MECANISME DE REZISTENTA BACTERIANA

MECANISME DE REZISTENTA BACTERIANA

Consideratii generale

Rezistenta fata de antibiotice defineste capacitatea unor bacterii de a supravietui si de a se multiplica in prezenta antibioticului, la concentratii la care acesta nu este toxic pentru organismul uman. Rezistenta bacteriana fata de antibiotice poate sa fie naturala sau dobandita. Variabilitatea genetica este esentiala pentru dezvoltarea rezistentei dobandite fata de antibiotice. Aceasta apare prin unul din urmatoarele mecanisme:

mutatii punctiforme la nivelul unei perechi de baze nucleotidice; ele pot sa modifice tinta de actiune a antibioticelor;

rearanjarea unor segmente de ADN bacterian prin inversiunea, duplicarea, insertia, deletia sau transpozitia unor secvente mai mari ale genomului bacterian (cromozomial sau extracromozomial). Aceste rearanjari sunt realizate prin intermediul unor elemente genetice specializate (transpozoni sau secvente de insertie), care au capacitatea de a se misca precum unitati independente de restul cromo cromozomului bacterian.

castigarea de ADN bacterian strain care este purtat de plasmide, bacteriofagi sau de elementele genetice transpozabile, ori castigarea unor secvente libere de ADN. Genele care codifica rezistenta la antibiotice au fost prezente in mediul natural de existenta al bacteriilor inainte de utilizarea antibioticelor in practica terapeutica. Presiunea de selectie exercitata de antibiotice asupra unei populatii bacteriene favorizeaza persistenta tulpinilor care au capacitatea de a rezista la actiunea antibioticelor. Aceste populatii bacteriene prolifereaza si raspandesc genele de rezistenta R la alte tulpini, initial sensibile. Dupa ce antibioticul este ridicat din mediu, bacteriile rezistente nu mai au avantaj de supravietuire comparativ cu microorganismele susceptibile. Astfel, genele de rezistenta tind sa fie pierdute in timp, dupa ridicarea antibioticului respectiv din mediu.

Pentru ca un antibiotic sa fie eficient, el trebuie:

- sa penetreze intr-o cantitate suficienta la nivelul 'tintei' sale de actiune;

- sa intalneasca 'tinte' moleculare capabile sa interactioneze cu antibioticul intr-o maniera care sa initieze efectul antimicrobian dorit;

- sa scape de inactivarea produsa de enzime bacteriene.

Principalele 'tinte' de actiune ale antibioticelor aflate in uz terapeutic sunt:

- peptidoglicanul peretelui celular bacterian, polimer structural compus din subunitati alternative de N-acetilglucozamina si acid Nacetilmuramic, stabilizate prin punti incrucisate de D- si L-aminoacizi;

- mecanismul de sinteza proteica si in special ribozomul bacterian, care difera de structurile similare ale celulelor eukariote;

- compozitie chimica diferita fata de membranele celulelor umane;

- enzime ale metabolismului acizilor nucleici bacterieni, in special ADN-gyraza si ARN-polimeraza- ADN dependenta;

- enzime implicate in sinteza de acid folic, o cale absenta in celulele umane.

Mecanismele de rezistenta bacteriana pot sa intervina in oricare din aceste etape si sa afecteze eficacitatea antibioticului. Deoarece tintele multor antibiotice sunt situate in interiorul bacteriei, orice bariera in calea pene- trarii antibioticului prin peretele celular ii poate reduce activitatea; in unele cazuri, acumularea intracelulara a antibioticului este redusa printr-un mecanism activ de pompa de eflux, care va indeparta antibioticul deja patruns in celula. 'Tintele naturale' pot fi modificate intr-o maniera care sa reduca interactiunea efectiva cu antibioticul si sa impiedice astfel interferenta cu principalele activitati fiziologice bacteriene. Uneori, bacteriile pot utiliza cai biochimice alternative, care nu sunt sensibile la actiunea unui antibiotic si care scurtcircuiteaza functiile 'tintelor primare'. Bacteriile pot produce enzime care inactiveaza antibioticul. Frecvent sunt implicate doua sau mai multe mecanisme, fapt care determina niveluri mai mari de rezistenta bacteriana. Mecanismele de rezistenta bacteriana fata de principalele antibiotice aflate in uz terapeutic

