Testarea citotoxicitatii subcronice si cronice

TESTAREA CITOTOXICITATII SUBCRONICE SI CRONICE

1. Introducere

Dupa cum s-a discutat in Capitolul 6 in legatura cu cercetarile privind     toxicitatea acuta, durata scurta a expunerii in testele acute permite monitorizarea efectelor unei substante chimice administrata in doze mari intr-o perioada de timp scurta. Aceste expuneri acute apar intr-o varietate de circumstante, in special in situatii de urgenta, ocupationale, legate de mediu si domestice.

Toxicologia clinica a aratat frecvent ca expunerile acute la medicamente de abuz sau terapeutice sunt probleme majore de importanta internationala si tratarea supradozelor accidentale sau intentionale este de o dificultate semnificativa. Comparativ, un grad la fel de mare de toxicitate apare in urma interactiunilor substantelor chimice de concentratie scazuta, neletala, ca si in cazul expunerilor scurte intense.

În plus, se pune un mare accent pe expunerea de lunga durata, animala si umana, la toxinele din mediu, expunerea ocupationala la substante periculoase si efectele cronice ale dietei si suplimentilor acesteia. Prin urmare, exista un stimulent puternic pentru sectorul toxicologic stiintific de a dezvolta metode de testare pentru predictia relativa a pericolelor de expunere cronica la substante chimice in viata de zi cu zi. Simularea acestor interactiuni necesita dezvoltarea mai multor tipuri diferite de studii pentru a replica modelul uman.

2. Tipuri de testare a toxicologiei subcronice si cronice

2.1. Obiective si definitii   

În general, in evaluarea riscului uman si animal, perioadele de expunere acute si cronice sunt termeni relativi, utilizati in scop comparativ. Orice expunere de pana la 24 de ore este considerata ca acuta. În cazul multor gaze toxice (ex. monoxid de carbon, acid cianhidric), expunerea necesita mai putin de 24 de ore pentru a provoca toxicitate. De asemenea, 72 de ore pot constitui o expunere acuta in cazul expunerii continue a copiilor la doze mici de acetaminofen si a expunerii animalelor de casa la ierbicide si pesticide. Expunerea subacuta este un termen care nu mai este in folosinta. Anterior, aceasta reprezenta expunerea repetata de peste 72 de ore, dar mai putin de o luna (Barile, 2004).

Expunerea cronica se refera la orice perioada relativa de timp pentru care o expunere repetata sau continua, dincolo de faza acuta, este necesara pentru ca o substanta chimica sa induca un raspuns toxic. Pentru comoditate, termenul de cronic se aplica si perioadei subcronice.

Expunerea subcronica implica o durata intre acut si cronic. Perioada traditionala de expunere subcronica este de 1 pana la 3 luni. Astfel, toti acesti termeni sunt adaptari flexibile pentru definirea debutului intoxicatiei chimice si pot apare suprapuneri considerabile in definirea perioadelor de expunere. Spre deosebire de studiile acute, obiectivele studiilor subcronice si cronice sunt:

determinarea efectelor toxicologice ale administrarii repetate, in doze subcronice sau cronice, a substantelor testate asupra potentialelor organe tinta,

stabilirea relatiilor doza-raspuns (sau efectul concentratiei) folosind diversi indicatori,

stabilirea experimentala a dozei maxime care nu induce toxicitate evidenta in urma expunerii repetate,

propunerea unui mecanism de toxicitate care completeaza sau contrazice studiile acute ale substantei chimice sau clasei de agenti.

În continuare vom prezenta informatiile necesare pentru abordarea acestor obiective si pentru a explica diferenta abordarii experimentale fata de modelul studiilor testarii toxicologiei acute. Comparabilitatea rezultatelor depinde de similitudinile criteriilor de testare.

2.2. Factori asociati cu toxicitatea cronica

2.2.1. Frecventa expunerii

Trebuie subliniat faptul ca frecventa expunerii implica doze repetate de toxina intr-o anumita perioada de timp. Astfel, expunerea repetata continua la o toxina, in special intr-o perioada subcronica sau cronica, are un mare potential toxic. În plus, doza, durata, frecventa si ruta de expunere contribuie in parte la toxicitatea chimica prin acumularea unui produs in compartimente fiziologice. Profilul toxic al unei substante chimice este determinat in functie de timpul de injumatatire (t_1/2) in plasma si de efectul sau, adica timpul necesar ca nivelele plasmatice sa scada la jumatate din concentratia masurata sau estimata. Daca frecventa expunerii depaseste t_1/2, concentratia dintr-un compartiment va depasi nivelul dorit. În consecinta, in interactiunile chimice de lunga durata, acumularea este rezultatul supraincarcarii compartimentului cu un agent.

