Proprietati chimice ale acizilor nucleici

PROPRIETATI CHIMICE ALE ACIZILOR NUCLEICI

1. Interactiuni covalente. Reactii ale acizilor nucleici cu molecule mici

Studiile referitoare la actiunea unor compusi chimici cu molecula mica asupra acizilor nucleici se axeaza in special pe reactiile chimice produse intre nucleotidele componente ale catenei si moleculele reactante; sunt inca putine date referitoare la modificarile produse asupra structurii secundare sau tertiare.

De multe ori, studiile au fost realizate chiar la nivelul nucleotidelor libere, rezultatele obtinute fiind extrapolate la nivelul oligo- sau acidului nucleic.

Hidroliza nucleozidelor, nucleotidelor si acizilor nucleici

In solutii acide si, mai ales, bazice, la temperaturi ridicate acizii nucleici pot suferi reactii de hidroliza. Legaturile fosfoesterice sunt mai stabile - mai ales in cazul ADN, in schimb, legaturile N-glicozidice sunt mai labile. Nucleozidele purinice sunt mai labile, si, oarecum surprinzator, deoxiribonucleozidele sunt mai sensibile fata de ribonucleotide. Eliminarea bazelor azotate se poate realiza si in cazul acizilor nucleici.

Resturile dA si dG sunt depurinate prin fierbere in acid clorhidric 1N, in timp ce rC si rU necesita utilizarea acidului percloric 12M.

Interesant este faptul ca legatura glicozidica din ARN este de cca. 3 ori mai stabila, desi ARN are un procent mai ridicat de monocatena (monocatenele ADN sunt mai sensibile la factorii externi).

Procesul este puternic dependent de pH, fiind mai accentuat pentru bazele purinice (deoxiadenozina - dA si deoxiguanozina - dG) comparativ cu bazele pirimidinice (deoxicitidina - dC sau deoxitimidina - dT); la pH neutru frecventa este foarte redusa; de asemenea, procesul este dependent de temperatura.

Formarea de aducti nu este un proces rar; dimpotriva, frecventa este destul de ridicata (~1 baza mutata/10² baze normale (pbN). Selectia realizata de ADN polimeraze reduce acest raport la 1 baza mutata/10³-10⁵pbM, procentul este diminuat si de prezenta enzimelor de reparare, astfel ca, comcentratia bazelor modificate este, de regula <10⁷.

Prezenta aductilor poate sensibiliza legatura N-C, in special in cazurile in care aductul se formeaza in pozitiile 3 si 7 ale deoxipurinelor; sunt, de asemenea sensibile: O²-alchilcitidina, O²-alchil dC, O²-alchil T, in schimb, N⁶-metil-A si 5-metil C (care de altfel se gasesc in mod normal in structura ADN) sufera procese de hidroliza a legaturii N-C glicozidice cu aceeasi viteza ca si bazele normale.

1. Dezaminarea   

Dezaminarea hidrolitica decurge si in conditii fiziologice. In portiunile de dubla catena dezaminarea este mai rara. Dezaminarea C-N sau A-NX - daca nu sunt reparate, reprezinta evenimente mutationale (vezi reactii cu aciud azotos).

Dezaminarea bazei minore 5-Me-C cu formare de T are intotdeauna un aspect mutational intrucat T este o baza normala a ADN, si deci nereparabila.

1.3. Scindarea legaturilor fosfodiesterice

este caracteristica ARN, datorita prezentei gruparii -OH in pozitia 2' a ribozei, care favorizeaza o transesterificare (in cataliza bazica);

in stare naturala se pare ca hidroliza legaturilor fosfodiesterice din ADN este un proces rar, dar el devine semnificativ ca urmare a depurinarii / depiridimidarii. Viteza de reactie (k) pentru o scindare a legaturii fosfodiesterice este de 10⁴ ori mai mare (la un centru apurinic) fata de depurinarea in sine; in aceste conditii toate legaturile situate in vecinatatea unui centru apurinic sunt practic scindate, chiar in absenta unor endonucleaze. Rezulta astfel nucleotide legate prin punti pentozofosforice, care sunt insa relativ labile intucat pentoza poate fi eliminata prin actiunea unei amine secundare (ex. difenilamina), rezulta, in final, nucleotide legate prin punti fosforice.