A. Antibiotice care actioneaza asupra peretelui celular

BETALACTAMINE

Betalactaminele actioneaza primar ca inhibitori ai sintezei peretelui celular, prin blocarea actiunii transpeptidazelor. Proprietatile structurale ale betalactaminelor mimeaza secventa D-Ala-D-Ala, astfel incat aceste antibiotice actioneaza ca un fals substrat pentru Dalanil- D-alanil transpeptidaze. Betalactaminele reactioneaza cu reziduul de serina al transpeptidazelor (denumite si proteine care leaga penicilinele - PBP-uri), rezultand o enzima acilata, care este inactiva.Rezistenta la betalactamine poate sa apara prin:

1. Modificarea PBP-urilor

Rezistenta determinata de modificarea PBP-urilor apare prin mutatii la nivelul genelor cromozomiale, care codifica PBP-urile, prin castigarea de gene straine care codifica noi PBP-uri sau prin hiperproductia de PBP-uri normale (enterococi hiperproducatori de PBP5). Acest mecanism de rezistenta este important la cocii gram-pozitivi (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae) si este mult mai rar intalnit la bacteriile gramnegative. Un PBP modificat (PBP2a), operational, este implicat in rezistenta la meticilina a tulpinilor de Staphylococcus aureus si de Staphylococcus epidermidis. Rezistenta pneumococului la betalactamine este de origine cromozomiala si este determinata de modificarile calitative si cantitative ale PBP-urilor: lipsa PBP1a si 1b, aparitia unui nou PBP 1c, diminuarea afinitatii pentru PBP 2a, lipsa PBP 2b. Enterococii se caracterizeaza printr-o sensibilitate mai redusa la peniciline legata de prezenta PBP-urilor cu greutate moleculara mica si cu afinitate redusa pentru betalactamine. La bacteriile gramnegative 'pretentioase', rezistenta prin alterarea PBP-urilor este intalnita la unele specii de Neisseria si rareori la H. influenzae. La bacilii gram-negativi (BGN) 'nepretentio si', acelasi mecanism a fost descris la unele tulpini de Acinetobacter, Proteus si Ps. aeruginosa si determina extrem de rar rezistenta la imipenem.

2. Distrugerea (inactivarea) betalactaminelor

Cel mai important mecanism de rezistenta la betalactamine este productia de betalactamaze (blm.). Aceste enzime pot inactiva antibioticul printr-un mecanism hidrolitic (desfacerea legaturii amidice din inelul betalactamic) sau nehidrolitic (realizarea unei legaturi foarte puternice intre enzima si substrat, fara hidroliza). Atacul hidrolitic al unei betalactamine de o blm. este influentat de mai multi parametri care vor contribui la expresia nivelului de rezistenta a unei populatii bacteriene: afinitatea enzimei pentru substrat (Km), viteza de hidroliza (Vm), cantitatea de enzima biosintetizata, localizarea enzimei, difuziunea antibioticului prin membrana externa pentru a ajunge in contact cu enzima (cripticitate), tipul de enzima. Blm. pot fi codificate cromozomial, plasmidic sau prin intermediul transpozonilor. Blm. bacteriilor gram-pozitive sunt inductibile, sunt excretate extracelular si hidrolizeaza preferential penicilinele. Genele care determina productia acestor blm. se gasesc de obicei in plasmide mici sau in transpozoni.

2.1. Betalactamazele cromozomiale

Sunt produse de aproape toti BGN si au o activitate foarte redusa, determinata de existenta unei gene codante pentru un represor, care limiteaza sinteza blm. Expresia acestei enzime este in mod natural reprimata de gena-represor. Se poate produce o ridicare a represorului in doua circumstante:

- prin mutatii (frecventa de aparitie de circa 10-7), producand o stare dereprimata, stabila si ireversibila (mutant hiperproducator constitutiv; situatie intalnita la tulpini de E.coli);

- in prezenta inductorului, care neutralizeaza temporar represorul. Se produce o dereprimare reversibila sub efectul inductorului, reprezentat de unele betalactamine (la tulpini de Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia si Ps. aeruginosa). Ridicarea represorului determina biosinteza la nivel inalt de blm. cromozomiale, care devin astfel de 100-1.000 de ori mai abundente. Aceasta productie de blm. in cantitate mare in spatiul periplasmatic poate sa-si exercite puterea hidrolitica, daca betalactamina este sensibila la hidroliza sau poate sa inactiveze antibioticul printr-un mecanism nehidrolitic.