2.2.2. Acumularea si distributia

Odata absorbita, o substanta chimica este distribuita si/sau legata de unul sau mai multe situsuri fiziologice. Distributia agentului chimic depinde in mare parte de caracteristicile sale fiziochimice. Compartimentele includ sangele, serul si proteinele serice, plasma si proteinele plasmatice, tesutul adipos, fluidele interstitiale si extracelulare, spatiul alveolar si maduva osoasa. Orice tesut sau organ poate acumula preferential un agent chimic, comportandu-se astfel ca un compartiment discret, ca in exemplul acumularii preferentiale a metalelor grele in tesutul adipos.

În consecinta, toxicitatea poate fi prezenta pentru o perioada prelungita cand un compus este eliberat lent din compartiment, dupa ani de zile de la incetarea expunerii. Prin urmare, acumularea este estimata pe baza volumului aparent de distributie (V_d) al agentului chimic, care este doza totala a medicamentului in corp raportata la concentratia plasmatica a medicamentului intr-o perioada data de timp. În general, cu cat este mai mare V_d, cu atat va fi mai mare potentialul de acumulare intr-un compartiment fiziologic. O masura standard a cantitatii de agent chimic acumulat intern o constituie incarcarea corporala, definita ca si cantitatea de agent chimic stocata in unul sau mai multe compartimente fiziologice sau la nivelul intregului corp.

2.2.3. Influenta structurii chimice

Acumularea si influenta sa asupra toxicitatii cronice pot fi determinate de structura agentului chimic si de interactiunile sale in compartimentele fiziologice. Acest fenomen este influentat de starea predominanta ionizata sau neionizata a agentului chimic intr-un lichid fiziologic. În general, la pH fiziologic, compusii liposolubili raman in stare neionizata, sa se lege, sa penetreze si sa se acumuleze in membranele tisulare sau organice. Compusii hidrosolubili raman ca specii ionice la pH-ul sanguin. Astfel, deorece sunt mai putini dispusi la legarea tisulara, ionii raman pasibili secretiei si eliminarii renale.

2.3. Obiectivele studiilor toxicologiei cronice

Scopurile efectuarii studiilor toxicitatii cronice sunt similare celor ale studiilor acute, cu cateva diferente importante. Obiectivele care se suprapun studiilor acute includ: (1) determinarea concentratiilor letale si toxice ale unui compus chimic si efectele sale asupra tesuturilor si organelor, (2) identificarea relatiei cauzale dintre doza administrata si modificarile fiziologice, biochimice si morfologice si (3) monitorizarea variatiilor raspunsului speciilor animale fata de un anume agent. Diferentele majore dintre studiile cronice si experimentele acute se bazeaza pe frecventa, acumularea si durata expunerii la un agent toxic (Hoffmann, Hartung, 2006). De exemplu, studiile cronice sunt efectuate in general pentru a:

masura sau evalua efectele toxice ale unor doze scazute, mai frecvent administrate, analizand astfel expunerea cumulativa repetata,

determinarea efectelor cumulative ale expunerii repetate,

examinarea efectelor toxicologice ale cresterii dozelor agentului chimic pe perioade extinse,

identificarea recuperarii subiectilor dupa indepartarea sursei expunerii,

predictia efectelor adverse pe termen lung cauzate de expunerea intermitenta, repetata sau continua.

În final, studiile cronice in general completeaza studiile acute, cand conditiile sunt structurate pentru a imbunatati rezultatele obtinute in studiile acute.

3. Modelul experimental

Cronic si subcronic sunt adesea termeni relativi, in special in relatie cu specii diferite. Din punct de vedere istoric, o perioada de 2 ani este tipica pentru efectuarea de studii cronice pe rozatoare. Totusi, 2 ani nu reprezinta un timp semnificativ din durata de viata a altor specii cum ar fi cainii (durata medie de viata este de 9 pana la 10 ani) sau iepurii (5 pana la 6 ani). Chiar si la rozatoarele cu dieta restrictionata caloric, perioada de expunere de 2 ani este semnificativ mai putin reprezentativa pentru durata de viata mai lunga a exemplarelor sanatoase.