Acizii nucleici pot fi hidrolizati in mediu acid (acid formic, la 170 ) cu afectarea redusa a bazelor.

In mediu bazic, ADN este rezistent la hidroliza, dar ARN este relativ usor hidrolizat.

Reducerea nucleozidelor

Atat purinele cat si pirimidinele au un caracter aromatic relativ pronuntat, astfel incat sunt rezistente la reactia de reducere. Totusi, in conditii nu foarte energice, in prezenta de catalizatori de rhodiu, uridina sau timina sunt transformate in 5,6-dihidropirimidina; la acelasi compus se ajunge prin reducerea cu borohidrura de sodiu la UV; la intuneric, reactia continua cu scindarea ciclului.

Prin reactia Barton, cu hidrura de tributil-staniu, ribonucleozidele sunt transformate intr-un amestec de 2'- si 3'-deoxiribonucleotide, care apoi pot fi separate.

Se pot obtine si dideoxinucleozide, utile pentru analiza secventiala a acizilor nucleici.

Se pare ca, compusii rezultati sunt utili in terapia anti-SIDA.

3. Reactia de oxidare

In general, bazele sunt degradate de agentii oxidanti energici (ex. KMnO₄).

Peroxizii (H₂O₂ si R₂O₂) transforma adenozina in N-1 oxidul corespunzator si citidina in N-3 oxid.

Tetraoxidul de osmiu scindeaza legatura dubla 5,6 a timidinei cu formarea unui ester ciclic de osmiu; reactia a fost utilizata pentru studiul structurilor cruciforme ale ADN.

Hipocloritul de sodiu oxideaza guanina la 8-hidroxiguanina.

In ceea ce priveste pentozele, acestea sunt sensibile la actiunea agentilor radicalici (ex. cei generati de H₂O₂ in conditii fotochimice). Alti agenti (ex. acidul periodat) scindeaza legatura 2'-3' cu formarea unei dialdehide, care poate fi stabilizata prin reducerea la dioli, prin reactia de condensare cu amine sau nitrometan rezulta structuri noi, cu formarea unui nou heterociclu:

Procedeul a fost utilizat pentru blocarea capatului 3'-terminal, care devine rezistent la degradarea cu 3'-exonucleaze.

5. Reactii cu agenti nucleofili

In general, agentii nucleofili ataca resturile pirimidinice ale acizilor nucleici la atomii C-6 si C- In cazul purinelor, pozitiile C-6 si C-2 ale adeninei sunt mai rezistente.

Printre agentii nucleofili utilizati se numara hidrazina, hidroxilamina si bisulfitul.

Hidrazina reactioneaza cu pirimidinele intai la C-6 si apoi la C-4. Are loc o aditie la C-6 urmata de mai multe etape succesive, heterociclul se micsoreaza; rezulta pirazol-2-ona si respectiv 3-aminopirazol. In acelasi timp se scindeaza legatura N-glicozidica, zaharidul fiind transformat in N-riboziluree si apoi in ribozilhidrazina.

Reactiile au fost utilizate in metoda Maxam - Gilbert de secventiere a ADN, in acest caz din riboza rezulta un derivat bisfosforic 3'5', care prin tratarea cu piperidina elimina ambele resturi fosforice.

In conditii blande, la pH neutru, citosina si nucleozidele ei reactioneaza cu hidroxilamina, semicarbazida sau metoxilamina, cu formarea de compusi N⁴ substituiti; reactia are mai multe etape:

Datorita tautomerismului amino - iminic, derivatul rezultat poate forma legaturi "neuzuale" cu adenina, reactia reprezentand astfel un eveniment mutagenic.

