STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE -_PREPARATE MICROSCOPICE

STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE -_PREPARATE MICROSCOPICE

Examinarile bacteriologice urmaresc evidentierea si identificarea bacteriilor din produsele patologice.

Bacteriile avand dimensiuni de ordinul micrometrilor nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.

Examenul microscopic se executa fie direct din produsele patologice (examen microscopic direct), fie din culturi pure.

Preparatele microscopice sunt de doua feluri:

- preparat nativ, cu germeni vii;

- frontiu sau preparat colorat, cu germeni omorati;

Examenul microscopic al unui preparat nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela a unei suspensii de germeni vii intr-o picatura de solutie salina fiziologica, sau mediu de cultura lichid, precum si a produsului patologic (sange, sediment urinar,etc).

Pentru executarea preparatului nativ dintr-un produs patologic lichid sau din cultura in mediu lichid, se ia cu pipeta Pasteur o picatura din produsul respectiv, se depune pe mijlocul lamei si se acopera cu o lamela. Din cultura obtinuta pe mediul solid, se ia cu ansa sterila o cantitate mica dintr-o colonie izolata si se suspenda omogen intr-o picatura de solutie salina fiziologica depusa pe mijlocul lamei. Se acopera cu o lamela.

Examinarea la microscopul optic se face cu ajutorul unor obiective uscate.

Se coboara condensatorul si se diafragmeaza in asa fel incat campul microscopic nu sa fie luminat prea puternic, obtinandu-se astfel un contrast mare. Punerea la punct a imaginii se realizeaza in trei timpi:

- ne apropiem cu obiectivul de preparat cu ajutorul vizei macrometrice privind lateral;

- privim prin ocular si ridicam obiectivul cu ajutorul vizei macrometrice, pana cand apare campul microscopic;

- realizam obtinerea detaliilor in campul microscopic cu ajutorul vizei micrometrice;

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frontiu).

Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detaliat pe preparate fixate si colorate, cu germeni omorati.

Obtinerea unui preparat colorat se executa in mai multi timpi:

      timpi pregatitori: etalarea, uscarea, fixarea;

      timpi terminali: colorarea, spalarea, uscarea

Etalarea (intinderea frontiului).

In acest scop se folosesc lame perfect curate si degresate. Daca frotiul se face dintr-un lichid, se depune cu ansa, sau pipete Pasteur o picatura foarte mica pe mijlocul lamei. Daca frotiul se face dintr-un produs semisolid, sau dintr-o cultura pe mediu solid, se depune pe lama o picatura de solutie salina fiziologica in care se suspenda cu ansa sterilizata in prealabil, o cantitate mica de produs, se omogenizeaza bine, apoi se intinde cu grija. Un frotiu corect etalat trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: sa fie intins subtire si uniform pe suprafata lamei, lasand de la marginile lamei un spatiu liber de 1-2 cm.

Uscarea se face lent, lasand lama la temperatura camerei ferita de praf, curenti de aer etc.

Fixarea se face prin procedee fizice si chimice.

Procedeul fizic cel mai utilizat este fixarea prin incalzire si consta prin trecerea rapida a lamei cu preparatul uscat, de cel putin trei ori, prin flacara unui bec de gaz, pana cand primeste o temperatura suportata de partea dorsala a mainii.

Pentru scopuri speciale se folosesc procedee chimice, care constau in tratarea frotiului uscat cu alcool metilic, etilic, amestec de acloolo-eter.

Scopul fixarii este multiplu. Microorganismele sunt omorate si deci preparatul nu mai este infectios. Printr-o fixare corecta preparatul adera mai bine pe lama si nu se detaseaza in timpul operatiilor de colorare si spalare. Prin omorarea microorganismelor se mareste permeabilitatea peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de unii coloranti.