În general, odata cu cresterea duratei de viata a speciilor de mamifere, perioda de expunere trebuie ajustata pentru a simula o expunere cronica. Astfel devin mai dificile atribuirea si extrapolarea perioadei cronice unei anumite specii pentru a corela adecvat rezultatele unui asemena studiu cu evaluarea riscului uman. În consecinta, durata studiilor cronice (6 luni pana la 3 ani) este variabila si flexibila si poate fi determinata conform oportunitatilor obiectivelor proiectului.

3.1. Selectia dozelor

Nivelurile dozelor pentru studiile toxicologiei cronice sunt selectate pe baza informatiilor disponibile din studiile acute ale agentului chimic, efectelor toxicologice cunoscute, datelor epidemiologice animale si umane, cunoasterii reactiei speciei fata de agentii chimici din aceeasi clasa si concentratiilor toxice cunoscute ale agentilor chimici din aceeasi clasa. În plus, datele in vitro sunt recomandate ca metoda de screening pentru studiile in vivo. Astfel, cunoasterea curbelor doza-raspuns, valorilor LD₅₀, EC₅₀, si IC₅₀ (concentratia inhibitorie 50% in vitro sau concentratia care cauzeaza 50% din raspunsul masurabil al unui control intr-un sistem in vitro) ale compusului chimic, il ajuta pe investigator in identificarea dozelor corecte pentru studiul cronic in vivo.

Cunoasterea detaliilor obiectivului final este esentiala pentru determinarea nivelurilor dozei. Dupa cum se va observa in capitolele urmatoare, dozele stabilite in studiile ale caror obiective implica evaluarea monitorizarii histologice sau patologice a toxicitatii difera de proiectele carcinogenice. Ca si in studiile acute, investigatorul are o anumita flexibilitate in selectarea dozelor, de obicei incluzand pana la 5 grupuri si un "vehicul" si/sau un control negativ. În plus, experimente preliminare cu numar mic de animale cu dozari repetate sunt necesare pentru a stabili grupurile efectoare minime si maxime.

Dozele sunt apoi selectate pe baza testelor focalizate preliminare. In final, recunoasterea farmacocineticii compusului chimic (daca este disponibila), contribuie la prezicerea manifestarii acestuia in compartimentele fiziologice in cursul unui studiu.

În consecinta, un studiu pilot cu un numar limitat de animale pe cateva saptamani furnizeaza informatiile necesare pentru inceperea unui studiu complet. Studiul pilot reduce si sansele de alterare a parametrilor in desfasurarea proiectului, cum ar fi ajustarea dozelor, modificari semnificative ale numarului de animale sau modificari ale parametrilor studiului pentru a justifica mortalitatea excesiva sau lipsa efectelor.

3.2. Selectia animalelor

Selectia numarului si speciilor animale se bazeaza pe obiectivele studiului cronic, parametrilor stabiliti in organizarea experimentala si abilitatii de monitorizare si adaptare la rezultate neprevazute si nefavorabile (Doe si colab.,2006). Tabelul 1 subliniaza cativa dintre acesti parametrii care sunt similari celor stabiliti pentru studiile acute (vezi tabelul 6.1, capitolul 6). Totusi, avand in vedere ca studiile cronice au o durata mai mare, trebuie subliniat faptul ca indicatorii si efectele toxicologice din aceste studii pot fi impredictibile.

Tabelul 1 Pasii necesari pentru achizitia si manevrarea animalelor inainte de initierea experimentelor

În plus, intretinerea constanta a conditiilor experimentale in timpul unui studiu de 2 ani este mai dificila decat pentru experimente de 24 pana la 72 de ore. Alti factori care trebuie monitorizati pe perioada proiectului de testare a toxicitatii cronice sunt prezentati in tabelul 2. in care sunt incluse si cateva dintre circumstantele care impun sacrificarea timpurie a animalelor.

Este important ca decizia de a exclude un animal din studiu sa fie documentata si ca suficiente analize sa fie efectuate pentru a determina o relatie cauzala, adica daca starea animalului este indusa de conditiile experimentale sau de factori care nu sunt legati de agentul chimic testat.

