fenotipice. Astazi, noi numim acesti factori gene, termenul fiind introdus in 1909 de catre W. L. Johansen. Odata cu marirea rezolutiei tehnicilor folosite, cromozomul a fost caracterizat din ce in ce mai bine, de-a lungul secolului trecut. elucidarea organizarii si expresiei genomului fiind un proces continuu.

In anii 1940, s-a demonstrat ca in cromozomi exista doua tipuri de molecule: acizi nucleici si proteine. Cercetatorii au inteles ca orice molecula responsabila de transmiterea informatiei genetice trebuie sa indeplineasca trei conditii:

1. sa contina informatia genetica necesara cresterii, dezvoltarii, structurii si reproducerii;

2. sa fie capabila de autoreplicare pentru a asigura acelasi continut de informatie la descendenti; ca si la parinti;

3. sa fie capabila de variatie si adaptare in evolutie.

Daca la inceput molecula de ADN, formata din succesiunea celor 4 nucleotide, parea prea simpla pentru a contine atat de multa informatie, in final s-a dovedit ca ADN-ul este molecula genetica. In plus molecula de ADN este foarte stabila, spre deosebire de proteine, iar cantitatea de ADN este, in general, asociata cu complexitatea organismului (bacteriile au mai putin ADN decat omul).

Astfel, inca din anii 1920 si pana la mijlocul anilor 1950, cercetatorii au combinat cunostintele de biochimie si genetica intr-o serie de experiente care au confirmat ca ADN-ul este materialul genetic. In 1928, Frederick Griffith a aratat ca o componenta a bacteriei virulente Streptococcus pneumoniae omorate prin caldura transforma o tulpina nevirulenta in virulenta. La momentul respectiv, nu s-a stabilit daca acea componenta este acid nucleic sau proteina. Mai tarziu, in 1944, Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod si Maclyn McCarty, folosind acelasi model biologic, au demonstrat ca acea "componenta" lui Griffith care a transformat tulpina nevirulenta in virulenta, era ADN-ul, care a rezistat la caldura. La plante, in anii 1950, s-au descoperit elementele mobile, segmente de ADN capabile de a se muta dintr-un loc in altul in molecula de ADN. Aceste elemente mobile sunt componente ubiquitare ale genoamelor si prin mutarea lor in genom duc la schimbari evolutive importante, mai rapide decat acumularea de mutatii punctiforme. In 1952, Alfred Hershey si Martha Chase au folosit un bacteriofag si au aratat ca molecula infectioasa era ADN, nu proteina. In 1953, pe baza tuturor acestor descoperiri, la care s-au adaugat analiza cristolografica cu raze X, realizata de Rosalind Franklin si Maurice Wilkins, precum si analiza cantitativa a compozitiei ADN realizata de Erwin Chargraff, Fracis Crick si James Watson au descris organizarea si structura de dublu helicala a ADN, acum atat de familiara. In 1958, George Beadl, Joshua Lederberg si Edward Tatum au primit premiul Nobel pentru cercetarile lor in reglajul genetic. De atunci pana in prezent, aproape jumatate din toate premiile Nobel pentru Chimie si Medicina sau Fiziologie s-au acordat pentru descoperiri in intelegerea organizarii genomului si reglajului genic.

In aceeasi perioada, a fost identificat ARN-ul ca material genetic la virusul mozaicului tutunului (VMT). Descoperirea ca ARN din VMT poarta intreaga informatie genetica necesara virusului pentru sinteza noilor particule virale au facut-o A. Gierer si G. Schram in 1956, purificand ARN-ul viral si initiind infectia frunzelor de tutun cu acesta.

Gene si cromozomi

Pentru prima data, in urma experientelor lui Mendel s-a facut legatura intre trasaturile fenotipice (fenotip) si factorii ereditari (genotip), la mazare. Se poate afirma, deci, ca plantele au jucat un rol crucial in fundamentarea geneticii ca stiinta. Mendel a studiat 8 perechi de caractere fenotipice ale mazarii: culoarea florii (violacee si alb) culoarea semintei (galben si verde), forma semintei (neted si zbarcit), culoarea pastaii (verde si galben), forma pastaii (ingrosata si subtire), inaltimea plantei (inalta si pitica) si pozitia florala (axiala si terminala). Alegerea unei specii cu autofecundare, cum este mazarea, a constituit primul si cel mai mare avantaj in obtinerea unor rezultate corecte, pentru ca Mendel a putut controla fecundarea. Rezultatele experientelor sale au iesit la lumina abia in 1900, odata cu descoperirea corespondentei intre Mendel si Carl von Nageli, un reputat botanist german al vremii; in scrisori, Mendel se referea - in afara de experientele sale pe mazare - si la experiente incercate pe Hieracium (vulturica), din fam. Compositae, planta care se inmulteste in special vegetativ, dand descendenti uniformi, care nu segrega. Initial, Mendel a tras concluzia ca legile transmiterii descoperite la mazare nu se aplicau si la Hieracium, deci ar fi avut o valabilitate limitata, fapt pentru care se arata foarte dezamagit in scrisori; tot din scrisori, reiese ca Mendel a continuat experientele pe porumb, la care, controland fecundarea, a obtinut rezultate similare cu cele la mazare. Oare ar fi fost astazi considerat Mendel parintele geneticii daca si-ar fi inceput experientele cu Hieracium?

Al doilea factor care a concurat la elaborarea legilor ereditatii a fost selectarea de catre Mendel a unor trasaturi fenotipice cu manifestare dominanta simpla, adica fiecare trasatura avea doar doua forme distincte, dominanta si recesiva, iar dupa incrucisare intre acestea, la descendenti se manifesta numai aspectul dominant.

In al treilea rand, Mendel a studiat caracterele numai doua cate doua, pentru a le putea urmari. O alta intuitie geniala, a fost aceea ca a studiat caractere care nu se transmiteau inlantuit. In sfarsit, interpretarea statistica a sutelor de incrucisari si miilor de descendenti obtinuti a dus la elaborarea a ceea ce numim astazi legile transmiterii mendeliene sau legile geneticii:

1. legea puritatii gametilor: fiecare gamet contine numai un factor ereditar (o alela) din cele doua alele ale unei gene;

2. legea segregarii: cele doua alele ale unei gene segrega in timpul formarii gametilor, un gamet primind o alela si celalalt gamet primind cealalta alela;

3. legea asortarii independente: genele responsabile pentru diferite trasaturi segrega indepnedent si se asorteaza independent una de alta (Fig. 1).

Fig. 1. Legile lui Mendel. A. Legea segregarii caracterelor: o planta homozigota pentru culoarea galbena a bobului (caracter codificat de gena G) este incrucisata cu o planta homozigota pentru culoarea verde, caracterele segregand in generatia F2 in raport de 3:1. B. Legea asortarii independente a caracterelor: o planta homozigota pentru caracterele bob neted (codificat de gena N) si galben (G) este incrucisata cu o planta homozigota cu bob zbarcit si verde. Caracterele segrega independent in generatia F2, rezultand patru fenotipuri, in proportiile indicate dedesubtul patratului Punnett.

In ciuda faptului ca a trecut mai mult de un secol de la constientizarea valabilitatii legilor mendeliene ale ereditatii, cercetarile continua la nivel molecular. Fenotipul de bob zbarcit este acum inteles la nivel molecular; gena responsabila pentru acest fenotip a fost clonata, aratandu-se ca fenotipul zbarcit este datorat unei mutatii in gena care codifica enzima SBE1 (starch-branching enzyme). Mutatia a fost caracterizata molecular ca o mutatie de insertie transpozon-like in gena ce codifica izoforma II a enzimei SBE1. Izoforma I a enzimei, prezenta, nu compenseaza functia izoformei II si productia de amidon scade la 30%. Mutatia reduce cantitatea de amidon in saminta si creste cantitatea de sucroza, cu consecintele acumularii de apa, maririi volumului celulei si, prin urmare, a greutatatii proaspate a semintei. Cand saminta devine matura si uscata, pierde apa si capata aspect zbarcit.

