TESTAREA SENSIBILITATII BACTERIILOR PATOGENE LA ANTIBIOTICE

Testarea sensibilitatii bacteriilor patogene la antibiotice

_ANTIBIOGRAMA_

Def: Prin antibiograma se intelege testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate intr-un produs patologic fata de diverse antibiotice (AB).

Conditii de efectuare:

Antibiograma se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen.

Antibiograma se realizeaza in functie de rezultatele date de antibiograma, alegand antibioticul cel mai eficace, adica fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.

Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu antibiotice este de durata mai lunga; aceasta deoarece prin mecanismele cunoscute, agentul patogen poate sa castige rezistenta fata de antibioticul utilizat. Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor, poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o bacterie din aceste microbiocenoze.

Principiul antibiogramei consta in capacitatea antibioticelor de a impiedica multiplicarea bacteriana, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele antibiotice au in anumite concentratii si proprietatea de a omori bacteriile: efect bactericid.

Exista mai multe metode pentru efectuarea antibiogramei, dintre care mai importante sunt urmatoarele:

1. Metoda difuzimetrica

Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi Petri, pe care s-a insamantat in panza cultura bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun rondele cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a AB-ului (in imediata vecinatate a rondelei realizandu-se o concentratie mai mare de AB care descreste pe masura indepartarii de aceasta).

Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste cu precizie concentratia minima inhibitorie (CMI), da informatii pretioase asupra sensibilitati speciei testate fata de antibioticele utilizate si este folosita mai frecvent in laboratoarele clinice.

Citirea rezultatelor se face masurand cu rigla zona de inhibitie din jurul rondelelor, diametrul zonei de inhibitie exprimandu-se in mm.

Tehnica de lucru

Mediul de cultura indicat este geloza Muller-Hinton deoarece are o valoare nutritiva care permite dezvoltarea optima a unei varietati de bacterii si nu contine inhibitori ai actiunii unor antibiotice. Pentru bacterii cu necesitati de cultura speciale, se utilizeaza medii adecvate (de exp pentru Streptococcus pygenes se foloseste geloza sange).

Coloniile izolate obtinute din produsul patologic, se insamanteaza in bulion, care se incubeaza 18-24 ore la 37° C, iar pentru bacteriile cu dezvoltare rapida este suficient a se incuba numai 4-6 ore la 37 ° C. Apoi cultura se dilueaza 1/100-1/1000 si se insamanteaza in panza 0,5-1 ml cu cultura diluata, adica se raspandeste uniform lichidul pe suprafata gelozei iar excesul este aspirat cu o pipeta Pasteur si aruncat intr-un vas cu amestec sulfo-cromic. Placa se usuca cu capacul intredeschis timp de ½-1 ora un vecinatatea unei flacari, apoi pe suprafata uscata a mediului se dispun rondele (discuri) de hartie de filtru sau comprimate standard, impregnate cu diverse antibiotice.

Concentratia de antibiotice utilizata corespunde concentratiei serice, sau tisulare, realizate in tratamentul clinic.

2. Metoda dilutiilor in medii lichide

Aceasta urmareste determinarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data, indicand concentratia de chimioterapice sau antibiotice necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale. In acest fel se determina ceea ce se cunoaste sub denumirea de concentratie minima inhibanta (CMI - inhibitorie).

_REACTIA DE AGLUTINARE_

Def: Aglutinarea bacteriana este o reactie antigen-anticorp de agregare, in care antigenul este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie (antigen particulat). Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele imune antigen-anticorp, formeaza retelele tridimensionale in prezenta unor electroliti din mediu si in anumite conditii de temperatura si pH, constituind agregate vizibile. Reactia de aglutinare se foloseste in identificarea unor bacterii pe baza proprietatilor antigenice, cat si pentru evidentierea anticorpilor aglutinati din serul de bolnav.

In aglutinarea bacteriana, dupa natura si localizarea antigenului care participa la reactie, exista

doua tipuri principale de aglutinare: somatica sau aglutinare O sau ciliara sau aglutinare H.

Aglutinarea O sau somatica este data de antigenul O, somatic, care intra in constitutia peretelui celular fiind in general identic cu endotoxina. Antigenul O este de natura glucido-lipido-polipeptidica, termostabil, alcoolorezistent si distrus de formol.