Tabelul 2 Circumstante care cer noi analize si modificari in timpul studierii toxicitatii cronice

Alte considerente in timpul desfasurarii unui studiu cronic includ: (1) importanta aclimatizarii animalelor la mediul de cazare si de laborator inaintea inceperii studiului, ca si in cazul studiilor acute, (2) evitarea infectarii animalelor si (3) achizitia altor animale pentru experimente paralele mai mici care produc un set de valori normale pentru obiectivele finale fiziologice, biochimice si morfologice in timpul perioadelor de tratament si post terapeutice si in timpul studiilor acute focalizate paralele.

În final, ca si in studiile acute, animalele sunt impartite aleator in grupuri de tratament si in custi, etichetate pentru identificare, si examinate folosind indicatori fiziologici si toxicologici.

3.3. Criteriile zilnice de monitorizare ale studiilor toxicologiei cronice

Studiile cronice necesita staruinta, atentie si perseverenta din partea investigatorului si personalului, in principal datorita observatiilor zilnice si manevrarii animalelor. Tabelul 3 enumera criteriile monitorizarii aspectelor de rutina zilnice ale unui studiu cronic. Atentia pentru acesti factori ajuta in analizarea progresului zilnic al unui studiu, asigura tratamentul uman al animalelor si maresc fiabilitatea rezultatelor.

Tabelul 3 Monitorizarea aspectelor de rutina ale testelor cronice

În plus, observatiile zilnice ajuta personalul sa observe fenomenele toxice subtile sau patologia organului tinta.

Observarea zilnica a animalelor implica si folosirea parametrilor biologici de rutina ca indicatori ai starii de sanatate. Tabelul 4 subliniaza indicatorii biologici care sunt folositi in intervalele selectate intra-studii pentru a constata conditia biologica. Ca si in observatiile de rutina, parametrii morfologici si fiziologici sunt folositi cu intentia de a evalua aparitia si secventa de timp a toxicitatii, in special in detectarea toxicitatii organului tinta.

În plus, criteriile generale folosite pentru a determina starea generala zilnica a animalelor se pot suprapune cu monitorizarea acelorasi criterii, cum ar fi urmarirea cand si cum un animal se apropie de hrana si apa fata de masurarea cantitatii de nutrienti consumati (tabelele 3 si 4). Acest lucru este important in principal daca aditivul chimic interfera cu apetitul pentru nutritia solida sau lichida. În consecinta, urmarirea atenta a obiceiurilor dietetice evita confuzia dintre toxicitatea datorata unui agent chimic si concluzia incorecta a dezvoltarii unei patologii datorita aportului dietetic inadecvat (Kroes si colab., 2000).

Colectarea probelor de sange, urina si fecale se efectueaza la intervale alese, fara nevoia de a sacrifica animalele inainte de terminarea studiului. Dispozitivele de colectare a urinii si fecalelor sunt noninvazive si se pot atasa custilor. Colectarea probelor de sange necesita pregatire, dar se efectueaza fie prin punctie venoasa din vena cozii, fie prin punctia capilara a unghiului intern al ochiului. În ambele situatii, tehnica incorecta sau folosirea repetata a aceluiasi animal prezinta risc de infectie. De asemenea, sunt folosite proceduri noninvazive pentru a evalua parametrii de invatare, neurologici, si de comportament. Acestea includ tehnici cum ar fi masurarea echilibrului, evolutia in labirint, metoda miscarii cozii pentru masurarea durerii si stimuli recompensatori pentru deprinderi comportamentale.

Tabelul 4. Monitorizarea parametrilor biologici in studiile cronice

* hranirea pereche se refera la imperecherea grupurilor tratate si netratate; ambele grupuri primesc aceleasi cantitati de hrana. Presupunand ca tratamentul chimic altereaza aportul de lichide si hrana, grupul tratat devine controlul limitator al ratei de nutritie, iar grupul de control serveste ca indicator pentru diferentierea intre efectul agentului toxic si efectul nutritiei inadecvate.