2.2. Betalactamazele plasmidice

Toate blm. plasmidice sunt de tip constitutiv si sunt astazi cele mai preocupante pentru practica antibioticoterapiei cu betalactamine. Pot fi clasificate in sase tipuri:

a) Cu spectru larg Sunt responsabile de rezistenta la ampicilina si la cefalosporinele din generatia 1. Blm. plasmidice cele mai frecvent intalnite sunt TEM-1 la enterobacteriacee si Ps. aeruginosa, TEM-2 si SHV-1 la enterobacteriacee.

b) Oxacilinaze Principalul reprezentant este OXA-1 la enterobacteriacee si la Ps. aeruginosa.

c) Carbenicilinaze Hidrolizeaza preferential penicilinele anti-piocianic. Au fost descrise PSE-1 (este cea mai frecventa la Ps. aeruginosa), PSE-2, -3 si -4, BRO-1, -2, -3 (la Branhamella catarrhalis), CARB-3, -4, -5.

d) Cu spectru extins (ESBL) Au aparut prin mutatii ale blm. de tip TEM, SHV si OXA. Klebsiella pneumoniae este de departe specia cea mai frecvent

producatoare de ESBL; transmisibilitatea plasmidelor care codifica ESBL-uri a permis extinderea rapida a acestui tip de rezistenta si la alte enterobacteriacee, precum si la Ps. aeruginosa. Exista astazi peste 130 de derivate TEM, peste 50 de SHV si 12 de tip OXA. Sinergia dintre IBL si cefotaxima, ceftazidima sau aztreonam permite detectarea in vitro a tulpinilor producatoare de ESBL. Prin mutatii ale blm. de tip TEM, au aparut ESBL-uri care confera rezistenta la inhibitorii de betalactamaze (TRI). Aceste blm. sunt raspandite la tulpini de E.Coli, K. pneumoniae, C. freundii si P. mirabilis. Din fericire, prezenta concomitenta a re rezistentei la IBL si a ESBL-urilor este extrem de rara (combinatia pare sa fie incompatibila cu supravietuirea). ESBL-urile de tip CTX-M nu apar prin mutatii ale blm. de tip TEM sau SHV si au o activitate mai mare fata de cefotaxima. Au fost identificate peste 40 de astfel de blm. Alte tipuri de ESBL-uri mai rar intalnite, care predomina la tulpinile de Ps. aeruginosa si au o distributie geografica limitata, sunt: PER-1, VEB-1 si VEB-2, GES-1, GES-2 si IBC-2. PER-1 este frecvent intalnita si la tulpinile multirezistente de Acinetobacter. Toate aceste ESBL-uri sunt sensibile la actiunea acidului clavulanic.

e) Cefamicinaze Aceste enzime sunt produse de tulpini de K. pneumoniae sau de E. coli rezistente la cefamicine, cefalosporine din generatia a treia si la aztreonam. Ele sunt exprimate constitutiv, dar au proprietati similare cu ale cefalosporinazelor cromozomiale. Printre cele mai cunoscute cefamicinaze se numara CMY-1 si CMY-2, MIE-1, MOR-1, ACC-1, BIL-1, FEC-1, MIR-1.

f) Carbapenemaze plasmidice 2.3. Carbapenemaze Sunt blm. care hidrolizeaza carbapenemele. Sunt de doua tipuri: metaloenzime si nonmetaloenzime, codificate plasmidic sau cromozomial

3. Reducerea permeabilitatii peretelui bacterian

La BGN, porinele au un rol esential pentru patrunderea antibioticelor hidrofile, avand importanta numarul si tipul de porine, precum si caracteristicile antibioticului. Sunt favorizate moleculele mici: cefepima si carbapenemele. La Ps. aeruginosa, pierderea porinei Opr D conduce la rezistenta la imipenem (daca se asociaza si activitate betalactamazica); meropenemul ramane activ.

4. Efluxul betalactaminelor

Acest mecanism este important mai ales pentru Ps. aeruginosa, care prezinta cel putin patru sisteme de eflux. S-a demonstrat ca rezistenta la imipenem este determinata in principal de afectarea permeabilitatii peretelui bacterian, in timp ce rezistenta la meropenem apare intr-o etapa secundara si este dependenta de hiperexpresia efluxului de betalactamine.

GLICOPEPTIDE

Glicopeptidele inhiba stadiile finale ale sintezei peptidoglicanului prin legarea de portiunile terminale D-Ala-D-Ala ale precursorilor pentapeptidici. In final, se blocheaza ramificarea peptidoglicanului prin inhibarea activitatii transglicozilazelor si a transpeptidazelor. Rezistenta la glicopeptide apare prin substituirea acidului D-lactic in locul D-Ala terminal al pentapeptidului.