Aglutinarea O apare sub forma unor grunji fini, care nu disociaza la o aglutinare brutala; apare mai lent, necesitand o incubare de 2 ore la 52°C, urmata de 20 ore la temperatura camerei. In aglutinarea O bacteriile se unesc intre ele pein alinierea cap la cap (aglutinare polara).

Aglutinarea H, flagelara este data de antigenul H, prezent la bacteriile mobile, antigen de natura proteica, termostabil, distrus de alcool, rezistent la formol. Aglutinarea H apare sub forma unor flacoane care formeaza un sediment abundent care dispare la agitare brusca; aglutinarea H apare mai rapid. In aglutinarea H bacteriile se unesc prin flageli.

_REACTIA DE PRECIPITARE_

Def: Este o reactie antigen-anticorp de agregare, in care antigenul este reprezentat de macromolecule in solutie coloidala. Punerea in contact a antigenului cu anticorpul corespunzator duce la formarea unor complexe antigen-anticorp care precipita atunci cand elementele ce participa in reactie se gasesc in proportie optima. Are mai multe variante in functie de mediul in care se desfasoara reactia. Tinand cont de faptul ca in reactia de precipitare, antigenul, ca solutie coloidala, poate fi bine caracterizat chimic aceasta confera reactiei un mare grad de specificitate si sensibilitate, pretandu-se foarte bine si la analize imunochimice de finete.

Teste care utilizeaza vizualizarea complexelor antigen-anticorp prin artificii tehnice

Sensibilitatea reactiilor antigen-anticorp poate fi marita legand de anticorp (mai rar de antigen) un marker usor de identificat, care sa nu interfereze cu proprietatile imunologice ale reactantilor. Acest marker poate fi:

a.       O substanta fluorescenta (izotiocianat de fluoresceina, rodamina), in tehnica imunofluorescentei;

b.      Izotopi radioactivi (de obicei 125), in metoda radio-imunotestarii;

c.       O enzima (peroxidaza, beta-galactozidaza, fosfataza alcalina etc), in testele imunoenzimatice.

_Schema diagnosticului etiologic in bolile infectioase_

Metode folosite in diagnosticul etiologic sunt :

A. Metode in diagnostic direct sau bacteorologice

B. Metode de diagnosticare indirect

a) diagnostic serologic

b) diagnostic biologic prin intradermo-reactie

A. Diagnosticul bacteoriologic urmareste evidentierea agentului patogen din produsul patologic, de obicei prin izolarea si identificarea lui.

Etape principale:

I. Recoltarea produselor patologice in functie de localizare si manifestare clinica;

II. Examenul microscopic direct din produsul patologic prin efectuarea preparatului nativ si a frotiului colorat;

III. Insamantarea si izolarea agentului patogen din produsele patologice in cultura pura;

IV. Identificarea agentului patogen izolat prin:

1. Cercetarea proprietatilor morfotinctoriale in urma examinarii microscopice a preparatului nativ(mobilitate) si a frotiurilor colorate luate din cultura, forma dimensiuni asezare prezenta cililor capsulei sporilor.

2.Caracterizarea proprietatiilor de cultura permite sa se stabileasca in primul rand daca sunt necesare pentru dezvoltare medii simple sau medii speciale, se observa de asemenea forma, dimensiunile, consistenta coloniilor, colonii de tip S sau tip R (pe medii solide); tulburarea mediului, formarea peliculei, sediment ( medii lichide).

3. Cercetarea proprietatilor biochimice, degradarea fermentativa a zaharurilor si acizilor organici.

4. Stabilirea structurii antigenice prin reactii de aglutinare, precipitare cu seruri imune standard.

5. Cercetarea proprietatilor de patogenitate in vivo sau in vitro.

V. Determinarea sensibilitatii la antibiotice.

B. Diagnosticul indirect evidentiaza instalarea imunitatii in urma trecerii prin infectie.   

Se efectueaza prin:

I. Metode de diagnostic serologic, care se bazeaza pe aparitia anticorpilor in serul bolnavului.

II. Metode de diagnosit biologic. Prin inocularea intradermica a antigenului.