SINTEZA PROTEICA

Sinteza proteica este mecanismul prin care o molecula ARNm se cupleaza cu ribozomul => ARNt – amminoacid specific se cupleaza la ribozom => lant peptidic prin legarea succesiva a aa

Directia de formare a lantului peptidic : Molecula ARNm se translateaza de la capatul 5’ catre capatul 3’, iar formarea lantului se face de la amino terminal catre extemitaeta carboxil = extremitatea de elongatie prin realizarea unei legaturi peptidice.

Ribozomul

este unitatea de sinteza proteica.

A fost descrisa de Palade

are dimensiune ade 150-200Ả

sunt alcatuiti din 2 subunitati inegale: S (small), L (large)

legatura intre ei este stabilizata de ioni Mg²⁺

subunitatile sunt formate din ARNr si proteina (60%)

Subunitatea L are o constanta de sedimentare de 50 S ( Svedberg)

este formata din 2 tipuri de ARNr → cu constanta de 28 S

→ cu constanta de 5 S

In structura, partea proteica este reprezentata de 30 tipuri proteice

Subunitatea S (small) are o constanta de sedimentare de 30 S

este formata dintr-un singur tip de ARNr cu o constanta de 18 S

In structura aree 20 tipuri proteine

Fiecare ribozom va explora o molecula ARNm

la majoritatea procariotelor si eucariotelor unitatea de translatie nu se rezuma la un singur ribozom care exploreaza o molecula de ARN m ci se formeaza unitati de translatie complexe sub diferite forme: ex. la eucariote, dupa ce ribozomul parcurge 25 aa (respectov 75 nucleotide) codonul de metionina (initiere)AUG este complet eliberat si capabil de a forma un nou complex de initiere cu un alt ribozom. s.a.m.d => in final unitati de translatie care se prezinta ca o molecula de ARNm acoperita la intervale de aprox. 80 nucleotide cu ribozomi si pe de alta parte lantul polipeptidic in diferite stadii de sinteza – poliribozom/polisom ( ex. la procariote - nu au membrana nucleara)

Molecula de ARNm este sintetizata in directia 3’-5’ si are libera extremitatea 5’ si, cum translatia se face 5’-3’, iar molecula e ARNm la procariote nu sufera maturare, atuci inseamna ca este apta de a suferi o translatie imediat astfel incat dupa ce extemitatea 5’ a parcurs cca 50-60 nucleotide, extemitatea este apta de a se cupla cu ribozomul . La randul sau, ribozomul dupa ce parcurge cca 80 nucleotide elibereaza extemitatea 5’ si iarasi se poate initia un proces complex de tanslatie astfel incat in final poliribozomul la procariote poate fi alcatuit dintr-o molecula de ARNm in diferite stadii de elongatie care la randul sau este translocata din loc in loc de ribozomi; deci nu este necesar de a fi completa formula moleculara a ARNm

Se produce astfel un proces de cuplare-transcriptie-tanslatie, iar acest tip de polison la procariote creste cu cresterea distantei de la situsul de transcriptie;

Principiul cuplare-transcriptie-tanslatie reprezinta regula sintezei proteice la procariote.. La procariote ARNm este policistronic, eci se pot forma lamnturi polipeptidice diferite

La eucatiote nu se cupleaza transcriptia cu translatia din 2 motive:

1)     exista membrana nucleara

2)     ARNm sufera procesul de maturare prin excizia exointronica si respectiv este monocistronic

Realizarea translatiei in secventa de aminoacid este facuta de ARNt si aminoacid sintetaza specifica tipului de ARNt.

ARNt este format dintr-o molecula mica, monocatenara care cuprinde intre 73-93 nucleotide, are o extremitate 3’ hidroxil libera si o extremitate 5’ monofosfat. Prezenta in cadrul lantuluii peptidic al ARNt a unor nucleotide complementare (reg. autocompl.) determina aparitia unor scurte portiuni bicatenare intercalate cu monocatenare => aspect de frunza de nufar + 3D semispiralizari segmentare. Dpdv functional ARNt se implica prin 3 regiuni:

1.     Anticodon – la una dintre extremitati ; formata din 3 baze care se pot si se complementeaza cu secventa codon specifica de la nivelul ARNt. Pentru codonii STOP/nonsens – UAG, UGA, UAA nu exista secventa anticodon, deci nici molecule anticodon specifice (acestea pot aparea doar anormal) La 3-hidroxil libera se fixeaza aminoacidul liber prin leg. H, corespunzator anticodonului de la celalalt pol functional al moleculei de ARNt

2.     Aminoacil sintetaza recunoaste specific molecula ATNt si printr-o secventa specifica (reg. de decunoastere) potriveste aminoacidul specific anticodonului specific ARNt la 3’. Denumirea ei se face prin adaugarea numelui aminoacidului la ARNt sintetaza ex. Leu-leucil ARNt sintetaza → ataseaza “LEU “ la ARNtspecific =ARNt-leu. Iar ARNt cu aminoacidul respectiv se numeste ARNt acilat/ARNt incarcat. Daca molecula de ARNt nu are cuplat aminoacidul specific se numeste ARNt neacilat.

