Metode de cromatografie

METODE DE CROMATOGRAFIE

INTRODUCERE IN SEPARARILE    CROMATOGRAFICE

INTRODUCERE

Fara indoaiala ca cea mai raspandita metoda de realizare a separarilor analitice este cromatografia,un procedeu ce isi gaseste aplicatiile in toate ramurile stiintei.Cromatografia "a debutat" la inceputul acestui secol cu primele experimentari efectuate independent de catre geologul David Day si de botanistul rus Mihail Tvet. Cercetatorul rus, a folosit acesta tehnica pentru a separa diversi pigmenti ai plantelor ,precum clorofila si xantofila prin trecera unor solutii a acestor compusi printr-o coloana de sticla umpluta cu un carbonat de calciu in divizat

_{Aplicatiile cromatografiei s-au dezvoltat exploziv in ultimele patru decenii, datorita nu numai dezvoltarii unor noi tipuri de tehnici cromatografice, cat si datorita unei necesitati crescande a oamenilor de stiinta de noi metode pentru separarea unor amestecuri complexe. Impactul deosebit al acestor metode asupra stiintei este atestat prin acordarea Premiului Nobel in 1952 lui A.J.P. Martin si R.L.M. Synge pentru descoperirile lor din acest domeniu}

Cromatografia cuprinde un grup divers si important de metode de separare care permit cercetatorului sa separe, sa izoleze si sa identifice componenti foarte asemanatori ai unui amestec complex; multe dintre aceste separari sunt practic imposibile folosind alte metodeTermenul de 'cromatografie' este dificil de definit cu rigurozitate, datorita varietatii de sisteme si tehnici la care a fost aplicat. Insa, toate aceste metode implica o faza stationara si o faza mobila. Componentele unui amestec sunt trecute peste faza stationara cu ajutorul fluxului fazei mobile; separarile se bazeaza pe diferentele dintre vitezele

Pentru o separare cromatografica reusita ,trebuie ca speciile chimice care urmeaza a fi separate sa fie solubile in faza mobile.De asemenea acestea trebuie sa fie capabile sa interactioneze cu faza solida fie prin dizolvare ,fiind absorbita,fie prin reactie chimica

Toate separarile crematografice se bazeaza pe diferentele de repartitie ale solutiilor intre faza mobile si cea stationara .Echilibrul implicat poate fi descris cantitativ cu ajutorul coeficientului de repartitie K,care pentru cromatografie este definit astfel: _,

_{Unde Cs este concentratia analitica a solutiei in faza stationara si Cm este concentratia sa in faza mobile.}

_{Cromatograma:}

_{cromatograma furnizeaza doar o singura informatie calitativa despre fiecare specie din proba si anume timpul sau de retentie sau pozitia sa in faza stationara dupa o anumita perioada de elutie. Bineinteles ca, din cromatograma pot fi obtinute date suplimentare implicand diferite faze mobile si stationare precum si temperaturi variat.}

_{CROMATOGRAFIA    PE STRAT SUBTIRE}

Acest tip de cromatografie plana prezinta unele avantaje fata de alte cromatografii,intrucat se pot realiza separari mai nete si mai rapide ,are o sensibilitate mai ridicata si se poate adapta o continuitate realizata de catre liant .Straturile trebuie sa fie unuforme ,adica grosimea si cantitatea de suport pe unitatea de suprafata este necesar sa fie aceeasi pe toata placa .

Substanta cel mai des utilizata drept suport este silicagelul .Acesta este frecvent folosit ca suport pentru apa sau alti solventi polari in separarae lichid lichid .Daca dupa preparare stratul de silicagel este uscat in cuptor ,se pierde mare parte din umiditate si suprafata devine un solid predominant adsorbant pentru separarile lichid -solid.In acest caz trebuie avut grija sa se evite expunerea suprafetei in atmosfera,deoarece s-a demonstrat ca a adsorbtia apei are loc in decurs de cateva minute ;iar suprafata revine la un suport pentru lichid.

Un alt suport des utilizat este alumina .Pe silicagel sunt separate in general ,substantele acide si neutre,iar amestecurile bazice pe alumina.Drept suporti, mai pot fi folositi celuloza ,diatomita si diversi polimeri organici.

