Tehnica colorarii : date generale despre coloranți, clasificarea coloranților, mecanisme

Tehnica colorarii : date generale despre coloranți, clasificarea coloranților, mecanisme

Coloranții sunt compuși organici, marea majoritate sunt aromatici, care pot induce o colorație durabila unei substanțe sau unui ansamblu de elemente celulare.

Pentru aceasta au nevoie de:

grupari atomice specifice ce confera culoare numite cromofore;

grupari ce permit o fixare permanenta pe substanța de colorat numite grupari auxocrome.

Fenomenul de colorare este legat de absorbția selectivade catre o substanta data a unor anumite lungimi de unda din spectrul vizibil astfel incat lumina reflectata de aceasta substanța apare colorata. Responsabile de aceasta absorbție selectiva sunt gruparile cromofore. Compușii organici ce conțin grupari cromofore sunt numiți cromogeni.

Gruparile auxocrome sunt cel mai des fara legaturi duble, polare sau semi-polare. Dintre cele mai comune amintim : hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil.

Clasificare coloranți

Coloranții citologici sunt clasificați dupa mai multe criterii :

Dupa origine : naturali, de origine vegetala - hematoxilina, safranina sau de origine animala -carminul.

Dupa natura auxocromilor ce determina și comportamentul lor in soluție, coloranții se impart :

-coloranți acizi     (citoplasmatici) conținand auxocromi anionici (carboxil) - sunt coloranți acizi ce coloreaza componentele subcelulare incarcate pozitiv. Cel mai utilizat este eozina care coloreaza in roz citoplasma.

-coloranți bazici (nucleari) conțin auxocromi cationici (exp. Amino). Coloreaza componentele subcelulare incarcate 

- coloranți neutri sunt purtatori de grupari cationice și anionice, se obțin din soluții apoase de coloranți bazici și coloranți acizi amestecate in anumite proporții (eozinatul de albastru de metil, eozinatul de azur de metil).

Mecanismele colorarii

Mecanismele fixarii coloranților pe structurile celulare și tisulare sunt complexe, realizandu-se prin intermediul unor factori fizici și a unor mecanisme chimice in proporții variabile : combinarea colorantului cu anumite grupari active ale substanțelor celulare, prin legaturile Van der Waals sau legaturi de hidrogen intre colorant și gruparile active ale moleculelor sau macromoleculelor, prin formarea unor precipitate insolubile, care se mențin prin anumite mecanisme fizico-chimice la nivelul locului de actiune.

Marea majoritate a reacțiilor de colorare au insa o explicație in special chimica, proteinele ce nu sunt extrase in cursul prelucrarilor ce preced colorarea, reprezinta    substratul molecular la nivelul caruia se atașeaza coloranții.

Anumiți coloranți nu par sa evidențieze decat parțial mecanisme chimice, de aceea s-au luat in considerare și unii factori fizici printre care :

o    Penetrarea mecanica a colorantului in interiorul anumitor structuri tisulare prin osmoza sau capilaritate ;

o    Absorbția ce joaca un rol important in colorațiile diferențiale a unor elemente tisulare (animiți ioni fiind absorbiți mai ușor decat alții de anumite substanțe).

o    Absorbția legata de structura fizica a constituienților tisulari.

Metode de colorare

Tehnicile de colorare sunt dependente de o serie de factori ce tin de preparat sau de tipul colorantului. Exista mai multe criterii de clasificare :

Dupa coloranții folosiți:

o    Colorații simple (1 colorant, fie nuclear (hematoxilina) fie citoplasmatic (eozina).

o    Colorații combinate ( cand secțiunile se coloreaza succesiv cu doi sau mai mulți coloranți (hematoxina-eozina, hematozilina-eozina-albastru de metil).

Utilizarea unor adjuvanți

o    directa : colorantul se fixeaza prin simplul contact cu secțiunea (colorarea cu hematoxilin-eozina).

o    Indirecta (mordansare) -necesita prezența unui mediator sau mordant (alaunurile, iodul, sarurile de fier), care fixeaza colorantul sau componentele celulare , combinatia dintre colorant și mordant=lac.

Intensitatea colorarii

Progresiva - se fac incercari succesive sub control microscopic pana se ajunge la tenta de culoare optima a structurii celulare dupa care se oprește colorarea prin spalare (hemalaunul coloreaza nucleii tuturor tipurilor de celule in albastru, in 4-6 min, daca lasam secțiunile mai mult timp in contact cu colorantul se coloreaza și alte structuri celulare.

Regresiva - se face o supracolorare care prinde și alte structuri celulare decat cele dorite, dupa care excesul de colorant este indepartat prin substante decolorante sau diferențiatorii.

Starea materialului

Colorația vitala se face pe celule in stare vie prin utilizarea unor coloranți vitali si care persista atata timp cat supraviețuiește celula.

Colorația permanenta - se face prin colorarea unor preparate permanente.

Colorarea secțiunilor la parafina

Se executa in mai multe etape :

Precolorarea -in prima etapa sunt supuse preparatele unui proces de deparafinare : secțiunile se trec succesiv printr-o serie de bai succesive de solvenți ai parafinei (benzen, xilen, toluen) timp de 5-10 min. Etapa este importanta deoarece parafina cu permite colorarea.

Hidratarea se realizeaza prin trecerea secțiunilor prin 5 bai de alcool etilic de concentrație descrescanda (3 bai alcool absolut +    o baie de alcool de concentrație 96% + de 70%) timp de 1-2 min.

Colorarea propriu-zisa

Postcolorarea - consta in indepartarea excesului de colorant prin spalare cu apa distilata

Deshidratarea -trecerea prin 3 bai succesive de alcool etilic de concentrații crescande (70,96, 3 bai cu alcool etilic absolut).

Clarificarea - necesara pentru obținerea transparenței necesare observarii la microscop. Se trep preparatele prin 3 bai succesive de benzen (xilen, toluen).

Montarea are ca scop protejarea și conservarea a coloranților, obținerea unui indice de refracție și grad de transparența avantajos din punct de vedere optic.

Mediile de montare sunt : apoase (glicerina-gelatina, sirop Apathy) se folosesc cand secțiunile nu au fost deshidratate.

Anhidre (rașinoase, miscibile cu hidrocarburi benzenice) -balsamul de Canada, rașini sintetice, se folosesc cand secțiunile au fost deshidratate și clarificate.

Montarea se face prin adaugarea unei 1-2 picaturi de mediu de montare pe lama cu secțiunea lipita și colorata, pe care se aplica o lamela de sticla.

Preparatele se tin la temostat la 37 grade, 10-12-ore sau la temperatura camerei, 1-2 zile pentru uscarea și uniformizarea mediului de montare.