DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN GRIPA

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN GRIPA

I. DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

Recoltarea produselor patologice

Se pot preleva:

secretii nazale

lichid de spalatura nazofaringiana

(aspirat traheal, lichid de spalatura bronsica, piese necroptice).

Examenul direct al produsului patologic

Pot fi detectate direct in produsul patologic:

- Virionul, cu ajutorul ME

- Antigenele virale, cu ajutorul:

IFD, realizata pe amprente de mucoasa nazala si frotiuri efectuate din secretii nazale.

ELISA, folosita in special pentru identificarea antigenelor de tip.

- Acidul nucleic viral poate fi detectat prin:

hibridizare cu sonde nucleotidice

PCR, aplicata dupa obtinerea ADN-ului complementar ARN-ul viral prin reverstranscriere

RT-PCR (reverstranscriere-PCR

Izolarea virusului

Produsele patologice sunt prelucrate si sunt inoculate pe:

Oua embrionate de gaina

Izolarea pe ouale embrionate este metoda de electie si este accesibila tuturor laboratoarelor de virusologie. Produsele patologice sunt inoculate pe ouale de gaina fecundate, cu embrioni de 8-12 zile.Examinand oul in pozitie orizontala la ovoscop se stabileste locul inocularii in regiunea unde distanta dintre cochilie si embrion este cea mai mica, iar dupa badijonarea cu tinctura de iod, se realizeaza un orificiu de dimensiuni mici in cochilie, fara sa se perforeze membrana proprie a oului. La acest nivel, se patrunde cu un ac cu bizou scurt, atasat la o seringa de 1ml, prin membrana proprie a oului si membrana corioalantoidiana. In momentul cand se intampina o rezistenta prin atingerea embrionului, se retrage foarte usor acul si se inoculeaza o cantitate de 0,1ml din produsul patologic. Apoi, se retrage acul brusc si se obtureaza orificiul cu o picatura de parafina topita, sterila. Ouale inoculate sunt incubate la temperatura optima de cultivare a virusurilor gripale, respectiv 33-34^oC. Ouale se deschid dupa omorarea embrionului prin refrigerare, respectand normele de lucru aseptic. Se recolteaza lichidul amniotic si lichidul alantoidian, ce urmeaza a fi inoculate pe alte oua embrionate, in vederea obtinerii virusului gripal in cantitate mare, in urma a 2-5 treceri succesive.

Culturi de celule

Virusurile gripale cultiva mai greu in culturi celulare. Cel mai bine cultiva virusul gripal de tip B, urmat de tipul A, in timp ce cel de tip C cultiva extrem de dificil sau deloc. Produsele patologice tratate cu antibiotice pot fi inoculate in culturi primare de rinichi de maimuta sau linii celulare de rinichi de caine (MDCK).

Animale de laborator

Soarecele alb si dihorul sunt foarte sensibili la infectia cu virusurile gripale, iar inocularea se practica in general intranazal. Soarecii dezvolta o pneumonie letala. Din trituratul pulmonar obtinut dupa sacrificarea acestora, in urma inocularii altui lot de soareci pe cale nazala, se poate obtine adaptarea virusului la organismul animalului, dupa 3-8 astfel de pasaje oarbe.

Identificarea virusurilor gripale cultivate in sistemele biologice

- Dupa cultivarea pe ouale embrionate de gaina, acestea sunt deschise aseptic, recoltandu-se lichidul amniotic si alantoidian. Pentru identificarea antigenelor virale se recurge la: HA, HAI si RFC. Printre aplicatiile HA se numara si detectarea si titrarea virusurilor gripale.

Principiul HA: in contact cu o suspensie de hematii, virusurile hemaglutinante, precum virusurile gripale, provoaca aglutinarea hematiilor.

Virusurile gripale se adsorb pe suprafata hematiilor prin intermediul hemaglutininei si se desprind de pe acest substrat cu ajutorul neuraminidazei.

- In cazul culturilor celulare, identificarea se bazeaza pe evidentierea

ECP. Leziunile citologice in cazul virusului gripal de tip A sunt de tip vacuolar, fiind insotite te desprinderea celulelor din monostrat. Virusul gripal de tip B produce ECP de tip granular, cu fragmentarea celulelor, picnoza si distrugerea monostratului celular.

- In cazul animalelor de laborator, trituratul din plamani contine cantitati mari de virus gripal, ce poate fi identificat prin: HA, HAI si RFC.

II. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC

Se investigheaza dinamica anticorpilor specifici pe perechi de seruri, prima proba fiind recoltata cat mai precoce de la debutul bolii, iar cea de-a doua dupa aproximativ 10-14 zile, in convalescenta. Diagnosticul de gripa este sustinut indirect, prin detectarea seroconversiei sau a unei cresteri semnificative, de cel putin 4 ori a titrului de anticorpi in proba a doua de ser, comparativ cu prima.

Ca tehnici sunt utilizate in mod curent HAI si RFC, recomandandu-se si ELISA atunci cand este posibil, datorita sensibilitatii crescute a acestei metode.

HAI

Prin HAI se investigheaza aparitia si cresterea titrului anticorpilor hemaglutinoinhibanti. HAI este o reactie de seroneutralizare, avand ca principiu inhibarea aglutinarii hematiilor de catre hemaglutininele

virusurilor gripale, atunci cand acestea s-au unit cu anticorpii complementari.

Materiale necesare

cele doua probe de ser de cercetat, tratate pentru indepartarea inhibitorilor specifici, inactivate la 56^oC, timp de 30' si diluate 1/7 cu solutie salina izotona;

suspensiile de antigen gripal cu o concentratie de 8 ori mai mare decat titrul hemaglutinant stabilit prin HA;

solutie salina izotona;

o suspensie de hematii de cocos 0,5%;

microplaci cu godeuri;

pipete automate si conuri adecvate etc.

Tehnica de lucru

Se executa dilutii binare din serurile de cercetat, incepand cu dilutia 1/7, in placi sau microplaci de plastic cu godeuri, peste care se pipeteaza un volum egal din suspensia de antigen ce contine 8 UA. Placile se agita, se acopera cu un capac si se lasa la temperatura camerei timp de 30'. Dupa aceea se adauga un volum egal din suspensia de hematii de cocos 0,5% si se lasa placile la temperatura camerei timp de 30-45'. Concomitent cu probele de cercetat, se lucreaza si martorul antigen, martorul hematii, martorul ser sigur pozitiv si martorul ser sigur negativ.

Citirea si interpretarea rezultatelor

Titrul de anticorpi HAI este dat de cea mai mare dilutie de ser de cercetat la care mai apare o inhibare completa a HA. Diagnosticul de gripa este sustinut de detectarea unei cresteri in dinamica de cel putin 4 ori a titrului de anticorpi HAI.