Semnalizarea prin Wnt/Frizzled

Semnalizarea prin Wnt/Frizzled

Proteinele Wnt fac parte dintre factorii de secretie care intervin in semnalizarea intercelulara in timpul dezvoltarii embrionare, alaturi de FGF (Fibroblast Growth Factor), TGFβ (Transforming Growth Factor β) si proteinele Hedgehog. Aceste interactiuni sunt importante pentru orientarea celulelor, polaritatea organismului sau a unor segmente ale acestuia, morfogeneza, migrarea celulara si alte aspecte ale cresterii si dezvoltarii.

Experimentele efectuate pe Drosophila, Caenorhabditis, Xenopus, soarece au demonstrat ca proteinele Wnt, o familie mare de glicoproteine secretate, bogate in cisteina, participa ca molecule-semnal la aproape toate procesele dezvoltarii organismelor animale. De aceea sunt considerate factori morfogeni.

Wnt sunt formate din 350-500 aa si se intalnesc la toate speciile animale cuprinse in taxonii de la nematode la mamifere. Identitatea de secvente este de cel putin 18% si include un tipar care contine 23-24 resturi de cisteina. Unele dintre aceste glicoproteine se gasesc in MEC, iar altele in citosol. Nu se cunosc detalii privind structura proteinelor Wnt.

Secretia Wnt necesita prezenta genei porcupine, care codifica o proteina cu 8 domenii transmembranare, localizata in membrana RE. Un argument in favoarea acestei observatii este faptul ca la Drosophila, mutantii pentru porcupine au acelasi fenotip ca si mutantii pentru Wnt. Nu se cunoaste mecanismul prin care proteina porcupine actioneaza asupra secretiei Wnt. Proteinele Wnt isi exercita actiunea, intr-o maniera dependenta de concentratie, nu numai asupra celulelor in care sunt exprimate, ci si asupra altor celule aflate la oarecare distanta si care nu secreta Wnt. Stabilitatea si distributia Wnt depinde de densitatea receptorilor lor membranari.

Wnt pot fi grupate in doua clase: Wnt-1 si Wnt-5a, in functie de activitatea lor. Clasa Wnt-1 cuprinde proteinele Wnt-1, Wnt-3, Wnt-3a si Wnt-8. Clasa Wnt-5a cuprinde Wnt-4, Wnt-5a si Wnt-11. Mai bine studiate sunt proteinele din prima clasa, ale caror roluri au fost descoperite prin studierea mutatiilor genelor Wnt.

Tabelul 1. Fenotipurile mutatiilor genelor Wnt la soarece

In metanefros (tesutul din care iau nastere organele genitale) exista canalele Wolf, din care se vor forma la masculi caile spermatice si canalele Muller, din care se vor forma la femele organele genitale interne, cu exceptia ovarului. Ambele tipuri de canale sunt dezvoltate la embrionii umani pana in saptamana a 8-a (inainte de care sexul copilului nu se poate determina). Apoi canalele Muller regreseaza la masculi si canalele Wolf regreseaza la femele.

Majoritatea proteinelor Wnt secretate sunt asociate cu suprafata celulei si cu MEC. Proteoglicanii heparansulfati leaga Wnt de suprafata celulei sau de MEC; astfel moduleaza semnalizarea prin Wnt, limitand difuzia moleculelor si facilitand astfel asocierea lor cu receptorii.

Receptorii membranari pentru Wnt sunt proteinele Frizzled (Fz) (plansa 64, fig 108). Fac parte din receptorii 7-TM si au un domeniu mare extracelular la capatul N-terminal (CRD - cysteine rich domain), care leaga Wnt. La Drosophila, pe langa Frizzled mai exista un receptor: Dfz2. Prezenta ambilor receptori reprezinta un exemplu de redundanta genetica, deci pentru a se obtine organisme lipsite de semnalizarea prin Wnt trebuiesc eliminate ambele gene.

Proteine extracelulare care interactioneaza cu Wnt

In mediul extracelular, Wnt mai poate interactiona cu (plansa 65, fig. 110):

- WIFs (Wnt Inhibitory Factors)

- FRPs (Frizzled Related Proteins) - proteine secretate care contin un domeniu CRD similar cu cel al Frizzled, dar fara segment transmembranar. La Xenopus, moleculele de tip FRP functioneaza ca antagonisti ai factorului de ventralizare XWnt-8, pe care il leaga si inhiba interactiunea sa cu receptorii membranari.

