Principii de genetica in diagnostic, tratament si profilaxie

PRINCIPII DE GENETICA IN DIAGNOSTIC, TRATAMENT

SI PROFILAXIE

1. Principii de genetica de diagnostic

Particularitati

diagnosticul componentei ereditare a unei boli se impune cat mai precoce

F in medicina: preconceptional, prenatal, postnatal, presimptomatic

F in epidemiologie - ore // zile de la eveniment

F in criminalistica - ore // zile // ani - de la eveniment

F in medicina legala - ????

diagnosticul componentei ereditare nu incepe si se termina cu bolnavul

F punct de plecare pentru investigarea intregii familii

1.1. Diagnosticul genetic clinic = pasul initial = bolnavul se prezinta la practician

1.2. Diagnosticul genetic paraclinic

A) prin tehnici invazive

Fetoscopia = vizualizarea fatului //placentei // cordonului ombilical   

permite diagnosticul malformatiilor congenitale

permite terapia fetala

rar utilizata - risc de avort = 5%

 Amniocenteza = punctia tansvaginala // transabdominala a cavitatii amniotice

prelevare 5-10ml proba investigatii citogenetice, biochimice, ADN

investigatiile citogenetice = rezultat tardiv - celule imbatranite

risc mic pentru embrion

Biopsia de vilozitate coriala = prelevare sub control ecografic proba anexe fetale

risc relativ mediu pentru embrion

investigatiile citogenetice = rezultat precoce - celule tinere

Cordocenteza = prelevare de sange embrionar din cordonul ombilical

risc mare pentru embrion utilizata in situatii speciale

B) prin tehnici neinvazive

Ecografia fatului = examen de rutina ce permite

evaluare greutate si dimensiuni fetale

prognosticul datei nasterii

diagnosticul sex fat // malformatii congenitale

Radiografia fetala

efectuata numai in bolile ereditare ale sistemului osos

1.3. Diagnosticul citogenetic

Testul Barr - diagnosticul anomalii numerice gonozomiale (cromosom X)

Cariotipul simplu - diagnosticul anomaliilor cromosomiale numerice

Cariotipul prin marcaj in benzi (bandarea cromosomilor) - tehnicile G, Q, R

permite diagnosticul anomaliilor cromosomiale structurale

1.4. Diagnosticul genetic biochimic

Evidentierea acumularii de substrate / produse metabolice anormale

ex. = Fen - r. cu perclorura de fier, t. Guthrie, hartie Fenistix

Separarea cromatografica a unor substrate

ex. = aminoacizii (aminoacidopatii) + colorare cu ninhidrina

F alifatici (albastru), aromatici (maro), imidazolici (roz)

Separarea electroforetica a polipeptidelor

ex. = hemoglobinopatii, izoenzime etc

Teste enzimatice = diagnostic

homozigoti recesivi (afectati)

heterozigoti (purtatori)

homozigoti dominanti (normali)

Teste imunologice = markeri - antigene de histocompatibilitate (haplotipuri)

dg. presimptomatic, dg. purtatori, dg. paternitate, eval. risc

Dozarea nivelului umoral al unui produs biologic

ex. = factorii de coagulare

 Secventare proteina = evidentiere a.a. mutant (nu detecteaza mutatiile sinonime)

ex. = bolile moleculare

1.5. Diagnosticul genetic molecular (analiza ADN)

Sursa ADN = orice celula nucleata 10ml de sange 300μg ADN

Analiza ADNN

dg. genetic indirect = sonde ADN // loci polimorfi // secvente repetitive // PCR

dg. genetic direct = secventare alela mutanta //ASOs // PCR

1.5.1. Diagnosticul indirect prin tehnici de genetica moleculara

Metoda - variabilitatea secventelor AND - detectarea unei alele mutante

F polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLPs)

F variabilitatea numarului de secvente repetitive (VNTRs)

A. RFLPs

Enzime de restrictie

celule procariote = aparare contra ADN strain > 400 enzime

F recunosc peste 100 secvente diferite cu lungimi de 4-6pb

F taie ADN in fragmente de lungimi diferite

F identificare fragmente - proba (antisecventa) ADN marcata

RFLPs - determina prezenta / absenta siturilor restrictie

20% indivizi - variatii situri de restrictie = polimorfism genetic

F survin la ~ 200-500pb in genomul uman

F majoritatea fara expresie fenotipica (clinica) = mutatii tacute

F numai 1/6-1/5 pot fi identificate prin enzime de restrictie

B. VNTRs = secvente repetitive = microsateliti / minisateliti / oligonucleotide

F numarul de secvente repetitive difera intre omologi (70%)