Tot ca o aditie la C-6 al C sau U reactioneaza si anionul bisulfitic; reactia este insa reversibila. heterociclul nearomatic rezultat poate participa la diverse reactii:

transaminarea gruparii -N⁴ a citozinei;

schimbul izotopic al H5;

dezaminarea citozinei cu formare de uracil:

Aceasta reactie explica caracterul mutagen si citotoxic al ionului bisulfit.

6. Reactii cu agenti electrofili

6.1. Halogenarea

Uracilul, adenina si guanina reactioneaza direct cu clorul si bromul, cu formare de 5-cloro- (bromo-) uridina si, respectiv 8-cloro- (bromo-)purine. Reactia cu fluorul este mai greu de controlat, totusi in conditii atente, fluorul gazos dizolvat in anhidrida acetica, poate fi utilizat la fluorurare; rezulta 5-fluorouracil (utilizat ca agent anticancerigen) sau 5-fluorouridina.

Derivatii iodurati (ex. 5-iodouridina) ser obtin prin reactia iodului cu 5-mercur- sau 5-paladiu-uridina.

6. Agenti electrofili cu azot

Reactia cu acidul azotos conduce la inlocuirea gruparilor aminice cu grupari hidroxil (cetonice in structura lactam):

In toate cazurile, rezulta compusi care conduc la imperecheri "neuzuale", tranzitiile dA: dT→dI: dC si respectiv dC: dG →dU: dA fiind caracteristice pentru efectul mutagen al acidului azotos.

O categorie extrem de importanta de agenti electrofili este cea a agentilor cancerigeni. Cea mai acceptata teorie care incearca sa explice actiunea agentilor cancerigeni chimici este cea elaborata de Jerina, potrivit careia un cancerigen chimic trebuie sa genereze o specie electrofila capabila sa atace nucleotidele. Specia electrofila poate fi genarata direct, de catre cancerigenii directi sau pot fi generati de "cancerigenul final", compus chimic rezultat prin metabolizarea enzimatica a cancerigenilor indirecti.

Una dintre cele mai importante categorii de specii electrofile este cea de tip ion amoniu, rezultati din derivatii de hidroxilamina, formati la randul lor prin oxidarea aminelor aromatice sau prin reducerea partiala a nitroderivatilor, ambele reactii fiind realizate prin actiunea citocromilor P-450.

Speciile electrofile rezultate reactioneaza cu resturile purinice din ADN fie la C-8 fie la N-7.

Efectul cancerigen al derivatilor aromatici cu azot a fost evidentiat inca din anul 1890, in cazul unor muncitori de la o fabrica de coloranta azoici din Basel; ulterior au fost depistati zeci, chiar sute de compusi chimici cancerigeni sau suspect cancerigeni. Ca o conditie obligatorie se considera existenta unei etape numita "initiere", care se realizeaza prin formarea unor combinatii covalente, denumite "aducti -ADN

Formarea "cancerigenilor finali" in cazul celor indirecti presupune participarea unor sisteme enzimatice complexe: citocromi P450, epoxi-hidrolaze, glutation S-transferaze, UDPG-glucuronil transferaza, sulfotransferaze si altele. Reactiile au ca scop eliminarea - detoxifierea - compusilor exogeni si, in buna masura, a unora endogeni. Formarea unor specii electrofile - carbocationii sau a unor ioni de amoniu, sulfoniu - capabile sa reactioneze cu nucleotidele componente ale acizilor nucleici conduce la initierea procesului de cancerizare.

Unul dintre cei mai cunoscuti cancerigeni cu azot este 2-acetilaminofluorenul, care poate fi metabolizat in diverse moduri:

Se observa ca peste 90% din produsii de reactie sunt produsi de detoxifiere, dar un procent redus genereaza specii N⁺, care ataca dG la C-8 sau C⁺, care ataca dG la N², cu formare de aducti.

Simultan reactioneaza si alti derivati aminici sau azoderivati ce sunt transformati in amine prin reducere:

In timp au fost identificati mai multi derivati cu azot cu caracter cancerigen (amine aromatice heterociclice) generati in cursul procesului de preparare a hranei; acestia sunt formati din triptofan si glutamina.