- Cerberus - un factor de inductie la Xenopus

- Heparan sulfati - faciliteaza legarea Wnt de receptori.

Calea de semnalizare initiata de Wnt a fost descrisa pe baza exprimarii fenotipice a genotipurilor mutante si se bazeaza pe formarea a doua complexe multiproteice, unul citosolic si unul nuclear (plansa 64, fig. 109).

Proteina citosolica Dishevelled (Dsh) nu se conecteaza direct cu complexul citosolic care cuprinde, la Drosophila:

- proteina Armadillo (Arm) - omologul β-cateninei de la vertebrate;

- enzima Zeste-white3 (Zw3) - omologul GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase 3) de la vertebrate.

La vertebrate, complexul citosolic mai contine proteinele Axina si APC (Adenomatous Polyposis Coli). In absenta Wnt, Arm, Axina si APC sunt in forma inactiva, fosforilata.

Complexul nuclear este format din TCF (T-Cell Factor), o proteina care leaga ADN si care este tinuta in stare inactiva prin interactiunea cu factorii represori ai transcrierii Groucho si CBP (CREB-Binding Protein).

Fixarea Wnt la receptorul Frizzled declanseaza o secventa formata din doua etape succesive:

. Complexul citosolic interactioneaza cu Dsh si elibereaza Arm (β-catenina).

. Arm (β-catenina) patrunde in nucleu si activeaza TCF, initiind transcrierea.

Calea de semnalizare prin Wnt la soarece este prezentata in plansa 65, fig. 110.

1. Complexul citosolic interactioneaza cu Dsh si elibereaza Arm (β-catenina).

Proteina Dishevelled (Dsh) este o proteina citosolica inalt conservativa - la Drosophila si la soarece, exista multe secvente omoloage. Prin Dsh semnalul Wnt este transmis complexului citoplasmatic. Nu se cunoaste mecanismul de actiune al Dsh, dar se presupune ca [Wnt-Fz] ar interactiona cu o proteina G, fapt deocamdata nesustinut de dovezi biochimice sau genetice. Se stie doar ca unii receptori, la interactiunea cu molecula-semnal, determina un puls de Ca²⁺. Nu exista dovezi ca Dsh ar interactiona direct cu receptorii (Fz).

Dsh contine cateva motive care seamana cu cele din alte molecule de semnalizare: domeniile PDZ, DIX (asemanator cu un domeniu din Axina) si DEP. Este o proteina fosforilata, care sub influenta complexului [Wnt-Fz] devine hiperfosforilata. Este posibil ca Dsh sa interactioneze direct cu Axina, prin domeniile lor similare.

Zw3/GSK-3 este o protein kinaza care poate inhiba prin fosforilare 3 componente ale complexului citoplasmatic: Axina, Arm (β-catenina) si APC. Este la randul ei inhibata de Wnt, care astfel activeaza substraturile inhibate de enzima.

GSK-3 a fost descrisa initial ca enzima reglatoare in metabolismul glicogenului, unde inactiveaza prin fosforilare glicogen sintetaza. Calea de semnalizare prin care insulina stimuleaza sintezele proteice si depunerea glicogenului implica inhibarea GSK-3 (plansa 66, fig. 111). In prezent se stie ca GSK-3 este implicata intr-o serie de alte procese celulare: semnalizarea prin factori de crestere, specificarea diferentierii celulare in dezvoltarea embrionara, controlul diviziunii celulare, apoptoza, formarea microtubulilor.

Armadillo/β-catenina. Armadillo este similara cu proteinele β-catenina si placoglobina de la vertebrate, care se fixeaza pe E-caderina si leaga complexele de adeziune la citoschelet. Wnt regleaza nivelul intracelular al Arm posttranscriptional, determinand acumularea ei in citosol si in nucleu; in prezenta Wnt, creste stabilitatea Arm. Acelasi efect de acumulare a Arm se obtine prin inactivarea Zw3/GSK-3. Aceasta kinaza fosforileaza Arm/β-catenina, o destabilizeaza si promoveaza intrarea ei prin ubiquitinare in calea de degradare a proteasomilor. Acest fapt este sustinut de prezenta unor proteine F-box, care colaboreaza cu enzima E₃ (ubiquitin-ligaza) in marcarea proteinelor in vederea degradarii.