Genele sunt localizate in cromozomi

Dupa anul 1900, legile mendeliene au fost redescoperite, intelese si validate pentru toate organismele cu reproducere sexuata. Aceasta s-a datorat si intelegerii comportamentului cromozomilor in timpul diviziunii meiotice. Astfel, in 1903, Walter Sutton si Theodor Boveri au schitat teoria cromozomiala a ereditatii bazata pe observarea cromozomilor la microscopul optic, stabilind astfel legatura intre legile mendeliene si desfasurarea meiozei, intre genetica si citogenetica. Cei doi cercetatori au intuit ca genele (factorii ereditari ai lui Mendel) sunt localizate pe cromozomi, iar cromozomii, vazuti la microscopul optic, se transmit din generatie in generatie, asa cum se transmit si unele caractere fenotipice.

In 1916, Calvin B.Bridges a corelat nondisjunctia cromozomului X la Drosophila cu trasaturi ereditare specifice. Exemple de corelatie intre comportamentul cromozomilor in meioza si gene nu au intarziat sa apara si la plante. Astfel, in 1930, Barbara McClintock a studiat cromozomii la porumb. Porumbul este un sistem excelent de studii genetice: are un genom constituit din 10 cromozomi, care variaza in lungime de la cromozomul 1 (cel mai lung) la cromozomul 10 (cel mai scurt). McClintock a gasit pentru prima data la porumb indivizi trisomici (2n+1) si a facut corelatie intre cromozomul suplimentar si grupa de gene specifice care producea un anumit fenotip la trisomici si care schimba raportul mendelian de segregare (Fig. 2).

Fig. 2. Stabilirea localizarii unei gene pe un cromozom pe baza trisomiei: raportul descendentilor proveniti din incrucisarile ilustrate in figura difera atunci cand gena este localizata pe un cromozom trisomic sau intr-o pereche normala.

De asemenea, nu s-a lasat intarziata nici descoperirea fenomenului pe care astazi il numim recombinare genetica, care duce la noi combinatii de gene prin schimbul de segmente intre cromozomi omologi. Astfel, in 1905, s-a observat prima data la plante (Lathyrus odoratus) violarea legii mendeliene a asortarii independente, de catre W. Bateson, E. R. Saunders si P. C. Punnett. Conform legilor mendeliene, in experientele de dihibridare, cand sunt incrucisati doi parinti care difera prin doua caractere, in F₁, toti descendentii sunt identici si manifesta caracterele dominante, iar in F₂ segregarea are loc in raport de 9:3:3:1. Bateson si colaboratorii au realizat dihibridarea intre doua plante: una cu flori violacee si polen cu granula lunga si cealalta cu flori rosii si polen cu granula rotunda. In F₁, plantele au manifestat caracterele dominante: flori purpurii si polen lung, iar in F₂ cele mai multe plante aveau fie flori purpurii/polen lung, fie flori rosii/polen rotund. Deci cele mai multe plante semanau cu un parinte sau cu celalalt. Totusi, o mica proportie din plantele F₂ nu semanau cu parintii, ci aveau flori purpurii/polen rotund sau flori rosii/polen lung.

In acelasi timp in care Bateson si colaboratorii studiau transmiterea caracterelor ereditare la Lathyrus odoratus, Thomas H. Morgan realiza aceleasi incrucisari cu Drosophila melanogaster, intre mutante care se deosebeau prin culoarea ochilor si marimea aripilor. Rezultatele, de asemenea, nu respectau principiul asortarii independente. Morgan si colegii sai au propus ca aceste rezultate, diferite de ale lui Mendel, se datorau faptului ca respectivele caracterele se mostenesc impreuna, deoarece factorii ereditari care le determina sunt localizati strans apropiati, pe un singur cromozom. Astfel, genele care de obicei sunt mostenite impreuna sunt denumite gene linkate, iar intregul set de gene de pe un cromozom, se numeste grup de linkage. Proportia mica de indivizi care nu seamana cu parintii s-a explicat prin producerea fenomenului de recombinare, adica, ocazional, intre doua gene linkageul este intrerupt si in gameti apar noi combinatii de gene. Morgan a propus ca recombinarea este cu atat mai frecventa cu cat distanta dintre doua gene este mai mare. Ulterior, din urmatoarele experiente a rezultat ca recombinarea are la baza un proces fizic de rupere si schimb reciproc de segmente intre cromozomii omologi, proces denumit crossing-over. Frecventa recombinarilor, respectiv proportia indivizilor cu fenotipuri diferite de parinti, a fost folosita ca masura relativa a distantei intre doua gene pe cromozomi.

Fig. 3. Reprezentare diagramatica a unui set de cromozomi la porumb. Numarul si pozitia knobilor difera in functie de varietatea de porumb.

Prima dovada practica a schimbului de segmente intre cromozomii omologi a fost adusa de Harriet B. Creighton si Barbara McClintock prin studiul citogeneticii porumbului, folosind o linie de porumb in care bratul scurt al cromozomului 9 prezinta o formatiune denumita knob (fig. 3), iar bratul lung este mai lung decat de obicei din cauza unei translocatii implicand cromozomul 8. Acest cromozom 9 include gena pentru aleurona (C), care codifica pentru caracterul de samanta colorata si este localizata langa knob, precum si gena pentru endosperm cerat (caracter codificat de alela recesiva wx), localizata aproape de segmentul translocat din cromozomul 8. Experientele initiate la porumb de catre H. Creighton si B. McClintock au luat in considerare doua tipuri de markeri:

markeri citologici: knobul si bratul extralung, ambii vizibili la microscopul optic;

markeri genetici: cele doua gene codificand pentru cele doua caractere fenotipice, culoarea semintei (rosu sau fara culoare) si aspectul endospermului (cerat sau necerat).

Rezultatele incrucisarii plantelor de porumb cu cromozom 9 normal cu plante cu cromozomul 9 aberant au sugerat cercetatoarelor corelatia intre caracteristicile cromozomilor 9 vazute la microscop (knob, brat extralung) si fenotipurile determinate de genele continute in acest cromozom. In toate cazurile s-au observat fenotipuri recombinate, iar markerii citologici au indicat ca schimbarea structurala a cromozomului s-a produs prin crossing-over intre gena C (localizata langa knob, linkata cu acesta) si gena wx (linkata cu segmentul translocat din cromozomul 8) (Fig. 4).

Fig. 4. Crossing-over evidentiat cu ajutorul markerilor cromozomali: alela dominanta C este localizata in apropierea knobului, iar alela recesiva wx - in vecinatatea unui segment translocat de pe cromozomul 8. Prin incrucisarea intre o varietate de porumb cu cromozom 9 normal (c Wx), cu o varietate cu un cromozom 9 prezentand un knob si o translocatie (C wx), rezulta o pereche heterozigota pentru ambele alele si pentru markerii cromozomali; prin crossing over, markerii genetici si cromozomali sunt rearanjati.