Prin piroliza, ei genereaza aducti la C-8. Aceiasi compusi au fost izolati si din fumul de tigara - peste 80 mg dintr-o singura tigara.

Compusi potential cancerigeni sunt si nitroderivatii, care genereaza specii electrofile prin reducere.

6.3. Reactii de alchilare. Agenti electrofili cu carbon

O alta categorie impotante de agenti cancerigeni sunt cei capabli sa genereze specii electrofile la atomul de carbon si care apoi formeaza aducti-ADN; sunt multe astfel de substante, dar cele mai cunoscute sunt hidrocarburile aromatice policiclice, cel mai studiat compus din aceasta clasa fiind benzo(a)pirenul (BaP).

Alaturi de aducti, ADN poate suferi si alte modificari, rezultate fie ca urmare a unor modificari chimice (dimeri intra- sau inter-catenari, fotodimeri, di-asucti), fie fizice (in special - intercalari, ce vor fi prezentate in capitolul urmator). In etapele urmatoare, se product alte modificari: depurinari / depirimidari si - cele    mai importante prin consecinte - mutatii (punctiforme sau extinse).

Benzo(a)pirenul sufera mai multe reactii de oxidare, hidroliza si conjugare (sub actiunea unor sisteme enzimatice de detoxifiere - cele mai importante fiind: P450 si GST) o schema foarte simplificata fiind prezentata mai jos.

Exista mai multi cancerigeni finali; izomerul major fiind ( anti benzopiren diol epoxid (+ anti BPDE sau BPDE).

Desi procesul pare complicat, in realitate, el nu este altceva decat o reactie de alchilare - o reactie de introducere a unor radicali alchil in moleculele nucleotidelor din catena ADN sau ARN; cum insa studiul aductilor rezultati prin reactia cu acizii nucleici este destul de dificil, numeroase studii au fost realizate pe baze libere, nucleozide sau nucleotide, rezultatele obtinute fiind extrapolate pentru acizii nucleici.

Exista doua categorii de agenti alchilanti:

directi;

indirecti, care necesita activare metabolica.

In ambele cazuri, atacul este realizat de specii R-C (carbocationi).

In ce priveste localizarea atacului, exista mai multe teorii care incearca sa identifice atomul la care are loc reactia:

teoria acizilor si bazelor tari si slabe;

calcule de mecanica cuantica;

alte teorii tin cont de aspecte sterice.

In principiu, toti atomii de azot si oxigen, (bineinteles cu exceptia N-9 din purine si N-1 din pirimidine, care sunt legati de zaharide), ca si unii atomi de carbon - ex. C-8 din purine - pot reprezenta centre de alchilare pentru nucleotide.

Electrofilii "slabi" (moi = soft), cum sunt dimetilsulfatul (DMS), metil-metan-sulfonatul (MMS) si halogenurile de alchil (ex. MeX) reactioneaza printr-un mecanism S_N

Atomii mai sensibili la atac sunt cei de azot, in ordinea: N-7(G), N-1 (A), N-3(C), N-3(T). Un parametru esential al "moliciunii" este raportul foarte scazut de metilare O6(G): N-7(G), care are valori de 0,004:1.

In ADN dublu catenar, metilarea are loc indeosebi la N-3(A).

Electrofilii tari, ca de exemplu N-metil-N-nitrozo-ureea (MNU), sau etil- nitrozo-ureea (ENU) actioneaza prin mecanism S_N¹. Cu acesti agenti electrofili aprox. 50% din reactia de alchilare se realizeaza la restul hidroxilic din gruparea fosforica, dar poate ataca si O⁶(G), N-7(G) (raport 0,08:1 in ficat si 0,15:1 in creier), O²(T), O⁴(T) si O²(C).

Se pare ca in cazul agentilor de alchilare derivati nu sunt atacati atomii de carbon ai nucleotidelor. Printre cei mai studiati agenti de alchilare indirecti, se numara hidrocarburile aromatice policiclice.

