TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE

TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE

Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operatii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare in medii de cultura specifice si, dupa cultivare in conditii optime, izolarea si studiul coloniilor izolate, repicare pentru obtinerea de culturi pure.

Prin cultura pura se intelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singura celula aflata intr-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultura pura este formata din celule apartinand unei singure specii sau unei singure tulpini.

In functie de principiul realizarii lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate in doua grupe mari, si anume:

t      metode bazate pe principiul separarii fizico-mecanice a celulelor;

t      metode biologice.

La randul lor, fiecare din aceste doua grupe cuprinde metode generale, care se preteaza a fi utilizate pentru izolarea majoritatii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup sau un microorganism individual.

Procedee fizice de izolare a culturilor pure

Metoda Koch

Se bazeaza pe raspandirea microorganismelor recoltate din medii naturale intr-un mediu nutritiv si fixarea distantata a celulelor in urma solidificarii mediului cu formare, prin multiplicare, de colonii izolate intre ele.

Metoda este folosita in special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de raspandire este mustul de malt cu agar, repartizat cate 20 cm³ in 3 eprubete, fluidificat si mentinut la 35-40°C. Din proba aleasa pentru izolare se recolteaza celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecuta succesiv in cele 3 eprubete. Dupa inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza in cate o placa Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care raman fixate in mediu vor forma prin multiplicare colonii izolate.

In functie de densitatea celulelor recoltate initial, in placa a 2 a sau a 3 a pot exista colonii izolate (la o distanta de cca. 2 cm), iar dupa studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea in eprubete cu mediu de cultura cu agar, obtinandu-se culturi pure (Fig. 1).

Fig. 1. Tehnica de izolare a culturilor pure

Metoda scarificata

In placi Petri sterile se repartizeaza mediul de cultura adecvat (PCA sau MEA) (fig. 2).

Fig. 2 Repartizare mediu de cultura adecvat

Cu ajutorul firului metalic se recolteaza celule din mediul natural sau din culturi mixte (Fig. 3), apoi cu firul incarcat cu celule se traseaza striuri diferite pe suprafata mediului solidificat, astfel incat prin drumul cat mai sinuos parcurs de fir (Fig.4), intr-o zona a placii celulele sa ramana atasate de mediu si prin termostatare 48-72 h sa se dezvolte si sa formeze colonii izolate.

Fig. 3 Recoltarea celulelor din culturi mixte

Fig. 4 Trasare striuri pe suprafata unui mediu solidificat

Fig.5 Obtinere de culturi pure

Se realizeaza apoi studiul morfologic al coloniilor reprezentative si culturile care intereseaza sunt repicate in eprubete cu mediu steril, obtinandu-se astfel culturi pure (fig. 5).