Pregatirea placilor in strat subtire

_{O placa in strat subtire poate fi obtinuta prin intinderea unei suspensii apoase a unui solid macinat fin pe o suprafata curata de sticla sau de plastic sau a unei lamele microscopice. Intrucat deseori adsorbanti nu adera foarte bine pe placa de sticla sau un alt material, se foloseste, dupa cum s-a aratat mai sus, un liant ce este incorporat in suspensie. Acest liant conduce si la cresterea rezistentei mecanice. Unul dintre liantii cei mai utilizati este un ipsos de sulfat de calciu semihidratat. Mai pot fi utilizati drept lianti: amidonul, dispersiile plastice si bioxidul de siliciu hidratat. Totusi, indiferent de liantul utilizat, este posibil ca acesta sa prezinte proprietati adsorbante, influentand astfel comportamentul cromatografic al stratului subtire. Ulterior, placa este lasata pana cand stratul s-a depus si a aderat puternic la suprafata in unele scopuri acestea pot fi incalzite in cuptor pentru cateva ore.}

_{Straturile pot fi depuse folosind atat dispozitive comercializate cat si metode mai simple de laborator. Dintre metodele de laborator cea mai folosita este aceea in care pe marginea unei placi de sticla sunt montate benzi care pot controla grosimea stratului depus. Pentru separarile folosite in scopuri preparative sunt pregatite placi cu grosimea de pana la 2 mm, in timp ce pentru separarile conventionale grosimea placilor utilizate este de circa 0,1 - 0,5 mm. Cele mai utilizate placi au dimensiunile de 5 x 20 cm sau 20 x 20cm.}

_{Aplicarea probei. Developarea.}

_{In apropierea marginii inferioare a stratului adsorbant al placii, se depune o picatura din proba, pozitia sa fiind marcata cu un creion. Proba al carei volum este de aproximativ 5 - 10 ml, si avand o concentratie de 0,01 - 1%, se aplica cu ajutorul unei pipete sau a unei capilare sub forma unui spot pe o linie de start. Dupa evaporarea solventului probei, placa se plaseaza in pozitie verticala intr-un container inchis saturat cu vapori ai solventului de developare, ce se numeste cuva de developare. Aceasta contine un strat de faza mobila Inaltimea stratului de lichid nu trebuie sa ajunga la nivelul liniei de start. Eluentul se ridica pana la extremitatea superioara a placutei prin capilaritate. Inaltimea zonei umezite se poate limita prin trasarea unei zgarieturi orizontale la aproximativ un centimetru de marginea superioara}

_{Folosind unul dintre aranjamentele prezenate in figura 4, unul dintre capetele placii este udat de catre developator. Cantitatea de solvent utilizata este fixa si ea reprezinta necesarul absorbit pana la umezirea aproape totala a fazei stationare.}

_{Dupa ce developatorul a traversat jumatate pana la doua treimi din lungimea placii, se procedeaza la indepartarea placii si uscarea sa, iar pozitiile componentelor se pot determina in diferite moduri. De remarcat ca la acest tip de cromatografie, toti componentii probei raman pe placa. Alaturi de spotul probei se pot depune si spoturi 'martor' continand componenti unitari ce se presupun ca se afla in proba de analizat.}

_Figura:1.1.

_{Doua tipuri de dispozitive pentru cromatografia pe strat subtire:}

_{a. flux ascendent; b. flux descendent;}

_{S: pozitia initiala a probei (start); D: developator;}

_{C: suprafata cromatografica;B: impletitura de bumbac.}

_{In figura 1.5 este ilustrata separarea aminoacizilor dintr-un amestec prin developare in doua directii (cromatografie plana bidinesionala). Proba a fost plasata intr-unul dintre colturile placii patrate, iar developarea s-a efectuat in directie ascendenta cu solventul A.}

_{Figura 1.2.}

_{Cromatograma bidimensionala pe strat subtire a unui amestec de aminoacizi. Solventul A: toluen-2-cloroetanol- piridina. Solventul B: acid acetic -cloroform - alcool benzilic. Aminoacizii: 1. acid aspartic; 2. acid glutamic; 3.serina b-alanina; 5.glicina; 6. alanina 7. metionina; 8. valina; 9.izoleucina cisteina}

_{Acest solvent a fost apoi indepartat prin evaporare, iar placa a fost rotita la 900, urmand o developare ascendenta cu solventul B. Dupa indepartarea solventului, pozitiile aminoacizilor au fost determinate prin pulverizare de ninhidrina, un reactiv ce formeaza cu aminoacizii produsi colorati de la roz pana la purpuriu. Spoturile au fost identificate prin comparatie cu cele ale unor standarde.}

_{Alegerea solventilor}

_{Conditia generala impusa solventilor cromatografici este anhidritatea perfecta Puterea de eluare a solventilor uzuali se numeste serie eluotropica (vezi tabelul 1.3).}

_{Tabelul 1.1}

_{Seria eluotropica, dupa Trappe}

_{Valorile Rf depind de polaritatea fazei mobile, crescand odata cu aceasta. Cei mai utilizati solventi sunt prezentati in tabelul 1.4. Trebuie mentionat ca solventul potrivit se alege dupa o serie de teste preliminare.}