F detectarea simultana a unor loci multipli = amprenta ADN

F utilitate: medicina, medicina legala, criminalistica

VNTRs - secvente microsatelit F prezente la cca. 30Kb, lungime < 1Kb

VNTRs -secvente minisatelit F lungime 1-3Kb

STR (small tandem repeats) - secvente inalt repetitive

Tehnici pentru identificarea polimorfismului ADN

Southern blotting - necesita 5-10μg ADN - rezultate - 1 saptamana

 taiere ADN in situri de restrictie

separare fragmente prin electroforeza

transfer fragmente pe un filtru de celuloza

identificarea secventei dorite cu o antisecventa marcata

PCR - necesita 50ng ADN - rezultate - o zi

amplificare prin replicare a unui fragment de AND

F in 20-30 runde = amplificare de 10

digestia fragmentului cu enzime de restrictie

separarea fragmentelor prin electroforeza

coloraea fragmentelor cu bromura de etidiu, florocromi

vizualizare cu UV

1.5.2. Diagnosticul direct prin tehnici de genetica moleculara

permite diagnosticul molecular exact

Southern blotting + PCR

permite detectarea mutatiilor genice

F deletii = benzi micsorate sau absente

F amplificare trinucleotide = benzi mai late

Oligonucleotidele specifice alelelor (ASOs)

identificate prin probe complementare pentru ADN normal / mutant

prezenta / absenta hibridizarii poate identifica indivizii

F homozigoti normali

F heterozigoti (purtatori) normali

F homozigoti afectati

Secventarea ADN - utilizeaza o singura catena

sinteza oligonucleotide cu lungime crescanda

4 reactii paralele (capilare diferite)

1 capilar - marcarea nucleotidelor prin 4 florocromi diferiti

stopare polimerizare = adaos deoxinucleotide specifice

identificare oligonucleotid dupa pozitia pe gel (soft specializat)

citirea secventei pe gel / calculator

2. Principii genetice de tratament

Filiera dogmei centrale - tratamentul se adreseaza

substratului

F dieta de restrictie / imbogatire

F favorizarea eliminarii produsului toxic

F derivatii chirurgicale

produsilor genici

F terapie de substitutie

F transplant de tesuturi (maduva hematogena, fibroblaste)

genelor

F culturi de celule de la pacient

F sinteza gena prin revers-transcriptaza

F constituire banca de gene - pe plasmide

F transfer de gene in culturi de celule

F selectare celule ce au fixat gena normala

F transfer celule in organism

-1. Limitarea substratului = dieta

In bolile cu deficit de enzime pe caile catabolice

fenilcetonurie - galactozemie - deficit de lactoza etc

-2. Indepartarea unui produs metabolic ce se acumuleaza

Indepartarea medicamentoasa - in boala Wilson - cu D-penicilamina

Indepartarea prin dializa - in cistinurie pentru a preveni litiaza

 Inductia enzimatica a enzimelor RER - in s. Crigler-Najar - glicuronil transferaza

-3. Administrarea produsului deficitar

Suplimentarea proteinei deficitare

STH, T-3, cortizon, aldosteron, hormoni sexuali, insulina, facori coagulare etc.

Tratamentul de substitutie = deficit total / partial de enzime - in tezaurismoze, MPZ

-4. Tratamentul chirurgical

Tratamentul chirurgical de rutina = corectare, estetic, preventiv

malformatii, extirpare tumori etc

Chirurgia pe uter deschis = malformatii - pericol vital in perioada neonatala

hidrocefalie, obstructie cai urinare, hernie diafragmatica etc.

 Transplant tesuturi // organe cornee, timus, rinichi, pancreas, maduva hematogena

-5. Terapia genica

Transfer de gene in culturi de celule prin vectori virali

tropism pentru un tip celular

defectiv - sa nu produca boala

insertie gena in pozitia normala // apropiat

3. Principii genetice de profilaxie

profilaxia - justificat de costurile sociale

Ancheta familial - pornind de la proband

Identificare heterozigoti - inainte de cstorie in familiile cu risc genetic

Screening familial pentru o boala + diagnostic presimptomatic

Diagnostic prenatal - ecografic, citogenetic, biochimic, molecular

Sfat genetic - candidatilor la casatorie // parintilor cu istoric familial

Inseminare artificiala - sot cu boala dominanta // oligo/azoospermie

Fecundarea in vitro - sotie cu boala dominanta

sincronizare ciclu donatoare (sanatoasa) + acceptoare (afectata)

recoltare ovul prin aspirare

fertilizare prin ICSI

pastrare embrion in cultura pana la stadiul de blastocist

transfer zigot la mama-acceptoare

Modificare mediu - educatie, evitare factori declansatori

Tratament profilactic - prevenire malignizare, agravare etc.