1. Rezistenta la glicopeptide a enterococilor poate fi divizata in 6 grupuri fenotipice distincte: A, B, C, D, E si G. Originea genelor Van enterococice este necunoscuta (gena VanA are o structura asemanatoare cu ligaza D-Ala-D-Ala de la Salmonella spp. sau E. coli).

2. Rezistenta la glicopeptide a stafilococilor este fenotipic diversa. Tulpinile de S. aureus rezistente la vancomicina au fost obtinute in vitro fie prin selectia de mutante rezistente, fie prin transferul (conjugare) genei VanA de la enterococi. Prima tulpina de stafilococ vancomicino-rezistent izolata in SUA continea gena VanA, probabil originara de la o tulpina de E. faecium. Aparitia tulpinilor de stafilococi cu sensibilitate intermediara la glicopeptide (GISA) este secundara sintezei accelerate a peretelui celular, care conduce la ingrosarea acestuia si la captarea cu afinitate crescuta a unor cantitati mari de vancomicina, aparand astfel tinta de actiune a antibioticului. Pneumococul a ramas sensibil la glicopeptide. A fost descrisa o tulpina de S. bovis rezistenta la vancomicina, care poseda gena VanB.

B. Antibiotice care actioneaza asupra sintezei de proteine

Ribozomii bacterieni cuprind:

- o subunitate 30S, care leaga ARNm si initiaza sinteza de proteine;

- o subunitate 50S, care leaga aminoacil-ARNt, catalizeaza formarea legaturii peptidice si controleaza procesul de elongatie. Situsurile principale identificate la nivel ribozomal sunt: situsul P (situs donor peptidil), la nivelul caruia este fixat lantul peptidic in crestere si situsul A (situsul acceptor aminoacil), la nivelul caruia se formeaza legatura peptidica.

AMINOGLICOZIDE

Aminoglicozidele perturba selectiv sinteza de proteine bacteriene din cauza legarii de subunitatea 30S ribozomala, afectand elongatia peptidului care se formeaza. Acest mecanism de actiune este complex, implicand inhibarea transferului peptidil-ARNt de pe situsul A pe situsul P si alterarea procesului de citire care controleaza acuratetea procesului translational. Ultimul proces conduce la terminarea prematura a sintezei de proteine. Efectele finale variaza in oarecare masura de la un compus la altul, fapt care poate explica diferentele in ratele de bactericidie. In membrana celulara pot fi inserate proteine aberante, fapt care determina o alterare a permeabilitatii si o stimulare ulterioara a transportului de aminoglicozide.

Rezistenta la aminoglicozide apare prin trei mecanisme:

- defecte de acumulare;

- modificarea tintei;

- sinteza de enzime inactivatoare.

1. Defecte de acumulare sau impermeabilitate Diminuarea partiala sau totala a porinelor de la nivelul membranei externe nu este implicata in aparitia rezistentei la aminoglicozide. Producerea unor lipopolizaharide modificate (Ps. aeruginosa) sta uneori la originea unei rezistente de nivel scazut. In schimb, toate procesele de la nivelul membranei interne care conduc la diminuarea activitatilor ce stau la originea acumularii aminoglicozidelor vor determina niveluri variabile de rezistenta.

2. Modificarile tintei Ele afecteaza proteinele ribozomale (mutatii ale genei rps) sau ARNr 16S (mutatii ale genei rrs). Au fost descrise la E. coli, H. influenzae, S. pneumoniae, E. faecalis, M. tuberculosis si afecteaza mai ales streptomicina si gentamicina.

3. Inactivarea enzimatica a aminoglicozidelor Enzimele care inactiveaza aminoglicozidele sunt de trei feluri:fosfotransferaze (APH), acetiltransferaze (AAC) si nucleotidiltransferaze (ANT). Fiecare clasa este subdivizata pe baza situsului mutatiei de la nivelul substratului si a specificitatii fata de substrat. Aceste enzime sunt capabile sa inactiveze aminoglicozide inrudite, fapt care nu este surprinzator avand in vedere structura lor chimica similara. Ele par sa fie localizate intracelular sau la nivelul membranei citoplasmatice. Rezistenta la aminoglicozide este larg raspandita si are o importanta clinica deosebita, fiind semnalata atat la bacteriile Gram-pozitive, cat si la cele Gram-negative. Se crede ca genele de rezistenta isi au originea in cele implicate in productia naturala de aminoglicozide de unele specii bacteriene. Aminoglicozidele de semisinteza au fost produse pentru a asigura protectia fata de aceste enzime. Daca initial bacteriile rezistente adaposteau doar una din cele cateva tipuri de enzime, astazi productia simultana a diferitelor tipuri de enzime a crescut, determinand rezistente multiple.