Primele harti genetice au fost realizate prin experiente de analiza genetica

Dupa cum am aratat, Morgan si colegii sai au fost primii care au sugerat ca, cu cat distanta intre doua gene pe acelasi cromozom este mai mare, cu atat frecventa de recombinare este mai mare. Prin definitie, doua genele sunt linkate atunci cand mai mult de 50% din gametii produsi nu sunt recombinati. Frecventa de recombinare nu reprezinta strict distanta fizica intre gene, deci unitatile de masurare a distantei sunt unitati relative: distanta dintre doua gene care duce la 1% frecventa de recombinare reprezinta 1 unitate de harta sau un centi Morgan (Fig. 5A). De exemplu, o pereche de gene linkate pentru care 7% din descendenti nu seamana cu parintii si au alta combinatie de gene au o frecventa de recombinare de 7% si, respectiv, sunt separate prin 7 unitati de harta.

Fig. 5. Conceperea unei harti genetice (cromozomul 3 de la porumb). A1 - gena pentru antocianina (seminte purpurii); Etched - gena pentru seminte lucioase Sh2 - gena pentru stiuleti mici; Mdh3 - gena pentru malat dehidrogenaza. A. Genele A1 si Etched sunt la 12 unitati de harta distanta pentru ca frecventa de recombinare intre ele este de 12. B. Distantele intre genele Mdh3 - A1, A1 - Sh2 si A1 - Etchedi sunt de 3, 0,2 si, respectiv, 12%, dupa cum arata frecventele de recombinare.

Lucrurile se complica atunci cand cele doua gene sunt suficient de departe ca intre ele sa aiba loc crossing-overe multiple. In aceasta situatie, se poate intampla ca genotipul original al parintilor sa fie restaurat, iar prin screeningul descendentilor cu fenotipuri non-parentale sa rezulte un numar de recombinari mai mic.

Compararea frecventelor de recombinare intre diferite perechi de gene dintr-un grup de linkage a dus la determinarea ordinii genelor pe un cromozom, proces care se numeste cartare genetica (alcatuirea de harti de linkage) (Fig. 5B). Conditia principala pentru ca analiza genetica sa functioneze este ca genele implicate sa aiba alele multiple, altfel spus, sa prezinte polimorfism; astfel, alelele difera intre ele prin secventa fina de ADN, diferentele fiind detectabile in fenotipul parintilor. Polimorfismul unei gene se poate aprecia indirect, prin fenotipurile genitorilor si ale descendentilor sau direct la nivelul secventei de ADN (polimorfism ADN), prin tehnici moleculare precum cartarea cu enzime de restrictie sau secventiere. Spre deosebire de polimorfismul genelor, vizibil in fenotip, polimorfismul ADN, detectat prin tehnici moleculare, se poate referi si la secvente anonime, fara expresie fenotipica, secvente situate de obicei intre gene. In anii 1980, s-a realizat harta de linkage a polimorfismelor ADN la om, folosindu-se endonucleazele de restrictie, enzime care taie ADN-ul in situri specifice. O endonucleaza de restrictie taie reproductibil un segment dat de ADN in fragmente de lungimi diferite (Fig. 6), lungimea fragmentelor rezultate depinzand de localizarea siturilor de restrictie (secventa de ADN recunoscuta de enzima respectiva). Astfel, lungimea fragmentelor de restrictie difera intre segmentele de ADN din genoame diferite (de la indivizi diferiti), care pot contine situri diferite, datorate mutatiilor. Mutatiile duc la nerecunoasterea siturilor de catre enzimele de restrictie si, in consecinta, la lungimi diferite ale fragmentelor de restrictie de la un genom la altul (de aici, numele metodei: RFLP - restriction fragment length polimorphism, polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restrictie). Prin analiza lor se realizeaza caracterizarea genetica a ADN la nivel molecular.

Fig. 6. Identificarea genotipurilor cu ajutorul enzimelor de restrictie. Cateva exemple de enzime de restrictie sunt date in tabel. Enzima de restrictie ipotetica E1 taie regiunea P in 5 situri caracteristice, iar alela p - in 6. Fragmentele ADN sunt evidentiate prin electroforeza. Siturile de restrictie se mostenesc ca orice alta caracteristica, astfel incat polimorfismul lor poate fi urmarit in descendenta.

Spre deosebire de diferentele genomice vazute in fenotip ca, de exemplu, bob rotund/bob zbarcit, polimorfismele ADN (evidentiate prin RFLP) nu pot fi vazute in fenotipul plantei, ci doar prin tehnici precum Southern blotting: ADN-ul supus restrictiei este vizualizat electroforetic intr-un gel de agaroza, denaturat si transferat pe o membrana de nylon. Membrana este incubata cu fragmente de ADN a caror secventa este cunoscuta si care sunt marcate radioactiv sau fluorescent. Acestea din urma actioneaza ca sonde care hibrideaza cu secvente complementare de ADN fixate pe membrana. O astfel de sonda evidentiaza un fragment care poate varia in lungime la indivizi diferiti, generand patternuri individuale. Deoarece un astfel de marker RFLP se mosteneste mendelian (ca si caracterele fenotipice determinate de gene), acesti markeri pot fi cartati nu doar unul in raport cu celalalt, ci si in raport cu genele, prin urmare in raport cu caracterele fenotipice asociate acestora. Folosind RFLP-urile pentru cartare adesea se creaza o "punte" de legatura intre doua gene asezate mai departe pe cromozom.

Organizarea genomului nuclear

Dupa cum am descris in sectiunea anterioara, la nivelul cromozomului genele sunt asezate linear, aceasta permitand recombinarea si, in consecinta, diversitatea genetica. La nivelul genomului, pe de alta parte, genele au o organizare mult mai complexa. Desi in cazul multor genomuri, numai aproximativ 1-1,5% din genom reprezinta secvente care sunt transcrise si translate in produsi genici, adica in proteine, rolul genomului ca intreg este foarte mare.

Exista dovezi, la plante, ca genomuri diferite ca marime (exprimata in numar de baze) au aproximativ acelasi numar de gene esentiale, deci capacitatea de codificare este relativ constanta pentru plante diferite. S-au facut astfel de comparatii, de exemplu intre Arabidopsis si porumb (la acesta din urma, genomul fiind de doua ori mai mare) prin estimarea numarului de secvente de ADNc obtinut prin reverstranscriptie la ambele specii. Similar, porumbul si sorgul sunt specii inrudite, ambele avand 10 perechi de cromozomi (n=10); genomul de porumb este insa de 3 ori mai mare decat cel de sorg, pe cand numarul de gene esentiale este comparabil.

Prin hibridare moleculara intre secvente de ADN de la porumb si, respectiv, de la sorg, s-a observat omologie predominant pentru secventele unice si secventele in copii putine. Mai mult, unele gene de sorg manifesta acelasi aranjament cromozomal ca si genele corespunzatoare de la porumb. Diferentele de marime intre genomurile speciilor diferite rezulta, deci, nu atat din secventele transcriptibile, ci din secventele necodificatoare, repetitive, dintre gene. Prin urmare, se poate afirma ca cea mai mare parte din cantitatea de ADN are un rol important in determinarea structurii si in organizarea genomului, dar nu este direct implicata in sinteza proteinelor.

ADN-ul continut intr-o celula eucariota haploida se numeste valoarea C si poate varia de 10⁷ pana la 10¹¹ pb. Comparativ, genomul uman se situeaza la mijlocul acestei serii, adica este de 3 x 10⁹ pb. In general, evolutia tinde sa se coreleze cu marimea genomului: omul are genomul mai mare decat al insectelor, insectele au genom mai mare decat fungii s.a.m.d.; aceasta corelatie nu este, insa, universala; de exemplu, unii amfibieni au genomul aproape de 50 ori mai mare decat al omului, iar pestii cartilaginosi, in general, au genom mai mare decat pestii ososi.

