TESTUL SENSIBILITATII LA ANTIBIOTICE PRIN METODA DE DIFUZIUNE A DISCURILOR

TESTUL SENSIBILITATII LA ANTIBIOTICE PRIN

METODA DE DIFUZIUNE A DISCURILOR

CAP . 1 . SCOP . DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Prezenta procedura descrie modul de testare a sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor bacteriene izolate in cadrul Laboratorului de Bacteriologie, folosind tehnica de difuziune a discurilor (microcomprimatele impregnate cu substanta activa antimicrobiana) . Metoda indica susceptibilitatea tulpinii bacteriene pentru antibioticele testate, prin aparitia unei zone de inhibitie in jurul discurilor impregnate cu substanta activa antimicrobiana . Cresterea microbiana este inhibata pana cand se atinge un prag critic de concentratie (Minimal Inhibitory Concentration sau 'MIC') .

Diametrul zonei rezultate este considerat proportional cu gradul de susceptibilitate si permite categorisirea tulpinii bacteriene in susceptibila (S), intermediara (I), sau rezistenta (R), comparativ cu tabelele de ghidare internationale .

DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru tulpinile bacteriene izolate in cadrul Laboratorului de Bacteriologie a LSVSA Cluj .

CAP . 2 . DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

NCCLS M100-S14: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement - Fourteenth Edition (2004)

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de analiza

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor analizelor:

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01-Instructiune de lucru Termostat MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr . inv . 2235

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav model RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr . Inv . 2260

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr . inv . 3142

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr . inv . 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr . Inv . 2183

CAP . 3 . DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Discurile impregnate cu antibiotic, sunt plasate uniform pe geloza insamantata in prealabil cu agentul bacterian . Un gradient de concentratie al antibioticului se formeaza prin difuzie de pe disc, cresterea agentului bacterian fiind inhibata la o distanta de la disc in concordanta, printre alti factori, cu susceptibilitatea agentului bacterian la substanta antimicrobiana continuta de disc .

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO - PROCEDURA OPERATIONALA;

PS - PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI - AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR BACTERIOLOGIE;

BA - BULETIN DE ANALIZE ;

RAC - RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI - ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC - DOCUMENTELE CALITATII

RTL - RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR

CAP . 4 . DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11 .

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei .

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie .

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata . Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta .

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate .

Balantele cu care se efectueaza cantaririle se instaleaza pe suprafete plane, fara trepidatii, in mediu lipsit de praf si schimbari bruste de temperatura .

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza in caiete speciale .

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii, conform PG-L-10 .

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11 .

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare .

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru .

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat .

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat la 37^oC

Autoclav RAYPA AES - 75, seria 17084, nr . inv . 2260 -IL-LBT

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr . Inv . 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm);

placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

tampoane sterile de tipul celor pentru recoltare exsudat faringian sau confectionate dintr-un bat de lemn si vata sterilizate in eprubete sau in hartie, sau autoclavate prin caldura uscata;

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox . 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare si baghete sterile;

stative pentru eprubete;

bec Bunsen;

manusi chirurgicale;

masca de protectie;

stativ pentru tuburi;

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

Mueller-Hinton agar

1 . Mueller Hinton agar- pregatit din mediul de baza deshidratat, in conformitate cu recomandarile producatorului . Mediul trebuie sa fie de asa natura, incat cu tulpini standard, sa se produca zone de inhibitie in limite acceptate . Este important sa nu se supraincalzeasca mediul .
2 . Mediul se raceste la 45-50oC si toarna in placi la o adancime de aproximativ 4 mm . O placa de 9 cm diametru necesita aproximativ 25 ml de mediu .
3 . Dupa ce mediul s-a solidificat, uscarea placilor pentru utilizare imediata se face prin introducerea lor 10-30 de minute la 36oC in incubator cu capacul intre-deschis .
4 . Placile neutilizate pot fi stocate intr-o punga de plastic, sigilate si introduse intr-un frigider . Placi stocate in acest mod pot fi pastrate timp de doua saptamani .
5 . Pentru a se asigura ca diametrele zonelor de inhibitie sunt suficient de fiabile pentru testarea susceptibilitatii, fiecare lot nou de Mueller-Hinton agar, ar trebui sa fie testat cu tulpina de control Enterococcus faecalis (ATCC 29212 sau 33186) si un disc de co-trimoxazole . Un lot satisfacator de mediu, va oferi o zona de inhibitie de 20 mm .
6 . Pentru testarea organismelor fastidioase, trebuie adaugat 5% sange la Mueller-Hinton agar de baza .