TETRACICLINE

Tetraciclinele inhiba legarea aminoacil-ARNt de situsul A al ribozomului. Proteinele 7S si 16S ale ARN prezinta cea mai buna afinitate pentru tetracicline si de aceea sunt principalele tinte farmacologice. Aceasta legare inhiba fixarea unui nou aminoacid-ARNt de ribozom. La concentratii mari, tetraciclinele se leaga, de asemenea, de 23S ARN, care este parte a peptidil- transferazei ribozomale. Rezistenta la tetracicline este larg raspandita. Au fost identificati numerosi determinanti ai rezistentei la tetraciclina (Tet) si la oxitetraciclina (Otr), gasiti mai frecvent la nivelul plasmidelor. Astfel, rezistenta la tetracicline apare mai degraba prin castigarea determinantilor Tet decat prin mutatii la nivelul genelor cromozomiale existente. Principalele mecanisme implicate in rezistenta bacteriana sunt:

1. Reducerea concentratiei de antibiotic in citoplasma, care se poate obtine prin doua mecanisme:

- reducerea permeabilitatii peretelui bacterian. Se intalneste doar la bacteriile Gram-negative si se asociaza cu alte mecanisme pentru a determina niveluri mari de rezistenta;

- efluxul energo-dependent determina niveluri mari de rezistenta.

Au fost identificate doua tipuri de pompa de eflux: pompele de multirezistenta si transportorii specifici pentru tetraciclina (acestia transporta antibioticul in spatiul periplasmatic si nu extracelular).

2. Protectia ribozomului de actiunea tetraciclinei a fost descoperita la streptococi si consta in productia unei proteine care interactioneaza cu ribozomul, permitand ca sinteza proteica sa nu fie afectata. Se considera ca in prezenta tetraciclinei s-ar induce o stabilizare a interactiunii ribozom-ARNt.

3. Distructia oxidativa a tetraciclinelor a fost semnalata la cateva specii bacteriene, dar ea nu are importanta clinica.

MACROLIDE, LINCOSAMIDE, STREPTOGRAMINE SI KETOLIDE

Aceste antibiotice se leaga reversibil de centrul peptidil-transferaza localizat la suprafata 50S, fapt ce determina multiple alterari ale functiei acestei subunitati ribozomale. In timp ce macrolidele se leaga de domeniul V al 23S ARNr, ketolidele au o dubla ancorare de ribozom (se leaga si de domeniul II al 23S ARNr). In mod clasic, macrolidele blocheaza formarea peptidului sau translocatia peptidil- ARNt de pe situsul A pe situsul P. Rezistenta intrinseca la macrolide, lincosamide si streptogramina B (MLSB) a bacililor Gram-negativi este determinata de permeabilitatea redusa a membranei externe pentru aceste antibiotice hidrofobe. Pentru bacteriile Gram-pozitive au fost descrise trei mecanisme de dobandire a rezistentei la MLS:

- modificarea tintei ribozomale altereaza situsul 23S ARNr, care este comun pentru legarea MLSB si confera rezistenta incrucisata la aceste antibiotice (fenotipul MLSB de rezistenta);

- modificarea enzimatica a MLS;

- eflux activ.

1. Modificarea tintei de actiune Rezistenta la MLSB este determinata de castigarea genelor de rezistenta (erm); acestea codifica enzime care demetileaza reziduuri de adenina la nivelul 23S ARNr. Situsul precis de metilare a fost localizat intr-o regiune puternic conservata a ARNr, si anume domeniul V. Metilarea ARNr conduce la modificari conformationale, care determina o reducere a afinitatii si aparitia rezistentei incrucisate la toate antibioticele MLSB. Streptograminele de tip A sunt neafectate si sinergia dintre cele doua componente ale streptograminelor este mentinuta fata de tulpinile MLSrezistente. Au fost identificati cel putin noua determinanti ai genei erm; datorita hidrolizei incrucisate, tulpinile izolate clinic pot fi incadrate intr-una din cele patru clase: ermA, ermC, ermAC si ermF. Distributia acestor gene este relativ specifica de specie. La tulpinile de stafilococi, expresia rezistentei MLSB poate sa fie constitutiva sau inductibila. Cand expresia este constitutiva, tulpinile