La plantele cu flori, marimea genomului este foarte variabila, de la cele mai mici, ca Arabidopsis thaliana (7 x 10⁷ pb), pana la cele mai mari ca Fritillaria assyriaca, 1 x 10¹¹ pb (Fig. 7). Orezul, porumbul si graul se situeaza intre aceste valori, avand 5 x 10⁸ pb, 6,6 x 10⁹ pb si 1,6 x 10¹⁰ pb, respectiv.

Fig. 7. Valorile C (per genom haploid, in perechi de baze).

Lipsa unei corespondente directe intre marimea genomului si complexitatea organismului sau pozitia in scara evolutiva se numeste paradoxul valorii C. Privind in ansamblu evolutia generala a speciilor, nu exista o explicatie a paradoxului valorii C; la plante, cel putin, explicatia ar putea fi data de poliploidie si prezenta ADN-ului repetitiv. Cu toata diferenta uriasa in dimensiunile genomurilor, functiile de baza la Arabidopsis si Frittilaria sunt similare si, de altfel, aceleasi universal prezente in regnul vegetal. Arabidopsis poate fi un exemplu extrem avand un genom atat de mic, dar acest fapt a reprezentat unul dintre motivele pentru care aceasta planta a devenit un model de studiu, similar cu modelele animale Caenorhabditis elegans sau Drosophila melanogaster.

Intronii si secventele flancatoare ale genelor (care fac parte integranta din gene, dar nu codifica), contribuie si ele la crearea de diferente in marimea genoamelor. Secventa flancatoare de la capatul 5'al genei contine, de obicei, secvente reglatoare ale transcriptiei genice, iar secventa flancatoare de la capatul 3' contine secvente pentru modificarea ARNm, codonul STOP si secvente reglatoare aditionale (Fig. 8). Delimitarea "sfarsitului" regiunii 3' a unei gene de "inceputul" regiunii 5' a genei urmatoare nu este intotdeauna simpla; intre doua gene exista mult ADN de spatiere, noncodificator, al carui rol functional este inca studiat.

Fig. 8. Structura unei gene eucariote.

Genomurile nucleare contin atat secvente in copii unice, cat si ADN repetitiv. ADN in copie unica (single copy) inseamna orice secventa de ADN prezenta o singura data per genom haploid.

La Arabidopsis, analiza genomului a estimat un numar de aproximativ 15.000 de gene, considerat a fi un numar minim pentru o planta cu flori. Daca apreciem ca regiunea codificatoare (exonii) ar avea in medie 1.300 pb, inseamna ca 15.000 de gene ar necesita o lungime de cca. 2 x 10⁷ ADN in copie unica necesar pentru sinteza produsilor genici. Restul pana la 7 x 10⁷ pb, marimea genomului la Arabidopsis, este reprezentat de introni, secvente flancatoare si ADN repetitiv. Pe de alta parte, la porumb, la care valoarea C este de 6,6 x 10⁹, calcule similare sugereaza ca mai putin de 1% din genom este codificator. La tutun (Nicotiana tabacum, C = 1,7 x 10⁹ pb), numai 2% din genom este transcris in ARNm; pe de alta parte, analize biochimice au aratat ca aproximativ 4% din genom consta din ADN in copie unica. Aceasta discrepanta intre ADN-ul transcris in ARNm si proportia secventelor de ADN in copie unica s-ar explica prin faptul ca genomul de tutun contine multe secvente unice care nu sunt transcrise.

In afara secventelor unice, in genomul nuclear exista, de asemenea, mult ADN repetitiv, care consta din grupe sau familii de secvente de ADN similare, dar nu identice. Succesiunea secventelor intr-o unitate de repetitie, ca si lungimea repetitiilor variaza intre familiile repetitive la o specie data, variind de la 1.000 la 40.000 de familii de secvente repetitive. In functie de raspandirea repetitiilor in genom, ADN-ul repetitiv poate fi subdivizat in doua clase:

repetitii in tandem: repetari adiacente ale unor secvente de doua sau mai multe nucleotide. Mare parte din ADN-ul repetitiv cade in aceasta clasa, care include secventele asociate cu principalele caracteristici morfologice ale cromozomului (centromerul, telomerii, knobii) (Fig.9). Pot fi:

minisateliti: repetitiile unor secvente de 10-60 nucleotide;

microsateliti sau secvente scurte in tandem: repetitii ale unor secvente mai scurte de 10 pb (in general de 1-5 pb);

repetitii dispersate: repetitii compuse din secvente cu diferite grade de divergenta, dispersate in tot genomul, incluzand:

repetitiile de secventa simple (SSR - simple sequence repeat);

elementele transpozabile;

retrotranspozonii.

Fig. 9. Structura unui cromozom eucariot metafazic ipotetic.

Microsatelitii sunt o clasa de secvente repetitive de ADN dispersate in intreg genomul la eucariote, ce consta din motive scurte (1-5 pb), repetate in tandem. Importanta lor consta in faptul ca nu ca sunt numai foarte abundenti in genom, dar sunt si inalt polimorfici, adica difera foarte mult in numarul de repetitii la diferiti indivizi sau chiar la acelasi locus sau individ. Microsatelitii, in general, sunt mai putin frecventi la plante decat la animale; comparativ, la plante o repetitie dinucleotidica mai lunga de 20 pb se gaseste la fiecare 33 kb, in timp ce la mamifere se gaseste la fiecare 6 kb. In timp ce la om microsatelitul (CA)_n este foarte frecvent si comun, la plante exista o diversitate de microsateliti frecvent intalniti, ceea ce denota modalitati diferite de organizare a genoamelor si, posibil, mecanisme diferite de mentinere a microsatelitilor la plante si animale. Prin hibridare intre o secventa microsatelit sintetica si ADN genomic s-a demonstrat ca, uneori, un microsatelit este specific unei singure varietati sau chiar un singur individ. Datorita abundentei lor in genom si eficientei conferite in detectarea indivizilor, varietatilor si speciilor, microsatelitii ADN sunt un instrument in detectarea variatiei ADN la plante, animale si om.

Distributia si organizarea microsatelitilor pe cromozomi intregi s-a studiat prin metoda hibridarii in situ. Aceste studii au aratat ca microsatelitii sunt amplificati in regiuni specifice ale genomului si sunt incorporati in structuri inalt repetitive cu rol potential in organizarea si evolutia genomului. La pesti si primate, aglomerarile de microsateliti sunt prezente in heterocromatina regiunii organizator nucleolar (NOR) si in benzile R . La orz si alte specii din tribul Triticeae, hibridarea in situ a motivului (GAA)_n a evidentiat un model de distributie cromozomiala strans corelat cu heterocromatina din benzile N . La sfecla, fiecare din cei 7 microsateliti analizati are o distributie genomica diferita si o dispersie dependenta de unitatea de repetare cu amplificare situs-specifica pe unul din cele 7 perechi de centromeri sau in regiuni cromozomiale intercalare. Similar, la naut, distributia si intensitatea semnalelor de hibridare variaza, depinzand de motivul microsatelitului folosit ca sonda moleculara pentru hibridarea in situ. Alti zece microsateliti au fost studiati la grau, secara si alte triticale; toti au manifestat distributie dispersata pe toti cromozomii. Microsatelitii (AG)₁₂, (CAT)₅, (AAG)₅, (GCC)₅ si, mai ales, (GACA)₄ au hibridat puternic cu siturile pericentromerice si cu situri intercalare multiple de pe cromozomii genomului B si de pe cromozomul 4 de grau, reprezentand modele ce seamana cu modelul bandarii N. La secara, sonda microsatelitica (GACA)₄ a hibridat puternic in situri intercalare care nu corespund niciunui model de bandare, dar care au permis identificarea bratelor cromozomiale din genomul R . La grau si secara, semnalele de hibridare s-au gasit in pozitii cromozomiale inrudite, manifestand modele similare de distributie, ceea ce indica un rol special al microsatelitilor in organizarea cromozomica, ca o componenta genomica posibil foarte veche in tribul Triticeae.