Axina formeaza o 'punte' intre Zw3/GSK-3 si Arm/β-catenina, deoarece se poate fixa pe ambele proteine, prin domenii de legare diferite (plansa 67, fig. 112). De asemenea, prin domeniul sau RGS (Regulator of G-protein Signalling), poate fixa APC. Are un motiv comun cu Dsh (domeniul DIX), ceea ce sugereaza o posibila asociere cu Dsh pentru a forma heterodimeri.

In complexul cu Arm/β-catenina, Axina promoveaza fosforilarea acesteia de catre Zw3/GSK-3. Pierderea Axinei din complex va duce la stabilizarea si acumularea Arm/β-cateninei, determinand transcrierea unor gene-tinta. Lipsa genei pentru Axina la soarece este o mutatie care se exprima fenotipic prin duplicarea axei longitudinale a corpului.

Axina poate sa fie fosforilata de Zw3/GSK-3, in aceasta forma legand mult mai bine Arm/β-catenina. Semnalizarea prin Wnt duce la defosforilarea Axinei, prin inhibarea Zw3/GSK-3; astfel Axina pierde legatura cu Arm/β-catenina, care nu mai este substrat pentru kinaza.

APC poate prezenta forme mutante care declanseaza cancere, mai ales colorectale. Celulele care contin APC mutant au niveluri crescute de Arm/β-catenina. Transfectia acestor celule cu APC normal reduce semnificativ nivelul β-cateninei. De aici s-a tras concluzia ca    si APC are rol in degradarea β-cateninei. Se presupune ca GSK-3 destabilizeaza β-catenina prin fosforilarea APC.

Un model posibil pentru segmentul citosolic al caii de semnalizare prin Wnt:

2. Arm (β-catenina) patrunde in nucleu si activeaza TCF, initiind transcrierea.

A doua etapa majora a semnalizarii prin Wnt este translocarea β-cateninei in nucleu, unde actioneaza asupra complexului represor al transcrierii TCF-Groucho-CBP. Nu se cunoaste mecansmul prin care, datorita fixarii Arm/β-cateninei, acest complex devine din represor, activator al transcrierii.

Genele-tinta pentru complexul TCF-Arm/β-catenina sunt numeroase; mai bine cunoscute pana in prezent sunt genele Ubx si engrailed la Drosophila, siamois la Xenopus, c-myc si cyclin-D1 la mamifere.

Aspecte ale implicarii semnalizarii prin Wnt in dezvoltare

1. Dezvoltarea rinichiului. Wnt-11, Wnt-7b si Wnt-4 controleaza diferite etape ale tubulogenezei precum si formarea epiteliului tubilor renali.

2. Dezvoltarea sistemului nervos central. Wnt-1, care interactioneaza cu factorii de transcriere En1 si En2, precum si Wnt-3a sunt implicati in dezvoltarea diencefalului, trunchiului cerebral si maduvei spinarii.

Wnt-2b, Wnt-3a si Wnt-5a actioneaza in telencefal, controland formarea cortexului cerebral. Wnt-7a intervine in cerebel, in formarea celulelor granulare precum si in etape ulterioare ale dezvoltarii: remodelarea axonilor, concentrarea sinapsinei I si formarea sinapselor in zona remodelata.

3. Gastrulatia la embrionul de soarece implica participarea Wnt-3a, pentru stabilirea axului anteroposterior, formarea mugurelui codal si formarea somitelor de-a lungul axelor dorsoventrala si mediolaterala. Formarea membrelor si stabilirea dimorfismului sexual sunt guvernate de Wnt-7a si Wnt-4.

4. Formarea foliculilor pilosi, mustatilor si dintilor sunt controlate de Wnt-10b. S-a observat ca foliculii pilosi sunt mai numerosi daca printr-o mutatie este sintetizata o β-catenina N-truncata (fara situsurile de fosforilare) care este stabilizata in mod constitutiv. Dar in acest caz lipseste orientarea foliculilor intr-o singura directie (polaritatea planara) si apar tumori ale foliculilor.