Colorarea

Dupa scopul urmarit se pot utiliza mai multe tipuri de coloratii:

- coloratia simpla, care se executa cu un singur colorant;

- coloratia combinata, care se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti, fiecare colorant actionand independent si fixandu-se pe anumite elemente;

- coloratii speciale, pentru formatiuni morfologice celulare si extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula.

Spalarea frotiului colorat se realizeaza cu apa de robinet, sau cu apa distilata, pana la indepartarea completa a procesului de colorant de pe lama.

Uscarea frotiului colorat se face la temperatura camerei.

Examinarea microscopica a frotiului colorat se face cu ajutorul microscopului optic, intotdeauna cu obiectivul de imersie.

Metode de colorare folosite in microbiologie:

     Coloratia simpla

Frotiul fixat este acoperit complet cu un singur colorant, de obicei albastru de metilen, sau fuxina diluata, timp de 1-2 minute, apoi se spala cu apa curenta si se usuca. In coloratia cu albastru de metilen toate elementele se coloreaza in albastru, iar in cea cu fuxina, toate elementele se coloreaza in rosu.

Coloratia simpla permite stabilirea unor proprietati morfologice ca: forma si marimea microbilor. Este foarte utila in diagnosticul prin examen microscopic direct din produsul patologic in gonoree, meningita cerebrospinala epidemica si in alte infectii.

     Coloratia combinata

Friotiul fixat este supus actiunii mai multor coloranti.

     Coloratia GRAM

Este larg utilizata in microbiologie, pentru ca deosebeste germenii gram pozitivi de cei gram negativi.

Timpi coloratiei Gram:

Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana filtrat extemporaneu, timp de 2 minute, apoi se scurge colorantul.

Se acopera cu o solutie lugol pentru mordansare (fixare colorant), timp de 2 minute. Se scurge mordantul. Prin aceasta operatie toate elementele din frotiu se coloreaza in albastru violet.

Se decoloreaza cu alcool-acetona timp de 20 secunde pana nu se mai dizolva colorant. Se spala cu apa curenta.

Se recoloreaza cu fuxina diluata timp de 2 minute.

Se spala cu apa curenta pana la indepartarea completa a colorantului in exces.

Se usuca frotiul si se examineaza cu imersia.

Germenii gram pozitivi rezista la decolorare si isi mentin culoarea albastru violet initiala. Germenii gram negativi se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu fuxina diluata.

Diferenta de comportament in coloratia gram se explica prin structura si compozitia chimica diferita a peretelui celular la bacteriile gram pozitive si gram negative.

Coloratia gram permite dezvaluirea urmatoarelor grupe importante la bacterii

- coci gram pozitivi: stafilococ, steptococ;

- coci gram negativi: meningococ;

- bacili gram pozitivi: bacilul coli;

- cocobacili gram negativi: brucele;

     Coloratia ZIEHL-NEELSEN

Pune in evidenta germenii acido-acloolo-rezistenti.

Timpii coloratiei Ziehl-Neelsen:

Se acopera frotiul fixat, cu fuxina concentrata si se incalzeste trecand flacara pe sub preparat, pana cand incep sa iasa vapori, fara sa se ajunga la fierbere si fara sa se usuce colorantul pe lama, timp de 5-10 minute. Se spala cu apa curenta.

Se decoloreaza cu acid sulfuric 20% timp de 30 secunde. Se spala cu apa curenta.

Se decoloreaza cu alcool etilic 96%, 30 secunde, pana la indepartarea colorantului. Se spala cu apa curenta.

Se recoloreaza cu albastru de metilen 2-3 minute, se spala cu apa curenta si se usuca. Se examineaza cu imersia.

Germenii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, ceilalti germeni si elementele celulare apar colorate in albastru. Proprietatea acido-alcoolo-rezistenta este caracteristica genului "Myobacterium" (bacilul tuberculos, bacilul leprei) si se datoreaza structurii particulare a peretelui celular, cantitatii mari de lipide pe care acesta le contine si in special acidul micolic.