Unul din rolurile importante al ADN repetitiv este acela de a defini caracterul si functia structurilor specializate ale cromozomului. Repetitiile in tandem se mai numesc si ADN satelit. Prima data, ADN satelit a fost observat ca o banda separata in gradient de densitate in clorura de cesiu, datorita diferentei in compozitia de baze intre acesta si banda majoritara de ADN genomic. Din acest motiv a fost numit la vremea respectiva satelit al ADN-ului genomic. La drojdii si animale, ADN-ul satelit este bogat in AT, pe cand la plante tinde sa fie bogat in GC. ADN satelit este asezat predominant la centromer, telomeri, de obicei in regiunile heterocromatice, ramanand condensat si inactiv pe parcursul ciclului celular. Aceasta ar putea reprezenta inca o explicatie a faptului ca la plante nu pot fi observate benzi G , ca la animale. Se stie ca la plante, spre deosebire de mamifere si om, nu exista modele de bandare G, ci numai modele de bandare C si T si acestea nu intotdeauna perfect reproductibile ca marime. O prima posibila explicatie, citologica, a acestei diferente, a fost aceea ca la animale cromozomul metafazic este mult mai condensat, decat la plante, permitand vizualizarea benzilor G intunecate. A doua explicatie, moleculara, a fost data dupa descifrarea secventei genomice la om, diferite animale si diferite plante; la om de exemplu, benzile G intunecate din cromozomii metafazici coincid cu regiunile sarace in GC, pe cand la plante modelul de bandare C reprezinta de fapt ADN-ul satelit de la centromer, modelul de bandare T ADN-ul satelit din regiunile telomerice, aceste regiuni fiind bogate in GC.

Centromerul este regiunea cromozomului la nivelul careia se ataseaza fibrele fusului de diviziune in scopul separarii cromatidelor in mitoza si meioza. Centromerul contine unitati repetitive scurte in tandem, care se pot repeta de milioane de ori. Acest mod de organizare pare sa fie esential pentru recunoasterea centromerului de catre aparatul fusului, deoarece mutatiile produse la drojdii in regiunea centromerica perturba functia centromerului. Desi organizarea si aranjamentul ADN-ului repetitiv la centromer sunt inalt conservate (la nivelul aceluiasi cromozom), intre specii, chiar si inrudite, compozitia secventei repetitive centromerice este foarte variabila (Fig.)

Telomerul este structura care descrie capetele cromozomului, avand rolul de a impiedica pierderea de secvente de ADN la fiecare runda de diviziune. Telomerii, ca si centromerii, sunt esentiali pentru replicarea corecta a genomului. De asemenea, telomerii au rol in mentinerea capetelor "nelipicioase" ale cromozomilor; s-a observat citogenetic ca, daca prin rupere raman capete libere ale cromozomilor rupti, acestea devin "lipicioase" si se unesc cu alte fragmente de ADN, aparand astfel aberatiile cromozomiale. In sfarsit un alt rol al telomerilor este in organizarea si pozitionarea cromozomilor in nucleul interfazic, deoarece prin intermediul lor cromozomii se ataseaza la suprafata interna a membranei nucleare. Telomerii, ca si centromerii, contin secvente repetitive, dar spre deosebire de acestia, secventele sunt inalt conservate la eucariote, atat ca secventa cat si ca aranjament (Fig. 10). De exemplu, la om si tripanosome (protozoare flagelate), telomerii au aceeasi secventa TTAGGG, repetata de mii de ori. La Arabidopsis, secventa telomerica repetiva difera doar cu o baza: TTTAGGG.

Fig. 10. Secventele telomerice sunt conservate in lumea vie.

La capatul cromozomului, dupa cateva mii de copii ale secventei telomerice se gaseste o regiune de ADN monocatenar compusa numai din doua sau trei copii ale aceleiasi secvente. La eucariote exista o enzima specializata, telomeraza, care mentine acest ADN monocatenar in forma de bucla, pentru a nu exista capete libere ale cromozomului, vulnerabile la atacul enzimelor si la pierderea de nucleotide in timpul diviziunii (Fig. 11). Telomeraza este un tip de reverstranscriptaza care are un segment de ARN integrat in structura sa tridimensionala. ARN-ul functioneaza ca matrita pentru noua secventa telomerica de ADN.

Fig. 11. Elongarea telomerelor. Telomeraza recunoaste capatul liber 3' al telomerului (catena leading) si realizeaza hibridizarea acestuia cu subunitatea sa ARN; folosind aceasta subunitate drept matrita, telomerul este alungit, dupa care telomeraza se transloca la capatul segmentului nou sintetizat si procesul se reia. Catena lagging este elongata sub actiunea primazei si ADN polimerazei, similar sintezei fragmentelor Okazaki.

Secventele repetitive dispersate reprezinta o componenta importanta a genomului. Aceste secvente difera de ADN repetitiv tandemic, descris mai inainte, prin dispozitia mai degraba dispersata a copiilor, in tot genomul, decat adiacenta una fata de cealalta. Multe secvente dispersate sunt de fapt elemente transpozabile. La unele plante, elementele transpozabile reprezinta cea mai abundenta clasa de secvente repetitive dispersate. De exemplu, mai mult de o duzina de elemente repetitive dispersate derivate din transpozonii inactivi ocupa regiunile din jurul genei Adh1 (alcool dehidrogenaza 1) de la proumb.

Familiile multigenice mari, conservate evolutiv, sunt asezate grupat in interiorul genomului. Exista o clasa de ADN mediu repetitiv care este reprezentata de secvente codificatoare, familii genice in care genele sunt asezate in copii numeroase in clustere sau in tandem. In interiorul acestor familii fiecare gena este reglata separat. In general, genele prezente in numeroase copii per genom haploid codifica pentru produsi de care celula are nevoie in cantitati mari, precum ribulozo-1,5-bifosfat carboxilaza/oxigenaza (Rubisco).

Ca si la animale si om, la plante, genele ribozomale, una din cele mai mari familii ale secventelor repetitive la eucariote, sunt repetate de mii de ori intr-o regiune a genomului numita regiunea organizator nucleolar (Fig.12). ADN-ul ribozomal (ARNr) este necesar in cantitati atat de mari in celula pentru construirea ribozomilor; un numai mai mic de copii de ADNr nu ar fi suficiente pentru cantitatea de transcripti (ARNr) de care celula are nevoie. Copiile multiple ale genelor pentru ARNr sunt asezate in clustere raspandite in tot genomul. Regiunea organizator nucleolara (NOR) probabil faciliteaza procesarea rapida a ARNr, ca si asamblarea ribozomilor.

Fig. 12. La plante, ADNr este organizat in unitati repetitive de 7.800-185.000 bp, constand din genele ARNr 18S, 5,8S, 28S inalt conservate, separate de secvente spacer scurte (SNT - spacer netranscris; SET - spacer extern transcris; SIT - spacer intern transcris). Genele ARNr 5S sunt localizate in alte regiuni ale genomului.