Analiza urinii, biochimia sangelui si evaluarile hematologice sunt indicatori de rutina ai toxicitatii ce asigura identificarea evenimentelor toxice. Acesti indicatori sunt sugestivi si pentru mecanismul toxicitatii si duc la intelegerea efectelor asupra organului tinta. Nivelele plasmatice ale anumitor enzime specifice reflecta adesea leziunea organului tinta si sunt folosite pentru a identifica interactiuni care se petrec in alte organe.

Similar, analiza de rutina a urinii aduce dovezi asupra modificarilor induse de toxicitate si sugereaza toxicitatea metabolica si de organ tinta. Din aceste analize se pot obtine informatii considerabile privind biotransformarile produsilor agentilor administrati (McCarty,Borgert, 2006).

3.4. Durata studiilor

În timpul desfasurarii studiilor cronice si subcronice, este important de inteles ca selectarea momentului de terminare a studiului trebuie sa previna interpretarea modificarilor si patologiilor legate de varsta ca modificari datorate inductiei chimice. Studiile subcronice au in general o durata de 21 - 90 de zile, in functie de calea de administrare si obiectivele finale toxicologice de interes. Perioadele de timp pentru durata studiilor cronice nu au fost clar definite.

Traditional, in functie de durata medie de viata a rozatoarelor, studiile cronice au fost desemnate sa continue timp de 2 ani. FDA (Food and Drug Administration) a sugerat recent ca aceste studii sa fie reduse la 6 - 18 luni, in functie de specia animala. Principiul acestui argument se bazeaza pe dovezi recente care sugereaza ca toxicitatea observata in al doilea an al unui studiu cronic este similara cu cea din primul an. De fapt, deoarece mortalitatea si morbiditatea legate de varsta sunt neobisnuite in primele luni ale experimentelor cronice, majoritatea toxicitatiilor observate in aceasta perioada sunt cauzale si dependente de doza.

Totusi, ar fi posibil ca aceasta abordare sa nu simuleze adecvat nivelul unei expuneri pe toata durata vietii unui rozator. În plus, susceptibilitatea unui animal la injurie chimica se mareste cu varsta, evidentiind astfel consecintele patologice ale administrarii agentului chimic populatiilor de animale inaintate in varsta. În consecinta ar putea fi necesara elaborarea unor proiecte separate cu obiective pentru detectarea patologiei induse toxic dependenta de varsta. Aceste studii ar putea evidentia diferite varste de "pornire" pentru animale, continuand cu expunere de 6 pana la 12 luni. Prin urmare, principala cauza de ingrijorare o constituie faptul ca studiile cronice sunt elaborate in functie de durata de viata asteptata a speciei implicate.

3.5. Experimentele de recuperare

Experimentul de recuperare (reversibilitatea leziunei induse toxic dupa expunere prelungita) este important pentru intelegerea toxicitatii cumulative, reorganizarii parametrilor fiziologici, regenerarii statutului normal biologic al unui organism si mecanismelor de reparare. Elaborarea corecta a studiilor subcronice sau cronice trebuie sa includa folosirea eficienta a resurselor pentru a include recuperarea din stadiul de toxicitate. Includerea acestor studii intr-un proiect ajuta identificarea progresiei, regresiei sau ameliorarii injuriei induse toxic dupa incetarea expunerii. O perioada de recuperare post tratament de 1 pana la 3 luni este de obicei adecvata pentru atingerea acestor obiective si se realizeaza prin selectia randomizata, la intervale variate, a animalelor supravietuitoare reprezentative.

3.6. Analiza rezultatelor

Studiile cronice si subcronice se bazeaza pe o distributie normala a efectelor in functie de anvergura dozelor. Distributia normala necesita un efect doza-raspuns liniar sau logaritmic folosind grupuri de doze corespunzatoare, adica o crestere liniara, respectiv logaritmica, a dozelor. În consecinta, raspunsurile doza-efect valide depind de aparitia efectelor preconizate la doze maxime si minime. Aceste raspunsuri se bazeaza pe nivelele preconizate ale parametrilor FEL, LOAEL, LOEL, NOAEL si NOEL (Tetko si colab., 2006). Tabelul 5 descrie acesti parametrii si semnificatia lor in evaluarea rezultatelor testelor toxicologiei cronice si subcronice. Descrieri aditionale ale evaluarii riscurilor sunt mentionate in capitolul 4.

Tabelul 5 Evaluarea riscurilor de pericol pe baza rezultatelor studiilor cronice si acute