_{Tabelul 1.2.}

_{Solventi utilizati frecvent in cromatografia pe strat subtire}

_{Astfel, se depune o picatura de proba pe o placa cromatografica, dupa care, peste spotul format se pipeteaza putin eluent. Eluentul cel mai indicat va forma mai multe zone inelare, separate si suficient de apropiate de centru (figura 6-a), in timp ce un solvent se conduce la o zona punctiforma nu are o putere de elutie suficienta (figura 6-b), iar unul ce formeaza un inel mare cu componentii plasati spre periferie arata o putere de eluare prea mare .}

_{Figura 1.3.}

_{Test preliminar pentru alegerea solventului optim in cromatografia pe strat subtire.}

_{Identificarea speciilor}

_{Marimile caracteristice ce permit identificarea si interpretarea rezultatelor sunt: pozitia, suprafata si intensitatea spoturilor. Dupa separare, pentru a localiza componentele unor probe se folosesc diferite metode. La substantele colorate spoturile sunt vizibile direct pe placute. Pentru componentii incolori, exista metode de vizualizare. Doua dintre metodele cele mai utilizate, care se aplica in mod deosebit la amestecurile organice, presupun pulverizarea unor solutii de iod sau acid sulfuric (daca liantul stratului absorbant este gipsul); ambele conduc la produsi de reactie inchisi la culoare in urma reactiei cu componentele organice. De asemenea, unii reactivi specifici, precum ninhidrina, in cazul aminoacizilor si solutii de SbCl5, in cazul terpenilor, sunt utili pentru localizarea speciilor separate. Substantele fluorescente pot fi detectate cu o lampa de ultraviolete. Intr-o varianta alternativa, materialul fluorescent (eosina) se poate incorpora in faza stationara. Dupa developare, placa poate fi examinata in lumina ultravioleta In acest caz, toata placa este fluorescenta, exceptie facand pozitiile in care se afla componentele probei (acestea nu sunt fluorescente).}

_{Analiza cantitativa}

_{Cantitatea unui component este caracterizata de suprafata si intensitatea spoturilor. O estimare semicantitativa a cantitatii unui component prezent, poate fi obtinuta prin compararea ariei spotului cu cea a unui standard. Date mai bune pot fi obtinute prin razuirea spotului de pe placa, extragerea analitului din solidul rezultat si masurarea analitului printr-o metoda fizica sau chimica potrivita In cazul utilizarii substantelor fluorescente, se poate folosi un densitometru pentru a masura prin fluorescenta sau reflexie radiatia emisa de spot. Distributia concentratiilor unui component intr-un spot este aproximativ gaussiana}

_{Dupa vizualizarea spotului, se calculeaza imediat valorile Rf, datorita posibilitatii de aparitie a fenomenului de atenuare, mai ales in cazul relevarii (vizualizarii) chimice. Zona este incercuita cu un creion (sau se zgarie stratul subtire), se masoara distantele parcurse de zone si frontul de solvent. Valoarea Rf se calculeaza astfel:}

_(1.3)

_{Evaluarea valorilor Rf poate fi utilizata si in scopuri calitative prin compararea cu valorile Rf ale unor compusi cunoscuti. Conditiile de tratare ale placii sau ale hartiei si procedeul de developare trebuiesc controlate cu strictete, intrucat acestea influenteaza valoarea Rf.}

_{Figura 1.4.}

_{Calculul valorii Rf .}

_{hS - Distanta parcursa de solut.}

_{hf - Distanta parcursa de solvent.}

_{. APLICATII.}

_{Cromatografia plana are numeroase aplicatii in biochimie, farmacie, biologie. Intrucat a fost posibila obtinerea unor hartii si placi cromatografice reproductibile si la un pret de cost redus, aceste metode cromatografice sunt folosite pe scara larga. Astfel, se poate testa de exemplu puritatea unui produs natural; se poate evidentia prezenta unor otravuri sau a unor medicamente (droguri) interzise; se pot detecta din timp aparitia unor boli prin analiza unor probe metabolice sau biologice.}

_{In scopul separarii preparative a unor componenti, chimia organica de sinteza foloseste uneori separarea obtinuta pe strat subtire. Modul de lucru este similar cu cel se la cromatatografia analitica, dar placutele folosite sunt mai mari, iar stratul adsorbant este mai gros. Dupa aplicarea probei ca o banda ingusta pe linia de start si developare ulterioara, separarea fiecarui component se realizeaza prin razuire. In vederea punerii in evidenta a spoturilor se folosesc determinarile de florescenta, intrucat acestea nu sunt distructive asemenea metodelor chimice.}

Separarea unor vitamine prin cromatografie pe strat subtire

Scopul lucrarii

Din punct de vedere experimental, cromatografia pe strat subtire este o metoda eficienta de separare a amestecurilor complexe. Metoda se poate aplica pentru determinarea impuritatilor in cazul produselor farmaceutice, la detectarea si izolarea drogurilor interzise si la separarea unor medicamente.