sunt rezistente la toate antibioticele MLSB. Streptograminele de tip A sunt neafectate si sinergia cu componenta B este mentinuta. Cand expresia este inductibila, tulpinile sunt rezistente doar la macrolidele cu 14 si 15 atomi la nucleul lactonic. Lincosamidele, ketolidele si macrolidele cu 16 atomi nu sunt inductori si de aceea isi pastreaza activitatea pe un subset de tulpini rezistente la macrolidele clasice. In plus, din cauza dublei ancorari de ribozom, ketolidele pot sa se lege de domeniul II al 23S ARNr al tulpinilor rezistente prin metilarea domeniului V. La streptococi, metilarea ribozomala conduce la rezistenta incrucisata la macrolide, lincosamide si streptogramine.

2. Inactivarea antibioticelor Inactivarea enzimatica (esteraze si fosfotransferaze) confera rezistenta doar la antibioticele inrudite structural. La tulpini de enterobacteriacee si de S. aureus au fost identificate enzime care hidrolizeaza inelul lactonic (ErmA si ErmB) si fosfotransferaze de tip I (mphA) si II care inactiveaza macrolidele. Gena linA mediaza rezistenta la lincosamide prin productia unei nucleotidil- transferaze. La unele tulpini de stafilococi au fost identificate lactonaze care sunt capabile sa cliveze inelul macrociclic al streptograminei B (gena vgb) si acetiltransferaze care inactiveaza streptograminele de tipA (genele vat si vatB). 3. Efluxul activ A fost demonstrata prezenta pompelor de eflux pentru macrolide la stafilococi (msrA, msrB), gonococi (mtr) si streptococi (mefA, mefE). Genele msr confera rezistenta doar la macrolidele cu 14 si 15 atomi la inelul lactomic. Unii pneumococi si streptococi de grup A sunt rezistenti numai la macrolide si sunt sensibili la lincosamide si streptogramine (fenotipul M). Aceste tulpini contin gena mefA sau mefE, care codifica un mecanism de eflux pentru macrolidele cu 14 si 15 atomi la nucleul lactomic. Prezenta unei gene mediate plasmidic vga codifica o proteina care se leaga de ATP si este asociata cu un eflux activ pentru streptograminele de tip A.

CLORAMFENICOL

Activitatea antibacteriana a cloramfenicolului este rezultatul inhibitiei competitive a legarii aminoacil- ARNt de domeniul peptidiltransferazei de la nivelul subunitatii 50S. Apar modificari conformationale la nivelul acestei parti a ribozomului, care incetinesc sau chiar inhiba (la concentratii suficient de mari) incorporarea aminoacil-ARNt, blocand reactia de transpeptidare. Rezistenta la cloramfenicol apare prin:

- inactivare enzimatica;

- reducerea permeabilitatii peretelui bacterian.

1. Inactivarea enzimatica apare prin productia unei acetil-transferaze specifice (CAT). Cloramfenicolul contine doua grupari hidroxil care sunt acetilate printr-o reactie catalizata de CAT. Derivatii mono- si diacetilati sunt incapabili sa se lege de subunitatea 50S ribozomala. Expresia genei cat la S. aureus, S. pneumoniae si E. faecalis este tipic inductibila. Gena care codifica transferaza este localizata in plasmide, care confera rezistenta si la alte clase de antibiotice. La bacteriile Gram-negative, rezistenta la cloramfenicol este mediata de gene determinate plasmidic sau prin transpozoni, a caror expresie este in general constitutiva.

2. Reducerea permeabilitatii La bacteriile Gram-negative, rezistenta la cloramfenicol poate fi determinata de mutatii cromozomiale care reduc permeabilitatea membranei externe. Astfel, la Ps. aeruginosa, rezistenta este asociata cu prezenta genei clmA care reduce expresia porinelor OmpA si OmpC, reducand concentratia intracelulara de antibiotic. La E. coli, rezistenta la cloramfenicol si la alte antibiotice neinrudite este rezultatul fenotipului MAR.

OXAZOLIDINONE

Oxazolidinonele inhiba sinteza de proteine intr-o etapa mai precoce decat alte antibiotice care actioneaza la nivel ribozomal. Situsul de legare este localizat in vecinatatea centrulul peptidil-transferaza al subunitatii 50S. Aceasta interactiune impiedica formarea complexului de initiere care asociaza ARNtmet, ARNm si subunitatea 50S ribozomala si astfel blocheaza legarea de ribozom, sinteza peptidului si translocarea ARNtmet la nivelul situsului P. Datorita modului unic de actiune al oxazolidinonelor, nu exista rezistenta incrucisata cu alte antibiotice care actioneaza pe sinteza de proteine. Introducerea linezolidului in clinica este prea recenta pentru a trage orice concluzie in legatura cu incidenta si mecanismele de rezistenta. Au fost insa publicate cazuri de rezistenta aparuta sub terapie. Mutatia la nivelul 23ARNr confera rezistenta in vitro la linezolid.

