ZEARALENONUL

ZEARALENONUL

Zearalenonul sau fuzariotoxina F-2 este o lactona a acidului rezorcilic elaborata de F. roseum (graminearum, culorum, equisetti, gibosum), F. moniliforme, F. tricinctum si alte specii de micete.

Efectul nociv cel mai evident al acestei micotoxine este estrogenic, ceea ce inseamna ca provoaca estru si cornificarea celulelor epiteliale vaginale la soricioaicele impubere. In experimentele efectuate sobolanite impubere, inoculate intramuscular cu    cantitati progresive de F-2 (20, 40, 160, 350 si 650 mg), s-a stabilit un raport direct proportional intre doza si intensitatea efectului estrogenic exprimat prin cresterea in greutate a uterului in raport cu sobolanitele martore.

S-a mai observat ca greutatea totala a sobolanilor inoculati cu doze mici (20 si 40 mg) a cresut fata de greutatea martorilor, in timp ce la doze mai mari acest fenomen nu a avut loc. Deci, in afara de efecte toxice, F-2 stimuleaza cresterea daca este folosita in doze mici. Bazati pe aceste constatari, unii autori au prelucrat toxina si au obtinut produse stimulante ale cresterii pentru animalele tinere. Se citeaza faptul ca la miei sporul in greutate a ajuns la sa fiecu 40% mai mare decat la martori.

Pentru speciile de Fusarium care o elaboreaza, F-2 este o substanta fiziologica cu un anumit rol in dezvoltarea sexuala a acestora. Compusi similari ca structura chimica cu F-2 au mai fost extrasi din Curvularia, Penicillium steckii Zaleski, P. expansum Link, Nectaria radicola si Monosporium.

Administrata in ratia permanenta a scrofitelor in varsta de 6 saptamani, F-2 provoaca edemul si rubefactia vulvei, prolaps vaginal, cheratinizarea celulelor epiteliale ale vaginului, hipersecretie vaginala, cresterea secretiei de lapte si a dimensiunilor ugerului, hipertrofia glandei mamare. Astfel de manifestari sunt evidente dupa 7 zile de la inceperea experientei.

Elaborarea zearalenonului este influentata de compozitia substratului pe care se dezvolta tulpina de Fusarium. Acest fapt rezulta din lucrarile experimentale efectuate de Cantini si colab. (1973), care au pregatit culturi de F. graminearum pe mai multe medii naturale: boabe de ovaz, de mei, grau, orez, orz, secara, seminte de floarea soarelui, de soia, de arahide, lucerna deshidratata si celuloza cu adaos de mediu Czapek, dupa care s-a procedat la extractie.

In acest scop, culturile au fost extrase la inceput in apa distilata intr-un omogenizator si centrifugate la 6000 rotatii/minut, timp de 20 minute. Dupa indepartarea extractului apos, rezidul a fost extras cu alcool etilic absolut in doua reprize. Extractul alcoolic concentrat de la volumul initial de 200 ml la 25 ml, a fost introdus in furaje, iar alcoolul din ele a fost evaporat la cald. Astfel de furaje au fost introduse in hrana soricioaicelor impubere in varsta de 19-20 zile. Dupa 76 ore, au fost sacrificate si examinate.

Efectul estrogenic, exprimat prin hipertrofia uterului, a avut loc numai la extractele pregatite pe culturi de ovaz, mei, orz, secara, floarea soarelui. Rezultatul cel mai surprinzator a fost reprezentat de lipsa efectului estrogenic al extractelor efectuate din culturile crescute pe grau, cu atat mai mult cu cat celelalte cereale cercetate au dat rezultate pozitive. Explicatia ar consta in lipsa in grau a unor substante necesare sintetizarii fuzariotoxinei (F-2) de catre F. graminearum sau in prezenta in grau a unor substante capabile sa inhibe sinteza micotoxinei estrogenice.

Extragerea curenta a zearalenonei se face din culturi pe porumb boabe, incubate timp de 2 saptamani la 22-260C si mentinute alte 6 saptamani la 10-120C. cultura uscata (umiditate intrinseca 15 %) se extrage cu aparatul Soxhlet timp de 16 ore cu clorura de metilen. Urmeaza evaporarea extractului pana ce se obtine o substanta siropoasa. Peste aceasta se adauga acetonitril si eter de petrol in parti egale, se separa cele doua faze cu palnia de separare. Fuzarotoxina din faza acetonitrilica se concentreaza prin evaporarea extractului. Substanta ramasa se preia cu cloroform si se determina cromatografic in prezenta de F-2 standard, sau pe sobolanite impubere.

Extragerea directa din probele de furaje bine macinate se poate realiza prin doua procedee:

1. Primul procedeu consta in amestecarea a 50 g proba cu 5 g chiselgur, la care se adauga 150 ml eter de petrol si se agita intens timp de 2-4 minute. Acest amestec se filtreaza prin hartie de filtru si produsul ramas pe filtru se spala de doua ori, cu cate 20 ml eter de petrol. Substanta ramasa si uscata se extrage, timp de 4 ore, intr-un aparat Soxhlet cu clorura de metilen sau cu cloroform. Dupa concentrare, extractul se trece printr-o coloana cu sulfat de sodiu anhidru, dupa care coloana se spala cu cloroform.

2. Cel de al doilea procedeu (rapid) consta in amestecarea a 50 g proba cu 5 g chiselgur, cu 90 ml cloroform si 10 ml apa. Acest amestec se agita 5 minute intr-un omogenizator de mare turatie, dupa care se separa fazele cu o palnie de separare.

In vederea cromatografiei in strat subtire, extractele obtinute prin ambele procedee se concentreaza la 10 ml sau, in caz de rezultat negativ, pana la 2 ml. Cromatografierea se face pe placi cu grosimea stratului de Kisselgel de 250 microni si inactivate la 105⁰C. Pe placa se pun 0,02 ml extract, paralel cu extractul de analizat amestecat cu F-2 (standard) si numai cu F-2 (standard). Placile se developeaza cu cloroform-etanol (96:4) si se citesc in lumina cu lungime de unda de 366 nm.

Determinarea semicantitativa se face prin compararea fluorescentei extractului de analizat cu diverse cantitati de F-2 (1,5; 10; 20 mg si chiar mai mult) dizolvate intr-un volum egal de cloroform. Continutul de F-2, raportat la 1000 g proba, se calculeaza dupa formula:

In care :

Sx = cantitatea de F-2 in extractul de analizat;

Ve = cantitatea de extract de analizat in ml;

Vk = cantitatea (in ml) extractului de analizat in ml depus pe placa;

M = cantitatea (in g) probei extrase;

Numarul obtinut in urma calculului este egal cu cantitatea de F-2 din furajul de analizat exprimata in mg sau ppm. Acest numar trebuie corectat cu niste coeficienti de recuperare valabili pentru conditiile de lucru din fiecare laborator.

Pentru aflarea acestor coeficienti, intr-un anumit sortiment de nutret se introduc cantitati cunoscute de F-2 (2, 4, 10, 20, 40, 50 ppm) si se determina prin metoda de extragere la cald sau prin cea rapida cat anume se poate decela.

Rezultatul obtinut pentru fiecare cantitate de F-2 si pentru fiecare dintre metode arata eficacitatea de decelare a F-2 in probele de furaje supuse analizelor si corespondente sortimentului de furaj pentru care s-au determinat indicii de recuperare.

In conditii naturale, F-2 si F-3, in asociatie cu alte micotoxine, provoaca forma clinica estrogenica de fuzariotoxicoza la porcin, la taurine si la alte specii.