Lucrarea de fata urmareste separarea unui amestec de vitamine pe straturi subtiri de silicagel. Detectia se poate realiza in lumina UV sau printr-o reactie chimica de culoare.

Aparatura si reactivi

- camera de developare etansa, paralelipipedica

- placi TLC acoperite cu silicagel ²⁵⁴F

- solutii standard (0,01 g/ml) de vitamina E, acid ascorbic, vitamina D₃, nicotinamida, DL 1-tocoferol, vitamina A acetat

- solutie proba de vitamine

- developant: amestec ciclohexan - dietileter (80:20)

- revelator: lampa de UV sau o solutie de SbCl₃ in cloroform (20g/100ml), preparata dupa tratarea prealabila a cloroformului, timp de 3 ore cu Al₂O₃

- micropipete sau capilare de sticla

Modul de lucru

Pe o placa TLC (200 * 200 mm) acoperite cu silicagel ²⁵⁴F (Merck), se aplica cu ajutorul unei capilare cate 1ml din solutiile standard de vitamine si din solutia proba. Probele se aplica la cca. 2cm de partea inferioara a placii, prin spotulari si uscari succesive, astfel incat diametrul spotului sa nu depaseasca 2mm. Dupa uscarea solventului, placa se introduce in camera de developare care a fost saturata in prealabil timp de 30 - 60 min. cu amestecul de solventi utilizat drept developant.

Se lasa solventul sa migreze pe o distanta de cca. 150 mm, dupa care placa se scoate din tancul cromatografic si se marcheaza imediat frontul de solvent cu ajutorul unui creion. Dupa uscare, cromatograma se plaseaza sub o lumina UV de unde scurte (254 nm), astfel incat vitaminele vor fi observate sub forma unor spoturi de culoare inchisa pe un fundal verde fluorescent. Se incercuieste fiecare spot in scopul determinarii ulterioare a valorilor R_f.

O alta metoda de vizualizare a compusilor separati consta in pulverizarea cromatogramei cu o solutie de SbCl₃ (20g/100ml cloroform). Dupa pulverizare, vitamina A va capata imediat o culoare albastra cu atenuare rapida, vitamina D va capata, in mod gradat, o culoare galben - portocalie, iar vitamina E va fi vizibila numai dupa incalzirea placii la 100^oC, timp de 5 minute.

Prelucrarea rezultatelor

Se calculeaza valorile R_f ale componentilor din proba de analizat si, prin comparatie cu valorile R_f corespunzatoare solutiilor standard de vitamine, se determina compozitia    solutiei necunoscute.

Separarea cromatografica pe strat subtire a constituentilor unor medicamente analgezice - antitermice.

Scopul lucrarii

Lucrarea urmareste utilizarea cromatografiei pe strat subtire in analiza continutului unor produse farmaceutice comerciale cum sunt: aspirina, antinevralgicul si fasconalul.

Aparatura si reactivi

- 3 mojare cu pistil

- pahare Berzelius de 50ml

- capilare de sticla

- camera de developare paralelipipedica

- placi acoperite cu silicagel G (200 * 200 cm)

- lampa de lumina UV sau cristale de iod

- metanol pentru solubilizarea probelor

-developant:amestec de benzen-etanol-acid acetic-metanol (120:60:18:1, V/V)

Modul de lucru

Se pregateste amestecul developant si se introduce in camera de developare astfel incat pe fundul cuvei sa existe un strat de cativa milimetri de solvent. Se lasa cuva sa se satureze in vaporii amestecului developant cca. 30 - 60 min.

In acest timp, se mojareaza foarte fin, in 3 mojare mici, cate o pastila de aspirina, antinevralgic si fasconal care se dizolva in cca. 2 - 3 ml metanol. Separat se dizolva in paharele, mici cantitati de probe martor: acid salicilic, acid acetilsalicilic, fenacetina si cafeina (produsi puri) in 2 - 3 ml metanol, notandu-se fiecare flacon.

Se depun probele (4 probe martor si 3 probe de medicamente comerciale) cu ajutorul unor capilare pe linia de start aflata la cca. 2 cm de capatul inferior al placii, sub forma de spoturi echidistante. Se introduce placa in cuva de developare, se acopera aceasta cu capacul si se urmareste elutia frontului de solvent pana la 5 - 100 mm fata de marginea superioara a placii. Se scoate placa din cuva, se noteaza pozitia frontului de solvent si se lasa sa se evapore complet solventul in aer (5 - 10 min.).

Pentru vizualizarea componentilor se ilumineaza placa cu o lampa de lumina UV, observand si notand spoturile fluorescente (fig. 1). In acelasi scop, placa se poate introduce intr-o cuva cu vapori de iod cca. 30 minute.

Obs: Acidul salicilic observat uneori in medicamentele comerciale, provine din hidroliza in timp sau pe placa a acidului acetilsalicilic.