SINTEZA POLIPEPTIDICA

Sinteza polipeptidica are 3 stadii:

1.     Stadiul de initiere

2.     Stadiul de elongatie

3.     Stadiul de terminare

Dupa trecerea in citoplasma a ARNt , el se fixeaza pe subunitatea S ribozomala. La ea se cupleaza si unitatea L, stabilizat prin Mg2+ => robozom (S= cap de citire; L= 2 situsuri:

situs aminoacid A

situs peptidic P )

In citoplasma este ARNt acilat. Situsul P este primul situs ocupat de primul aminoacid . Al doilea situs ocupat de al doilea aminoacid este A. La nivelul L se realizeaza peptidica dintre cei doi aminnoacizi prin peptidil transferaza ribozomala intre -NH₃ de la primul aminoacid si -COOH de la al doilea aminoacid

In acest moment, complexul peptidic din lant (se) deplaseaza aminoacilul (aminoacidul) din P, iar aminoacidul 2 din A trece in P. Ribozomul parcurge lantul ARNt, iese primul codon pentru primul aminoacid si intra pentr aminoacidul 3; Situsul A este ocupat de ARNt acilat cu aminoacidul 3, cu anticodonul corespunzator codonului de pe ARNt. O data cu formarea legaturii peptidice se elibereaza molecula ARNt macilat care isi cauta prin aminoacil sintetaza aminoacidul specific.

Ribozomul va pargurge molecula ARNt codon cu codon 5’-3’, iar eliberarea lantului peptidic se face invers, pana cand gaseste pe ARNt un codon “nonsens”/stop si ajunge in stadiul e terminare . Se declanseaza reactii ce determina disocierea ribozomului de lantul peptidic prin intermediul a 2 factori eliberatori R₁ si R₂, iar lantul peptidic este elibrat in citoplasma.

Daca este ARNm procariot, lungimea dintre urmatorul cistrom nu este foarte mare si ribozomul poate ramane cuplat si se face a doua translatie.

La procariote, fiecare molecula ARNm policistronica (si nu sufera maturare), se descrie prezenta unor secvente specifice pentr cuplare cu ribozom. → secventa Shin-Delgano (numai la procariote)

La eucariote exista o molecula ARNm (motrica?) din citoplasma care cupleaza; apoi aluneca unul fata de altul pana gaseste un alt codon AUG (cel mai apropiat de 5’) Sinteza incepe de la .. oricarui codon AUG; la procariote trebuie sa existe Shine-Dalgano.

La procariote secventa de separare intre 2 cistroni pe ARNm poate juca rolul unui sistem de reglaj al sintezei astfel incat s-a constatat existenta unor sisteme de sinteza cu secvente de separare suficient de mare incat sa permita reglarea cantitatii de proteina sintetizata intre polizomi diferiti (specific procariotelor)

O data cu lungimea secventeispatiare, posibilitatea unei noi sinteze si de reglaj scade.

Sinteza proteica este reglata prin mecanisme. Sistemele de reglaj sunt diferite dar se suprapun. Procariotele sunt unicelulare, libere, traiesc si se divid indefinit in mediu si conditii, necesar.; sistemele reglatorii determina o rata de crestere maxima intr-un mediu perticular. Celulele eucariote formeaza structurii tisulare si nu trebuie numai sa creasca si sa se divida + adaptare => modificari structurale si functionale pe care trebuie sa le si mentina pe parcursul vietii. Datorita faptului ca exista intr-un mediu relativ stabil sunt putin modificate de mediu. Scpo = realizare a functiei tisulare specifice => cresterea si diviziunea in majoritatea tipurilor celulare se incetineste/opreste. Celulei ii este necesar un sistem de mentinere in viata si realizare a functiei pentru care s-a diferentiat.

Ca principii ale reglarii, cele mai bine cunoscute mecanisme sunt cele bacteriene: sisteme reglatorii de tip on/off: atata vreme cat este necesar un produs se obtine sinteza ARNm, inhibata cand produsul nu mai este necesar. De principiu, majoritatea sistemelor nu sunt atat de clare ci se mentine un nivel minim de transcriptie (1-2 (momente?) de transcriptie/generatie celulara)=> nivel minim al sintezei determina o nuantare pornit-oprit. Fapt prezent la procariote (trebuie sa se mentina in mediu variabil)) La eucariote, celula poate opri complet transcriptia (mediu constant) → modulare transcriptie – translatie.