Discurile cu antibiotice

Poate fi folosit orice disc impregnat cu antibiotic, disponibil comercial, avand diametrul si potenta potrivita . Stocurile de discuri pentru antibiograma se pastreaza de preferinta la -20oC sau in congelatorul normal al oricarui figider . O cantitate mica de discuri pentru lucru apropiat, poate fi mentinuta la frigider timp de o luna . Dupa scoaterea de la frigider, recipientele cu discuri pentru antibiograma trebuie lasate la temperatura camerei pentru o ora pentru a permite echilibrarea temperaturii . Aceasta procedura reduce condensarea ce se produce cand aerul cald ajunge in contact cu recipientul rece .

Standardul de turbiditate

1 . Pregatirea standardului de turbiditate se face prin turnarea a 0 . 6 ml de 1% (10 gm / L) solutie de clorura de bariu dihidrat intr-un cilindru gradat de 100 ml, umpland restul pana la 100 ml cu 1% (10 ml / l) acid sulfuric . Standardul de turbiditate trebuie plasat intr-o eprubeta/tub identica cu cea folosita pentru proba in bulion . El poate fi pastrat in intuneric, la temperatura camerei timp de sase luni, cu conditia sa fie inchis pentru a preveni evaporarea .

2 . Ca si alternativa, se poate folosi Standardul McFarland, seriile 0 . 5-1-2-3-4-5 McF

Ser fiziologic

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare .

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

Testul sensibilitatii la antibiotice prin metoda de difuziune a discurilor urmareste etapele si indeplinirea caracteristicilor descrise in cele ce urmeaza:

Pregatirea inoculului pentru insamantare se face prin alegerea a 3-5 colonii cu aspect similar din cultura primara cu ajutorul tampoanelor sterile si suspendarea acestora in solutie salina . In cazul streptococilor, dupa suspendarea in solutia salina, este necesara incubarea acesteia pentru 4-6 ore pentru obtinerea unei turbiditati uniforme, corespunzatoare turbiditatii standard .
Pentru a ajunge la densitatea de testare, se adauga suspensiei mai multe colonii sau ser fiziologic steril . Ajustarea unei turbiditati corespunzatoare este esentiala pentru obtinerea gazonului de crestere
Inocularea placilor se face prin inmuierea tamponului steril in suspensia bacteriana, indepartarea excesului de substanta prin presarea tamponului de peretele tubului, iar apoi tamponul se trece pe toata suprafata mediului de trei ori, prin rotatie, in sensuri diferite, la un unghi de 60o dupa fiecare striere . La final, se trece tamponul o singura data peste mediu, la marginea placii . Se lasa sa se usuce inoculul timp de cateva minute la temperatura camerei cu capacul inchis . Discurile cu antibiotice sunt plasate pe placa fie cu ajutorul unei pense sterile, fie cu ajutorul dispenserului .


* Un maxim de sapte discuri pot fi plasate pe o placa de 9-10 cm diametru . Sase discuri pot fi distribuit uniform, de aproximativ 15 mm de la marginea din farfurie, si un disc de plasat in centrul de la farfurie . Fiecare disc ar trebui sa fie apasat usor in jos pentru a se asigura chiar si in contact cu mediul .

* De placi ar trebui sa fie plasat intr-un incubator la 35oC in termen de 30 de minute de la preparare . Temperaturi de peste 35oC invalida rezultatele pentru oxacillin / methicillin .

* Nu cloci intr-o atmosfera de dioxid de carbon .

* Dupa ce peste noapte de incubatie, in diametru de fiecare zona (inclusiv diametrul discului) ar trebui sa fie masurate si inregistrate in mm . Rezultatele ar trebui sa fie interpretate in conformitate cu diametre critice prin compararea cu tabele standard (Tabelul 2) .

* Masuratorile se poate face cu o rigla pe sub suprafata de placa fara a deschide capacul .

* Final punctul de inhibitie este judecat cu ochiul liber, la marginea de crestere in cazul in care incepe, dar exista trei exceptii:

 

 

1 . Cu sulfonamides si co-trimoxazole, o usoara crestere apare in zona de inhibitie; o astfel de crestere ar trebui sa fie ignorate .

2 . Cand b-lactamaza producatoare de stafilococi sunt testate impotriva penicilina, zone de inhibare sunt produse cu un heaped-up, clar definite marginea; acestea sunt usor de recunoscut, in comparatie cu sensibile de control, si, indiferent de marimea zonei de inhibitie, acestea ar trebui sa fi raportate ca rezistente .

3 . Anumite Proteus spp . . mai roi in jurul zonei de inhibitie unele antibiotice, dar si zona de inhibitie este, de obicei, in mod clar conturat si de strat subtire de viermuiala de crestere ar trebui sa fie ignorate .

CAP . 5 . ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Cand pe baza rezultatelor examenelor bacterioscopic, culturale, a caracteristicilor fiziologice si de patogenitate se confirma prezenta B . anthracis, in buletinul de analiza, in sectiunea "Rezultat" se scrie: " Examen bacteriologic pentru Bacillus anthracis: pozitiv: .

CAP . 6 . RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsbalitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura .

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza .

Sef Birou Sanatate Animala

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura .

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP . 7 . INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletin de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09