Histonele, componenta proteica majora a cromatinei, sunt, de asemenea, produsi genici necesari in cantitate mare in celula. Genele celor 5 histone (H2A, H2B, H3 , H4, H1) sunt dispuse intr-un cluster, iar clusterul intreg este repetat de 10 pana la 600 de ori. Regiunile de codificare ale genelor histonice sunt inalt conservate, chiar si intre specii diferite, dar organizarea lor in interiorul clusterului variaza (Fig. 13).

Fig. 13. Organizarea in cluster a genelor pentru histone, in genomul animal.

Alte familii genice contin intre 20-25 copii. Desi aceste gene ar putea fi linkate, ele nu se repeta in tandem. Un exemplu este familia zeinei la porumb, care codifica proteine depozitate in seminte. Aceasta familie contine 2 subseturi de gene, fiecare cu aproximativ 25 membri. Omologia regiunii codificatoare intre diferitele gene ale fiecarui grup este foarte mare (peste 90% identitate in secventa de aminoacizi a proteinei), insa omologia intre cele doua grupe este mai mica (Fig. 14).

Fig. 14. Genele pentru zeina la porumb. Genele sunt localizate pe cromozomul 7, dar nu sunt organizate ca repetitii in tandem sau unitati transcriptionale. Zeinele sunt proteine de depozitare din seminte si sunt sintetizate in cantitati mari.

Chiar si genele in copie unica manifesta organizare si aranjament conservate evolutiv intre speciile inrudite, dupa cum s-a observat in urma realizarii proiectelor de cartare genica. S-a dovedit ca segmente mari de cromozomi sunt adesea conservate intre specii inrudite (fig. 15). De exemplu, porumbul si sorgul contin multe din aceleasi gene si aceleasi grupe de linkage situate in aceiasi loci. Aceasta colinearitate este numita sintenie. Speciile din familia Solanaceae contin, de asemenea, sectiuni conservate in genoame: genoamele tomatelor si cartofului sunt foarte similare, fiind conservata si organizarea multor grupe de linkage. Orzul si graul, de asemenea, manifesta similaritate in organizarea genelor in interiorul genoamelor lor.

Fig. 15. Organizarea comuna a unor gene la sorg si porumb, in pozitii similare in genom. Compararea hartilor genetice ale cromozomilor 1 si 2 de porumb cu hartile unor grupe de linkage de la sorg arata organizari similare in privinta pozitiei relative a genelor.

La plante, ca si la alte eucariote, pot fi realizate atat harti genetice, pe baza analizei recombinarii genetice (si deci a distantei genetice relative), precum si harti fizice prin care se masoara distanta intre gene in numar de perechi de baze. Hartile fizice de mare rezolutie folosesc fragmente clonate de ADN pentru a realiza harti de contiguri (fragmente de ADN suprapuse partial deci cu continuitate exacta de secventa), care se distribuie pe distante lungi (fig. 15). O regiune de ADN este definita un contig deoarece este constituita din secvente clonate mai mici, asezate in contig intr-o ordine exacta de secventa. In acest mod, se poate estima distanta fizica in perechi de baze intre doua puncte de referinta. Dificultatea cea mai mare pentru crearea unei harti fizice este asamblarea corecta tuturor clonelor, adica reconstituirea suprapunerii partiale a fragmentelor clonate in ordine corecta. Strategia folosita in descifrarea genomului la Arabidopsis a fost de a genera seturi de clone cu suprapunere partiala, lungi de la 10 la 25 kb. ADN-ul a fost clivat in fragmente distincte electroforetic cu enzima de restrictie HindIII; cu ajutorul analizei computerizate, fragmentele clonate au fost aliniate conform identitatii de secventa la capetele clonelor si, deci, suprapunerii partiale (Fig. 16).

Fig. 16. Harta de contiguri, constand dintr-un set de fragmente contigue suprapuse de ADN, care acopera intreaga lungime a cromozomului.

O alta strategie de cartare foloseste un vector eucariotic derivat de la drojdii, cromozomul artificial de drojdii (yeast artificial chromosome, YAC). YAC-urile contin structurile necesare pentru replicare in celulele de drojdii: cel putin o origine de replicare, telomere, un centromer si un marker de selectie (Fig. 17). Intr-un YAC poate fi continuta o secventa de cel mult 1000 kb (1 Mb), dar cele mai utilizate sunt YAC-urile care contin secvente de 100-300 kb. Astfel un cromozom intreg, ca grup de linkage, poate fi acoperit in totalitate de fragmente de ADN clonate in YAC-uri care se suprapun partial (Fig 18). Strategii similare pentru clonarea fragmentelor mari de ADN folosesc cromozomul artificial bacterian (bacterial artificial chromosome, BAC). Acestea sunt in prezent tehnici de rutina in cartarea si secventierea genomurilor eucariote.

Fig. 17. Cromozom artificial de drojdie (YAC): contine ADN plasmidial bacterian ce faciliteaza introducerea insertului ADN (marime maxima 1 Mb) si secvente de ADN cromozomal de drojdie ce ii confera stabilitate si replicabilitate in celula-gazda. CEN - centromer, ARS - originea de replicare, TEL - telomere, TRP1, URA3 - gene marker metabolice.

Fig. 18. Clone YAC ale regiunii A1-Sh2 din genomul de porumb: hartile de restrictie a patru clone ale genelor adiacente A1 si Sh2, aliniate. Clonele YAC suprapuse pot fi folosite pentru a construi harti fizice pentru gene intregi, aliniind situsurile de restrictie intre clone. TRP1 si URA3 sunt markeri de selectie ai vectorilor YAC.

Clonarea genelor sau a fragmentelor de ADN este de multa vreme o metoda de rutina. Tehnic, cuvantul "clonare" inseamna a face copii identice multiple pornind de la un singur exemplar. In sensul tehnologiei ADN-ului recombinant, clonarea este un proces multistep (Fig. ):

Mai intai, se construieste o molecula de ADN recombinat intr-un vector plasmid ADN bacterian. Moleculele de ADN plasmidial au fost modificate in prealabil, astfel incat sa includa gene markeri de selectie, ca de exemplu, o gena care codifica pentru o enzima care inactiveaza un antibiotic, conferind bacteriei-gazda rezistenta la antibioticul respectiv. In aceasta etapa, ADN-ul dintr-un organism este izolat, ori direct din genom, ori ca ADN complementar (ADNc), pe baza ARNm, folosind reverstranscriptia. ADN-ul este apoi clivat cu o endonucleaza de restrictie; aceeasi endonucleaza este folosita    si pentru a taia ADN plasmidial bacterian (Fig.), creandu-se astfel capete complementare care permit apoi ligarea fragmentului de ADN genomic la plasmida, cu ajutorul enzimelor de tipul ligazei T4.

Transformarea unei tulpini bacteriene cu plasmida recombinata. Bacteria gazda (de obicei o tulpina specializata de E.coli) este tratata chimic cu solutie de CaCl₂ pentru a permeabiliza peretele si membrana bacteriana si pentru a le face mai receptive la patrunderea ADN-ului strain. Bacteriile sunt incubate apoi cu o solutie diluata care contine plasmide recombinate, supuse, de obicei, unui soc termic si inoculate pe mediu selectiv agarizat.

Screeningul bacteriilor transformate. Vectorii plasmidiali care au incluse gene pentru rezistenta la antibiotice sunt disponibili comercial; deci pe un mediu cu antibiotic pot creste numai bacteriile transformate, care contin acel plasmid cu gena de rezistenta. Alternativ, multe plasmide sunt construite cu gene care dau culoare coloniilor, iar inserarea ADN-ul strain inactiveaza aceste gene. In consecinta, coloniile fara culoare contin plasmidele care poarta ADN-ul clonat.