La procariote, cand unele enzime actioneaza pe o singura cale metabolica, ori toate ori nici una sunt sintetizate pentru realizarea caii metabolice respective ; Acest lucru se datoreaza faptului ca ARNm procariot este policistronic → reglare coordonata.

La eucariote molecula de ARNm este monocistronica, deci nu apare reglare coordonata

Tipurile de reglare comune sunt cicluriel metabolismului degradativ, cu posibilitatea de a degrada substantele determinate de modalitatea prin care enzimele implicate sunt sintetizate:

nivel de degradare →sinteza enzimelor → control.

In ciclurile sintetice, produsul final este si molecula de reglaj

Mecanismele reglatorii se clasifica in:

reglare negativa

reglare pozitiva

Reglarea negativa - transcrierea este blocata de existenta in celula a unui inhibitor. Un antagonist al inhibitorului (un inductor) este cel care prin cuplarea cu inhibitorul va permite eliberarea si initierea transcriptiei ARNm

Regalarea pozitiva - In celula este prezenta o substanta efector (proteina sau orice alta molecula sau complex de molecule) care are capacitatea de a activa un promotor si de a permite astfel initierea transcrierii ARNm . Nu se descrie existenta unui inhibitor.

Reglarea metabolica a fost studiata pentru prima data la E. Coli: A fost studiata degradarea metabolica a lactozei.

S-a constatat existenta a doua enzime:

- β-galactozidaza –desface lactoza in doua molecule de glucoza si galactoza

- lactozpermeaza –substrat transportor pentru patrunderea lactozei intracelular

Genele care controleaza procesul sunt lac-z pentru β-galactozidaza si lac-y pentru lactozpermeaza.

Cartografierea genelor a aratat ca pe secventa ADN corespunzatoare, cele doua gene sunt alaturate

=> doua fenotipuri : Lac ⁺   - capabil sa foloseasca lactoza ca sursa de C. si energie

Lac - incapabil sa foloseasca lactoza ca sursa de C. si energie

Daca pe o cultura de E. Coli Lac ⁺ este cultivata pe un mediu fara lactoza sau fara orice alt β-galactozid, concentratia intracelulara a β-galactozidazei si lactopermeazei este foarte scazuta.

Daca lactoza se adauga, enzimele cresc de cca 10⁵ ori. Se constata ca in momentul cand se adauga lactoza enzimele sunt sintetizate aproape simultan. Analizand ARNm inainte si dupa, ARNm –Lac este absent inainte de adaugarea lactozei, iar dupa, se declanseaza sintetizarea lui => Sistemul lactoza este inductibil, iar lactoza este inductor.

Au fost izolate si mutante la care ARNm – Lac exista si prezenta si in absenta lactozei in mediu.

Rezulta ca enzimele se sintetizeaza independent, deci mutantele elimina reglarea. Genele mutante sunt mutante constitutive si se numesc Lac 1 si Lac 0 .

Genele Lac 1 sunt Lac 1⁺ (dominanta) si Lac 1^- (recesiva);

In absenta inductorului (lactoza), mutanta Lac 1⁺ determina incapacitatea celulei de a forma ARNm – Lac, iar mutanta Lac 1^- permite sintetizarea ARNm – Lac .

Gena ARNm – Lac = gena reglatorie; produs = inhibitor => Lac 1^- determina absenta inhibitorului, deci este o mutanta constitutiva.

Genotipul salbatic pentru gena Lac 1 este Lac 1⁺ / Lac 1^- , sistemul fiind inhibat (necesita inductor0. Molecula sintetizata sub controlul ei se numeste Lac- represor.

Prin cartografiere rezulta ca Gena Lac 1 este alaturata genei Lac – z, iar succesiunea genica este:

Lac 1 – Lac-z – Lac-y

Genele (alelele) Lac 0 sunt Lac 0^C si Lac 0⁺, amandoua dominante, dar Lac 0^C are comportament aparte. In prezenta ei => sinteza constitutiva a β-galactozidazei doar daca este in cuplaj cu Lac Z⁺ (lac 0^C/Lac Z⁺ pentru sinteza) => sistem constitutiv

Daca genotipul este Lac 0^C Lac Z^- sau Lac0⁺LacZ⁺ nu se poate exprima dpdv fenotipic, iar sistemul necesita pentru sinteza β-galactozidazei un inductor (lactoza) => sistem inductiv. Mutanta 0^C este cis-dominanta, dominanta care nu se poate exprima decat in prezenta unei alte dominante.

Genotipul Lac 0^C LacZ⁺ se comporta constitutiv. Gena Lac 0 defineste un situs la nivelul moleculei ADN care va disemina daca viteza controlata de gena Lac Z este inductiva sau constitutiva. Lungimea(?)Regiunea (?) Lac 0 = operator