C. Antibiotice care afecteaza acizii nucleici

FLUORCHINOLONE

Fluorchinolonele inhiba activitatea topoizomerazelor, enzime responsabile de superspiralarea ADN-ului (ADN-gyraza) si de relaxarea ADN-ului superspiralat (topoizomeraza IV). Ambele enzime au un mod similar de actiune. Gyraza si topoizomeraza IV sunt tetrameri alcatuiti din doua tipuri de subunitati:

- doua GyrA sau ParC, care catalizeaza taierea si eliberarea ADN-ului;

- doua GyrB sau ParE, responsabile de transductie si legarea de ATP.

Tinta de actiune a fluorchinolonelor este ADN-gyraza la bacteriile Gram-negative si topoizomeraza IV la bacteriile Gram-pozitive. Fluorchinolonele formeaza un complex cu ADN-ul bacterian si cu enzima. Legarea antibioticelor stabilizeaza complexul clivabil si conduce la disocierea subunitatilor enzimei. Rezistenta la fluorchinolone apare prin:

mutatii cromozomiale la nivelul genelor care codifica cele doua sisteme enzimatice (reducerea capacitatii de legare a antibioticului);

reducerea permeabilitatii porinelor;

eflux

1. Modificarea tintei

Alterarea enzimelor-tinta este cel mai important determinant in aparitia rezistentei la fluorchinolone. Multe bacterii Gram-negative rezistente contin o mutatie la nivelul genei gyrA, care determina inhibarea supraspiralarii ADN-ului si cresterea CMI-ului. Aceasta mutatie induce modificari conformationale la nivelul situsului de legare, care pot sa fie importante pentru interactiunea dintre antibiotic si ADNgyraza. Frecventa mutatiilor la nivelul subunitatii B a gyrazei este redusa. In absenta unei ADN-gyraze sensibile, topoizomeraza IV este o tinta secundara de actiune pentru tulpinile de E. Coli. Mutatiile la nivelul genei parC vor accentua reducerea sensibilitatii. Mutatii la nivelul genei parE pot avea acelasi efect, dar frecventa lor de aparitie este redusa. La S. aureus topoizomeraza IV este tinta primara de actiune a fluorchinolonelor. Mutatiile grlA (echivalentul parC de la BGN) preced mutatiile gyrA in dezvoltarea rezistentei la ciprofloxacina. Si la S. pneumoniae, topoizomeraza IV pare sa fie tinta primara de actiune a fluorchinolonelor. Totusi, nivelurile mari de rezistenta apar in trepte succesive, prin acumularea mutatiilor la cele doua enzime. S-a demonstrat recent ca pentru S. pneumoniae diferitele chinolone pot sa aiba tinte primare diferite (ADN-gyraza pentru sparfloxacina si topoizomeraza IV pentru ciprofloxacina).

2. Reducerea patrunderii intracelulare La bacteriile Gram-negative, modificarile membranei externe (in special deficit de expresie a porinelor) au fost asociate cu o patrundere redusa a antibioticului catre tinta de actiune. Unele dintre aceste modificari pot sa fie efectul mutatiilor cromozomiale la nivelul genei gyrA.

3. Efluxul activ Efluxul crescut ca mecanism de rezistenta la fluorchinolone a fost semnalat initial la tulpini de S. aureus. Gena norA codifica o pompa de eflux, care induce un nivel scazut al efluxului de fluorchinolone. La Ps. aeruginosa, rezistenta este determinata de hiperproductia unuia sau mai multor sisteme de eflux (OprK). Si tulpinile de E. coli poseda sisteme de eflux, in principal EmrAB si AcrAB.

4. Operonul MAR Multirezistenta la antibiotice (MAR) a unor tulpini de E. Coli poate sa fie rezultatul mutatiilor la nivelul situsului mar al cromozomului bacterian. O structura omoloaga mar exista si la alte enterobacteriacee, precum si la alte bacterii. La E. Coli, situsul mar consta din doi operoni cu expresie divergenta, marC si marRAB, ambii fiind necesari pentru expresia completa a fenotipului MAR. Expresia fenotipului MAR protejeaza celulele de actiunea fluorchinolonelor la concentratii care depasesc de patru ori valoarea CMI-ului.