Selectarea coloniilor transformate pentru amplificare prin metode moleculare. Coloniile care cresc pe mediul cu antibiotic sunt duplicate o noua placa, in aceeasi pozitie, prin metoda replica plating si apoi transferate pe inca o placa de mediu. Dupa cresterea coloniei, pe noua placa de mediu, colonia este trecuta pe o membrana de nitrocelulaza (prin replica plating). Membrana este tratata cu o solutie de liza celulara, eliberand ADN-ul, care este apoi denaturat si supus hibridarii cu o sonda de ADN marcat, omolog cu gena de interes. Prin autoradiografie se determina exact care colonie a hibridizat cu sonda, deci care colonie contine ADN-ul de interes; respectiva coloniei poate fi selectata si amplificata.

Ce inseamna o banca de gene? Pe zi ce trece este din ce in ce mai usor de a gasi secventa unei gene intr-o banca de gene. Odata ce o gena este localizata, clonata si secventiata, aceasta este data publicitatii prin jurnalele de specialitate si apoi in bancile de gene - de exemplu, GenBank - in format electronic. Succesiunea de nucleotide a unei gene este exprimata ca ARNm al genei respective, numita si succesiunea de EST-uri (expressed sequence tags). Astfel de secvente sunt disponibile online pentru unele specii, si zilnic se adauga noi EST-uri in bancile de gene. Arabidopsis este specia cu genomul secventiat in cea mai mare parte, dintre toate plantele iar pe locurile doi si trei sunt orezul si porumbul, respectiv.

De ce este nevoie sa avem acces la aceste secvente? In primul rand, un cercetator care a clonat si secventiat o gena poate sa-i compare secventa cu cea a numeroaselor gene inrudite de la alte organisme. De exemplu, cercetatorii interesati in filogenie si evolutie moleculara, acceseaza aceste date pentru a crea arbori evolutivi. De asemenea, o secventa identificata poate fi utila si din punct de vedere biochimic (de exemplu, un potential element reglator), adica se poate estima gradul de similitudine al secventei elementului reglator la doua sau mai multe gene diferite. In al doilea rand, disponibilitatea clonelor secventiate este atat de mare incat cercetatorii se pot contacta direct,"clone by phone". The Arabidopsis Biological Resource Center distribuie liber de taxe clone si EST-uri, care pot fi folosite direct in experiente, sau incluse intr-o hibridare heterologa (intre specii diferite) pentru a identifica gene comparabile la alte specii. De exemplu, informatii despre GenBank pentru Arabidopsis sunt gasite la adresa www.tigr.org.

Elemente transpozabile

Secventele mobile de ADN sau elementele transpozabile la plante reprezinta cantitativ o buna parte din genom si in acelasi timp au un rol activ foarte important. Denumirea provine de la faptul ca aceste secvente se misca sau transpozeaza, dintr-un loc in altul, in genom. Aceste elemente genetice mobile, odata cu miscarea lor duc si informatie genetica, ceea ce le confera un loc important in organizarea genomului. Organizarea acestor elemente si modul de transpozitie sunt aseamanatoare la specii diferite precum Drosophila, drojdii sau porumb. Exista doua tipuri de elemente transpozabile. Primul tip a fost descris de Barbara McClintock in anii 1940. Aceste elemente contin gene pentru transpozitie - codifica pentru transpozaza, enzima ce mediaza deplasarea elementului mobil in genom - si doua secvente lungi de aproximativ 10 pb, invers repetate care flancheaza secventa de codificare la ambele capete. Aceste secvente repetate invers sunt recunoscute de transpozaza, care se leaga la ele, dupa care excizeaza secventa elementului transpozabil, eliberand-o pentru integrare in alt loc in genom (Fig. 19).

Fig. 19. Transpozonii si transpozitia. Elementele transpozabile sunt flancate de secvente repetitive inversate scurte, recunoscute de catre transpozaza, care creaza o structura stem/loop si apoi o excizeaza; intr-o etapa urmatoare, structura excizata poate fi inserata la o noua locatie in genom.

Al doilea tip de elemente transpozabile este reprezentat de retrotranspozoni, care sunt aproape intotdeauna de origine virala. Structura retrotranspozonilor seamana cu forma integrata a virusurilor tumorale ARN, iar transpozitia se face prin intermediul ARN. (Fig. 20). Una din proteinele codificate de retrotranspozoni este reverstranscriptaza, necesara pentru a sintetiza un ADNc, pe baza unei matrite ARN. Elementele Ty de la drojdii si copia de la Drosophila sunt retrotranspozoni.

Fig. 20. Transpozitia retrotranspozonilor. Elementul transpozabil este copiat prin intermediar ARN, rezultand un ADNc care este duplicat si apoi inserat la noua locatie.

La plante se stie acum, ca mare parte din ADNul repetitiv, reprezinta de fapt elemente transpozabile active sau inactive. Cea care a avansat prima data ideea existentei elementelor transpozabile a fost cercetatoarea Barbara McClintock. Ea a intuit existenta lor, explicand prin aceasta unele consecinte genetice ale ruperii cromozomilor. Ipoteza ei nu a fost acceptata decat dupa 10 ani, cand s-au descoperit elemente mobile la bacterii; in 1983, McClintock a primit premiul Nobel pentru descoperirea sa. Dupa cum am mai aratat in acest capitol, B. McClintock a ales niste markeri genetici si citogenetici localizati pe bratul scurt al cromozomului 9 la porumb (Fig. 4). Apoi, a produs si selectat o ruptura cromozomiala pe bratul scurt, in meioza. Capetele rupte ale cromozomului devin "lipicioase" si tind sa se uneasca unele cu altele. De aceea, in timpul sinapsei si crossing-overului in meioza au aparut doi cromozomi anormali: unul cu doi centromeri si altul fara niciunul. Cromozomul acentric se pierde, deoarece in anafaza nu se poate atasa de fibrele fusului de diviziune si deplasa spre poli. Cromozomul cu doi centromeri, in anafaza se rupe, deoarece fiecare centromer se poate orienta spre unul din polii fusului, dar cromatidele surori fuzioneaza din nou in telofaza. Barbara McClintock a numit acest ciclu modelul rupere-fuziune-rupere (Fig. 21). Experientele sale au constat in a genera deletii in anumite gene luate ca markeri genetici de-alungul cromozomului. Genele luate in studiu: C (pentru culoarea purpurie a bobului), sh (endosperm sbarcit) si wx (endosperm cerat) sunt asezate intre cei doi centromeri. Deletiile au afectat caracterul cel mai aproape de primul centromer, deci boabele si-au pierdut culoarea (c-necolorat, C-purpuriu). Cercetatoarea a lucrat cu o linie de porumb la care de obicei ruperea se producea intre wx si centromer, in timpul ciclului rupere-fuziune-rupere, ducand la pierderea celor 3 caractere luate in studiu. McClintock a asimilat aceasta secventa sensibila la rupere unui marker genetic pe care l-a denumit disociator Ds. S-a demonstrat apoi ca, intr-adevar, pozitia acestui marker nu era stabila. In anumite linii de porumb, Ds pare sa se mute din locul sau intre centromer si wx, in interiorul genei C; avand drept consecinta perturbarea functia genei C, rezultand boabe necolorate. In alte cazuri, mai putine, Ds se muta din nou din C in afara sa, in timpul dezvoltarii bobului rezultand astfel boabe colorate pestrit: pe boabele necolorate apar sectoare colorate in urma parasirii locusului C de catre elementul Ds si reluarea activitatii genei C in acele sectoare. Deoarece numai unele plante au fost instabile cu privire la pozitia lui Ds, McClintock a tras concluzia ca, pentru transpozitia lui Ds, acele linii de plante trebuie sa contina atat activatorul Ac cat si disociatorul Ds (Fig. 22).