Exista numeroase teorii referitoare atat la modul de activare cat si la modul de atac asupra nucleotidelor sau acizilor nucleici, ca si a consecintelor formarii aductilor. Una dintre cele mai acceptate teorii (Jerina), apreciaza ca efectul cancerigen maxim se produce daca legarea agentului electrofil la nucleotide se realizeaza la unul dintre atomii de carbon situati in regiunile "golf" sau "fiord" ale nucleotidelor.

Dupa formarea cancerigenului final, acesta genereaza speciile electrofile, de ex. in cazul BaP:

Principalii aducti generati de acest carbocation sunt la N²(G), N-7(G), O⁶(G), si N⁶(A). Formarea acestora este favorizata de intercalarea BPDE in secventele bogate in nucleotide AT ceea ce poate fi evidentiat printr-o deplasare spre rosu a maximelor de absorbtie ale hidrocarburii sau printr-un spectru CD negativ.

Rezulta doua categorii de aducti:

I - care nu modifica structura normala a catenei;

II - formati in santul minor, cu formarea unor structuri intercalate in forma de lama.

Rezultate similare au fost obtinute si cu alte HPA, cum ar fi: crisenul, DMBA, BA si altele; exista insa si unele exceptii: diol epoxidul format de 3-MC se pare ca este prea voluminos pentru a reactiona cu ADN.

Exista si alti compusi care pot genera specii electrofile, inclusiv de origine naturala. Astfel aflatoxinele - in special aflatoxina B1 care in concentratie de 1 ppm da cancer de plamani, rinichi, colon la sobolani generata de Aspergillus florus formeaza aducti cu guanina (N-7).

Reactii similare dau si agentii electrofili de tip ion amoniu.

6.4. Agenti bifunctionali

Agentii de alchilare bifunctionali contin doua resturi alchilante. Intre acestia cei mai cunoscuti sunt:

azot iperite: RN(CH₂CH₂Cl)₂    ex:

sulf iperitele: S(CH₂CH₂Cl)₂    ex:

derivatii de uree: OC(NH(CH₂)_nCl sau nitrozouree.

Acestia dau legaturi "incrucisate" intre doua baze situate in cele doua catene ale ADN. Cele mai cunoscute cazuri sunt puntile de 5 atomi realizate intre atomii N-7 a doua resturi de guanina sau intre N-1(A) si N-3(C):

Spre deosebire de cazurile anterioare, cand functionalitatea ADN se poate pastra, sau se pastreaza modificata, in cazul aductilor intercatenari, exprimarea ADN este in cele mai multe cazuri blocata.

7. Reactia cu formaldehida

Formaldehida reactioneaza indeosebi cu ribonucleotidele. Reactia decurge mai intai cu N⁶(A) (major) sau cu N²(G) (minor). Aductii primari astfel formati reactioneaza cu o adoua grupa aminica dintrun alte nuleotid, fie din aceeasi catena (ARN, ADN), fie din catena contra-laterala (in special in cazul ADN), cu formarea unor punti metilenice. Astfel resturi dinucleotidice pAdo-CH₂- pAdo, pAdo-CH₂- pGna, pGna-CH₂- pGna au fost izolate dupa tratarea ARN cu formaldehida urmata de hidroliza bazica; structuri similare rezulta si cu deoxinucleotide:

Nu este insa clar mecanismul prin care se realizeaza efectul mutagen.

8. Reactia cu cloroacetaldehida

Cloroacetaldehida imbina reactivitatea formaldehidei cu cea a halogenurilor de alchil:

ClCH₂-CHO

Reactioneaza cu resturile de adenina si citozina pe care le transforma in eteno-derivati care contin un ciclu suplimentar.

Aceste baze modificate sunt puternic fluorescente; reactia a fost folosita pentru marcarea A si C.