NITROIMIDAZOLI SI NITROFURANI

Activitatea antibioticelor nitroheterociclice necesita activarea grupului nitro atasat de inelul imidazol sau furan, care trebuie sa sufere o reactie de reducere enzimatica pentru unul sau doi electroni. Reducerea nitroimidazolilor determina depletia stocului intracelular de coenzime de reducere, fapt care mentine un gradient in favoarea captarii intracelulare a antibioticului. Mai mult, formele reduse ale acestor antibiotice sunt puternic reactive si pot altera molecula de ADN. Nitrofuranii redu si inhiba de asemenea activitatea enzimelor implicate in degradarea glucozei si a piruvatului. In plus, ei se leaga covalent de proteine si de ADN printr-o reactie de alchilare. Rezistenta la nitroimidazoli, mediata plasmidic sau cromozomial, apare rar si este determinata de reducerea activitatii nitroreductazei, care scade si captarea intracelulara a nitroimidazolilor prin reducerea gradi gradientului de concentratie. Rezistenta la nitrofurani apare extrem de rar.

RIFAMICINE

Rifamicinele blocheaza initierea transcriptiei ADN-ului la ARNm si astfel inhiba sinteza ulterioara de proteine. ARNpolimeraza contine 5 subunitati; efectul rifampicinei apare dupa legarea antibioticului de subunitatea ß a ARN-polimerazei. Specificitatea actiunii este determinata de faptul ca ansamicinele altereaza metabolismul celulelor umane doar la concentratii de 10.000 de ori mai mari decat cele necesare pentru a determina moartea bacteriana. Rezistenta la rifampicina se dezvolta rapid, secundar mutatiilor cromozomiale care altereaza subunitatea a ARN polimerazei-ADN dependente. Rata de aparitie a acestor mutatii este de 10-7 pentru stafilococi, streptococi, H. influenzae si meningococi si de 10-8 pentru E. Coli.

D. Falsi metaboliti

TRIMETOPRIM SI SULFAMIDE

Sunt antibiotice care afecteaza biosinteza acidului tetrahidrofolic, derivat utilizat pentru sinteza de aminoacizi si nucleotide. Sulfamidele sunt analogi ai acidului paminobenzoic si inhiba competitiv dihidropteroat sintetaza (DHPS). Trimetoprimul este analog al acidului dihidrofolic si inhiba dihidrofolat reductaza (DHFR), enzima care catalizeaza reducerea acidului dihidrofolic la acid tetrahidrofolic. Diverse specii bacteriene prezinta niveluri mici sau mari de rezistenta la trimetoprim. In unele cazuri, rezistenta codificata cromozomial poate fi determinata de:

- hiperproductia de DHPS;

- mutatii la nivelul genei structurale a DHFR, fol A.

Nivelurile mari de rezistenta ale enterobacteriaceelor apar prin castigarea de ADN care codifica o DHFR cu un situs activ alterat. La bacteriile Gram-negative au fost descrise cel putin 11 DHFR modificate. La stafilococi, rezistenta la trimetroprim este mediata de gena dfrA (purtata de un transpozon), care codifica o DHFR rezistenta la antibiotic. Rezistenta la sulfamide este codificata cromozomial si determina o productie crescuta de acid paminobenzoic. Modificari ale DHPS pot sa determine o afinitate scazuta pentru sulfamide. Rezistenta poate sa apara si prin castigarea de plasmide care codifica DHPS rezistente la sulfamide.

E. Antibiotice care actioneaza asupra membranei bacteriene

POLIPEPTIDE CICLICE

Polimixina si colistina actioneaza ca detergenti si altereaza permeabilitatea membranei citoplasmatice. Rezistenta castigata la aceste antibiotice este cromozomiala si rezulta dintr-o scadere a permeabilitatii membranei externe, secundar modificarilor in compozitia ei biochimica. Bacteriile cu sensibilitate redusa sunt caracterizate printr-o scadere a raportului fosfolipide/lipide si o concentratie crescuta a cationilor divalenti (Ca2+, Mg2+). Proteina H1 de la Ps. aeruginosa (cunoscuta ca OprH) previne legarea acestor antibiotice de lipopolizaharide si hiperproductia ei a fost corelata cu o sensibilitate redusa fata de antibiotic. Desi ramane exceptionala, rezistenta la aceste antibiotice a fost recent descrisa la tulpini multirezistente la betalactamine si aminoglicozide.