Fig. 21. Modelul rupere-fuziune-punte.

1. Nucleul zigotului.
2. Prima anafaza mitotica.
3. Prima telofaza mitotica.
4. Fuziunea capetelor rupte in fiecare nucleu telofazic.
5. A doua metafaza mitotica.
6. A doua anafaza mitotica.

Fiecare gamet contribuie cu cate un cromozom care a suferit o ruptura in anafaza diviziunii de dinaintea formarii gametilor; in consecinta, zigotul va contine 2 cromozomi anormali, fiecare avand cromatidele surori fuzionate la pozitia ruperii anterioare (1). In prima anafaza a diviziunii zigotului (2), cei doi cromozomi formeaza configuratii "punte", cu cei doi centromeri orientati spre cei doi poli diferiti ai fusului de diviziune, ceea ce duce la ruperea puntii. La sfarsitul telofazei (3), fiecare nucleu va contine doi cromozomi cu cate un capat proaspat rupt (sageti); aceste capete vor fuziona, formand cromozomi dicentrici (4). In urmatoarea metafaza (5) se pot forma mai multe tipuri de configuratii, dintre care doar doua sunt aratate (6). In configuratia 6B se observa punti care se vor rupe in anafaza, reluand pasii 3-6.

Fig. 22. Porumbul variegat si efectele transpozitiei asupra culorii boabelor. A. Gena C codifica o enzima care catalizeaza formarea pigmentului din boabele de porumb; cand e activa, boabele sunt purpurii. B. Ac codifica o transpozaza care mediaza transpozitia elementului Ds; atunci cand Ds se insera in gena C o inactiveaza, rezultand fenotipul mutant c. C. Daca Ds este transpozata din gena C (sub actiunea transpozazei codificata de Ac) in timpul dezvoltarii, activitatea normala a acesteia revine, iar boabele prezinta sectoare purpurii si sectoare necolorate.

Analiza genetica facuta de B. McClintock si studiile moleculare urmatoare, au aratat ca sistemul de elemente transpozabile Ac/Ds este un set de structuri complexe care consta din doua tipuri de elemente: elementul autonom (Ac) si elementul neautonom (Ds). Elementul activator este autonom (Ac) deoarece codifica toti produsii necesari pentru transpozitie. Ac are o lungime de 4,6 kb. Regiunea centrala a elementului codifica un transcript de 3,5 kb ce face parte din transpozaza care excizeaza atat Ac, cat si toti membrii familiei Ds. Repetitiile inversate de 11 pb de la fiecare capat al elementului functioneaza pentru recunoasterea transpozazei. In plus, cand elementul se insereaza intr-o noua pozitie in genom, o pereche de 8 pb in repetitii directe sunt generate la locul insertiei in genomul gazda si reprezinta alte secvente flancatoare ale elementului. Aceste repetitii directe raman in genom, chiar dupa transcriptia urmatoare a elementului transpozabil si, de aceea, se mai numesc si amprente sau urme ale evenimentului de transpozitie gasite in genomul-gazda.

Elementul Ds apartine unei familii de elemente inrudite recunoscute de transpozaza codificata de Ac. Elementele Ds sunt neuatonome deoarece nu codifica propria lor transpozaza. Mai degraba, transpozitia lui Ds depinde de prezenta lui Ac si a produsilor sai genici. Elementele Ds se impart in 3 clase structurale diferite : Ds, Ds2 si Ds1. Ds deriva din "deletii simple ale lui Ac". Elementele Ds2 contin foarte putine secvente Ac, iar secventa lor interna este complet neinrudita cu Ac. Elementele Ds1 sunt omoloage cu Ac numai in privinta repetitiilor lor terminale, care contin secvente recunoscute de transpozaza Ac. Au fost caracterizati pana acum 20 membri ai familiei de elemente Ds.

Elementele transpozabile de la gura leului (Anthirinum mayus) sunt, de asemenea, la fel de bine caracterizate ca si cele de la porumb. Elementele Tam3 de la Antirhinum seamana ca structura cu elementul Ac de la porumb si codifica o transpozaza identica acestuia in proportie de 60%. Alte seturi de elemente transpozabile similare la porumb si gura leului includ familia supresor/mutator la porumb (Spm/dSpm) si elementele Tam1, care au repetitii inversate terminal aproape identice: din 13 nucleotide 12 sunt identice. Atat Spm, cat si Tam1, la inserare in genomul gazda genereaza o repetitie directa de 3 pb, iar exonii ambelor elemente sunt foarte similari. Transpozitia elementelor Tam este foarte dependenta de mediu. Daca plantele sunt inmultite la 15 C in loc de 25 C, frecventa transpozitiei lor este de 1000 ori mai mare.

Spre deosebire de elementele transpozabile, retrotranspozonii sunt aproape sigur de origine virala, dovada fiind mecanismul lor de transpozitie asemanator cu modul in care un retrovirus se integreaza in genomul gazda. Un exemplu de retrotranspozon la porumb, elementul Mu (mutator) se misca atat de frecvent in genom, incat un genom care il contine, produce descendenti mutanti cu o rata de 5 ori mai mare decat alt genom identic, dar care nu contine elementul Mu.

Au fost identificate pana acum cel putin 8 elemente Mu, care au o secventa interna putin diferita; in schimb la momentul insertiei, toate elementele Mu genereaza o repetitie directa de 9 pb in genomul gazda. Primul element Mu a fost caracterizat la sfarsitul anilor 1970.

Concluzii

Toate caracteristicile unui organism sunt codificate in ADN-ul sau. La eucariote informatia este depozitata in miile de gene organizate sub forma de cromozomi in nucleu. La plante alte gene, mult mai putine se gasesc in ADN-ul mitocondrial si plastidial. Studiul organizarii si reglarii genomului nuclear se afla la baza cercetarilor de genetica clasica si moleculara. Parintele geneticii este G. Mendel, care a demonstrat ca trasaturile unui organism sunt determinate de factori ereditari (astazi numiti gene) . El a facut pentru prima data legatura intre fenotip si genotip. Aproximativ 50 de ani mai tarziu s-a demonstrat ca genele se gasesc pe cromozomi, iar dupa alti 50 de ani s-a descoperit ca ADN-ul este molecula constituenta a cromozomilor si responsabila pentru transmiterea informatiei ereditare. Scoala lui Morgan a descoperit ca genele sunt dispuse linear pe cromozomi, se transmit in bloc (linkat) si, mai mult, ca recombinarea genetica intre grupele de linkage are rol in aparitia de noi combinatii fenotipice. Prin analiza recombinarii genetice se alcatuiesc harti genetice si se stabilesc pozitiile relative ale genelor in cromozomi.

Rolul genei este de a codifica produsul proteic care contribuie la un anume fenotip. Genele care codifica proteine reprezinta insa un mic procent intregul genom. Secventele care flancheaza gena, dar care nu codifica fac parte dintr-o gena tipica si creaza diferente de marime a genomului intre organisme similare. Intronii, secvente necodificatoare, de asemenea fac parte din gene. In plus, secventele de ADN repetitiv din genom determina structura si functiile specializate ale unor segmente ale cromozomului, cum sunt centromerul si telomerii. Alta clasa specializata de secvente ADN, care reprezinta o fractie semnificativa din genom, sunt elementele transpozabile. Aceste elemente se deplaseaza, transpozeaza dintr-un loc in altul in genom si odata cu aceasta transpozeaza si informatia ce o poarta.