9. Reactii cu atomi sau ioni metalici

Nucleotidele dau reactii si cu ionii metalici; astfel ionul Hg²⁺ (Hg(CH₃COO)₂ sau HgCl₂) poate inlocui atomul C-5 din uridina sau citidina. Derivatul organo-mercuric rezultat poate fi transformat in derivat organo-paladic, care la randul sau se poate utiliza pentru sinteza unor pirimidine C-5-substituite.

Compusii rezultati (alil, vinil, halovinil-uridine) au fost testati ca agenti antivirali. Aceiasi compusi sunt utilizati si intr-o varianta de secventiere rapida a ADN.

Un alt compus metalic care reactioneaza cu nucleotidele este cis-platinul (cisdiaminodicloro-platina) care se leaga cu N-7 din guanina si apoi se leaga de o a doua purina, fiind astfel unul dintre cei mai utilizati agenti anticancerigeni. Cisplatinul se leaga selectiv de secventa d(pGpG) si d(pApG), dar nu si de centre d(pGpA); rezulta legaturi intercatenare. Este posibila si formarea unor legaturi intre doua resturi de guanidina din aceeasi catena d(pGpNpGpG).

In cazul aductului intercatenar, cele doua baze formeaza un unghi aproape drept; se modifica astfel atat suprapunerea bazelor, cat si inperecherea normala dintre baze.

Este interesant faptul ca si izomerul trans se leaga similar celui cis, dar efectele biologice sunt mult mai putin pronuntate; se presupune ca aductii formatide izomerul trans sunt mult mai sensibili la actiunea enzimelor de reparare.

10. Reactii cu agenti anticancerigeni

Numerosi agenti anticancerigeni actioneaza asupra acizilor nucleici; printre cei mai folositi se numara agentii di-alchilanti. Desi, in timp, s-au dovedit a prezenta o anumita eficienta, totusi ele prezinta o serie de dezavantaje:

specificitate tumorala redusa;

ei insisi au caracter cancerigen, conducand la cancere secundare (iatrogene).

Din aceste motive se tinde spre inlocuirea lor cu alti compusi care sa elimine deficientele mentionate.

Aceasta noua generatie de agenti anticancerigeni formeaza intr-o prima etapa un complex fizic si apoi, compusi covalenti.

Intre acesti noi agenti anticancerigeni se numara antibiotice de tipul mitomicinei C, derivati de tipul diazepinelor sau spirociclo-propanului. Studiati initial ca agenti antibacterieni - inhiba sinteza ADN si ARN - ei s-au dovedit a fi si agenti anticancerigeni eficienti.

10.1. Antibiotice aziridinice

Antibioticele de tip aziridinic au fost izolate din Streptomices caespitones, cea mai eficienta fiind mitomicina C:

Printr-o serie de reactii - care includ reactii de reducere a ciclului chinonic si eliminarea unei molecule de MeOH - mitomicina C da reactii de alchilare in ordinea: O⁶(G)>N⁶(A)>N²(G); ea da reactii atat mono- cat si di-catenare (10:1); se pare ca legarea se realizeaza in special in santul major al ADN.

Prin mecanisme similare actioneaza si alte antibiotice cu efecte anticancerigene: adriamicina, daunomicina, bleomicina, si altele. S-a emis ipoteza potrivit careia actiunea tumor-specifica a acestor antibiotice s-ar datora potentialului de reducere superior al celulei tumorale comparativ cu cel al celulei normale.

11. Modificari fotochimice ale acizilor nucleici

Radiatia UV cu λ = 240 - 280 nm excita bazele pirimidinice C,T,U cu formarea unei stari excitate singlet care are un timp de viata de ordinul picosecundelor; desi foarte scurt, timpul de viata este insa suficient pentru generarea unor fotohidrati - compusi ce rezulta prin aditia apei la legatura 5-6 a pririmidinelor. Fotohidratul uridinei (U*) se deshidrateaza lent in solutii acide sau alcaline, dar este relativ stabil la pH neutru (t_1/2 = 9 h la 50 C).

Fotohidratul citidinei este mai putin stabil (t_1/2 = 6h la 20 C); el se poate deshidrata sau se poate dezamina cu formare de U* (aprox. 10%).

Intrucat randamentul reactiilor este redus, consecintele biologice sunt putin importante.

O alta reactie posibila este formarea de "fotoaducti" de tip ciclobuten, prin iradiere cu radiatii UV cu λ = 260 - 280 nm. Reactia este insa reversibila, la iradieri cu λ = 254 nm, dimerul se disociaza in monomeri.

Reactia de dimerizare este o cicloaditie de tip (2+2), avand loc preponderent la timina (>95% din ADN nativ), iar dintre cei 4 izomeri T-T posibili majoritar este izomerul cis-sin, intr-o structura solida (de tip "gheata"), in timp ce in solutie se formeaza aprox. 2% izomer trans-sin T-T (fata de total ADN nativ).

Studii de stereochimie au demonstrat ca, predominant, aductii T-T se formeaza intre doua baze vecine din aceeasi catena. Studiile RMN au indicat ca nu se produc modificari accentuate ale elicei, desi sunt afectate legaturile de hidrogen cu restul dA din catena opusa. Rezultatul RMN este insa in contradictie cu cel obtinut prin difractie cu raze X care a indicat ca izomerul trans - sin se formeaza preponderent in regiuni Z-ADN, cu afectarea puternica a structurii elicei.

Dimerii ce contin resturi de citozina sunt usor dezaminati, procesul reprezentand o alta posibilitate de tranzitie C→U

Au fost identificati si alti fotoaducti, formati si prin intermediul unor radicali, de ex. generati de restul metil din timina.

Reactii de fotoaditie

Fotodimeri si alti produsi de fotoaditie:

11.1. Fotoaducti psoralen-ADN

Psoralenii sunt derivati de tip cumarina care au fost mult utilizati in fitoterapia psoriazisului si a altor boli de piele. Ei se leaga de ADN printr-o succesiune de procese implicand o intercalare urmata de doua cicloaditii (2+2), fotochimice, rezultand astfel doi dimeri de tip ciclobutan. Tinta preferata este T, in secvente d(pTpA). Rezulta un stereoizomer cis-sin:

Studiindu-se un aduct format de psoralen la un octonucleotid d(GGGTACCC) s-a constatat ca se produce o distorsionare a catenei de tip B-ADN atat la aductii formati cu T cat si la cei formati cu A.

11. Fotoaducti purinici

Purinele sunt mai stabile comparativ cu pirimidinele, avand tendinta de a transfera excesul de energie la pirimidinele vecine din catena. Cand totusi reactioneaza, reactia se produce mai ales la C-8. La aceasta concluzie s-a ajuns prin:

identificarea unor compusi de substitutie C-8 formati prin reactia purinelor cu alcooli secundari (2-propanol) la iradiere UV sau g

iradierea UV a 8-bromo-adeninei sau -guaninei rezulta radicali purinici care formeaza aducti sau se aditioneaza la purine.

1 Efecte produse de radiatiile ionizante

Efectele produse de radiatiile ionizante: X, g, sau electroni de inalta energie asupra acizilor nucleici sunt importante (mutatii, deletii etc.), dar acestea se pare ca se produc indirect, prin intermediul unor radicali liberi (HO^. , H^.) sau electroni solvatati generati de radiatie. Radicalul HO^. extrage un atom de hidrogen din nucleotid (de obicei din restul glucidic) cu formarea unui nou radical ce poate forma in conditii aerobice, radicali peroxidici 1',2',4',5'.

S-a calculat ca, la fiecare 100 eV, se genereaza 27 radicali HO^. din care 6 reactioneaza cu pentozele, iar ceilalti cu bazele azotate.

Radicalii formati pot reactiona in continuare, rezultand diversi compusi in functie de structura radicalului peroxidic si a conditiilor de reactie. de ex. in conditii slab bazice (0,1M NaOH) rezulta urmatorii compusi:

In cazul afectarii bazelor azotate, rezulta un numar mare de cpmpusi (numai timina in conditii de iradierea generat 24 compusi).

13. Modificari structurale ale ADN ca urmare a generarii de aducti. Mutatii

13.1. Mutatii punctiforme

Actiunea toxica a multor compusi chimici - in special a agentilor cancerigeni - se realizeaza prin intermediul aductilor - compusi covalenti formati intre agentul toxic sau metabolitii acestuia si nucleotidele din catena ADN.

Compusi similari sunt generati si prin actiunea radiatiilor ionizante - dintre acestea cele mai importante fiind radiatiile UV - care conduc la legaturi covalente intercatenare.

Multi dintre acesti aducti sunt eliminati prin actiunea sistemelor enzimatice de reparare; sunt insa cazuri in care acestea sunt "depaste" astfel incat aductii conduc, initial la modificari structurale locale - mutatii punctiforme, care in anumite cazuri se pot extinde pe portiuni mai mari din molecula.

Modificarile "punctiforme" rezulta in special ca urmare a imperecherilor gresite. Datorita modificarilor structurale suferite de baza, se modifica numarul legaturilor de hidrogen dintre acestea, putandu-se astfel produce imperecheri neobisnuite, ex.: A:G, G:T si altele.

In cursul proceselor de replicare, fazele normale, recunoscute tocmai prin numarul legaturilor de hidrogen, sunt inlocuite cu altele; in functie de modul de inlocuire se disting: tranzitii si transversii.

Tranzitiile reprezinta modificarile in care bazele se inlocuiesc cu baze de acelasi tip: o purina inlocuieste o purina, in mod similar inlocuindu-se si pirimidinele. Inlocuirile se produc in mai multe replicari consecutive: in prima faza se produce o imperechere gresita, de ex. G:T, la urmatoarea replicare, baza T se imperecheaza normal T:A, ambele baze "normale" fiind inlocuite cu dubletul A:T. Tranzitii de acest tip au fost detectate in toate formele cristaline de ADN: A,B sau Z, ale unor oligonucleotide. De exemplu in dodecamerul d(CGCAAATTCGCG) sunt prezente imperecheri A:C.

In toate cazurile, imperecherile gresite sunt prezente perechi "wobble" avand legaturi glicozidice anti-anti. Este interesant ca modificarile conformationale ale helixului sunt reduse.

Transversiile reprezinta defectele caracterizate prin inlocuirea purinelor cu pirimidinele si invers, ex.: A:T→ C:G. Ele rezulta prin procese similare cu cele descrise in cazul aparitiei tranzitiilor, dar factorul generator este o imperechere gresita produsa intre baze de acelasi tip, cea mai studiata fiind G:A, observata in dodecamerul d(CGCGAATTAGCG), care contine o imperechere G(anti): A(sin) cu doua legaturi de hidrogen intre N1(G) - N7(A) si O⁶(G) - N⁶(A). Calculele efectuate au demonstrat ca aceasta imperechere conduce la modificari minore ale variantei B-ADN.

Au fost detectate si alte imperecheri de acelasi tip: G(anti) : A(anti) sau I(anti) : A(sin).

13. Insertii - deletii

Insertia reprezinta adaugarea a cel putin unei nucleotide intr-o secventa ADN, in timp ce deletia reprezinta procesul invers, de eliminare a cel putin unei baze.

Aceste fenomene pot fi generate prin diverse mecanisme. de exemplu, deletia poate fi determinata tot de producerea de aducti ADN, care, fiind instabili pot elimina baza - in special purina - fiind eventual, apoi eliminata si deoxiriboza.

Ca si in alte cazuri, modificarile conformationale ale catenelor ADN produse prin deletii sau insertii au fost studiate pe oligonucleotide. Ca urmare a deletiei sau insertiei, una dintre catene contine - cel putin - un nucleotid in plus. Studiile efectuate au demonstrat ca acesta poate fi situat in afara cilindrului helicoidal, dar poate fi si    "inghesuit" in interiorul acestuia.