Mijloace tehnice de studiu in biologia celulara

Mijloace tehnice de studiu in biologia celulara

Biologia celulara i moleculara este o disciplina relativ noua i in continuu progres datorita perfec ionarii tehnicilor de studiu asupra celulei atat sub aspect morfologic, func ional cat i molecular. De asemenea, studiile contemporane asupra complexita ii structurale la nivel celular i molecular au ca scop investigarea atat a celului normale cat i asupra celei patologice ori sub ac iunea substan elor medicamentoase.

Tehnicile de investigare celulara sunt complexe i interdisciplinare. Dintre cele folosite in mod curent amintim tehnicile de microscopie fotonica, microscopie electronica, ultracentrifugare diferen iata, tehnici biofizice, biochimice, culturi de celule, fuziuni celulare, etc.

In vederea in elegerii organizarii ansamblurilor de molecule i conectarea lor in structuri, a proceselor legate de biosinteza acestora precum i func iile asociate lor, a proceselor patologice, deci pentru investigarea in domeniul ultrastructural este necesara coborarea treptata , cu ajutorul mijloacelor moderne de investigare de la celula la atom.

Prima etapa in studiul celular este reprezentata de analiza morfologica ceea ce implica mijloace ce au la baza microscopia fotonica.

Alcatuirea i func ionarea microscopului optic

Microscopul fotonic este un aparat optic de marit ( se pot examina structuri cu dimensiuni mult sub puterea de rezolutie a ochiului uman) care utilizeaza ca sursa de radia ie fotonul (element din spectrul undelor electromagnetice).

Performan ele unui astfel de aparat consta in puterea de marire i puterea de rezolu ie. Puterea de marire (PM) este produsul dintre puterea de marire a obiectivului i cea a ocularului. Puterea maxima este de x1500 ori. Pentru preparate histologice se folosesc obiectivele x20, x40, iar pentru cele citologice x 60 i x100.

Puterea de rezolu ie (PZ) a unui microscop este calitatea cea mai importanta in func ionarea unui astfel de aparat. PZ reprezinta cea mai mica distan a la care doua puncte pot fi vazute distinct i se calculeaza dupa formula lui Abbé.

D= λ/n sin α

λ = lungimea de unda a radia iei elecromagnetice . Aceasta este o constanta naturala care nu poate fi influen ata i are valoarea 0,55.

n = indicele de refrac ie al mediului dintre preparat i obiectiv (mediul dintre preparat i obiectiv este in general aerul , ca urmare valoarea lui n= 1). In cazul folosirii unui lichid cu indice de refrac ie diferit (uleiul de cedru, n=1,51) se va folosi obiectivul de imersie.

1/2 din apertura unghiulara a obiectivului. Apertura unghiulara maxima teoretica este de 180⁰, deci    α = 90, limita teoretica maxima a sin α=1.

Rezolu ia maxima a microscopului optic este 0,2µ. De PZ depinde claritatea i boga ia in detalii a imaginii i depinde de lentila obiectivului.

Componentele microscopului optic: partea mecanica (talpa cu sursa de lumina, condensator, diafragma, masa, dispozitivul pentru fixarea preparatului, revolver, macroviza i microviza) i partea optica (sistemul ocular i cel obiectiv).

Tehnica de lucru- efectuarea de observa ii

Microscopia prin fluorescen a

Pune in eviden a o serie de fenomene luminoase care iau na tere in structurile biologice primare (naturale) sau in cele provocate de catre substan e numite fluorocromi. Metodele citologice de fluorescen a prezinta o serie de avantaje, care le fac foarte utile in cercetarea histochimica cantitativa i a abiologiei celulare, atat pe celule vii cat i pe celule fixate.

Principiul metodei: anumite substan e radiate cu un fascicol luminos cu o lungime de unda mica i cu o frecven a inalta ( cum este cazul celor ultraviolete de 300-400 milimicroni) emit radia ii cu o lungime de unda mare i o frecven a mai joasa, deci de culoare diferita. Aceste substan e se numesc fluorescente. Fluorescen a este condi ionata de prezen a unor grupari fluorofore. Se folosesc 2 categorii de filtre pentru aceste microscoape: filtrele de excita ie i cele de baraj. Filtrele de excita ie sunt filtre colorate de la albastru la violet inchis. Ele re in o parte din radia iile emise de sursa    lasand sa treaca radia iile cu lungimea de unda care excita fluorocromul. Filtrele de baraj opresc lumina primara ce vine de la sursa, lasand sa treaca lumina emisa de fluorocrom. Alegerea filtrelor trebuie facuta astfel incat, transparen a lor sa fie maxima in domeniul de absorb ie a fluorocromului.

Fluorescen a este de 2 categorii:

fluorescen a primara, naturala sau autofluorescen a produsa de substan e care se afla in mod natural in celule. O serie de substan e iluminate in ultraviolet, emit in mod natural la o lungime de unda mai mare (legea Stoke) , adica in vizibil. Exp: vitamina A -fluorescen a verde, vitamina B2 cu fluorescen a albastruie, deriva ii de oxidare ai lipidelor cu o fluorescen a galben -bruna, porfirinele- ro ie, proteinele- alba datorita prezen ei aminoacizilor aromatici (tirozina, triptofanul, fenilalanina).

Fluorescen a secundara sau indusa prin tratarea sec iunilor de esut cu fluorocromi sau prin tratament chimic adecvat ce faciliteaza formarea unor grupari fluorocrome ( metoda prin care sunt detecta i acizii nucleici, fibrele de colagen, reticulina). Astfel, tratamentul cu acid sulfuric concentrat determina o fluorescen a a testosteronului, coriofosfina O provoaca fluorescen a ADN (in verde) i a ARN citoplasmatic in ro u (Radu Me ter, 1976)

Cu ajutorul fluorescen ei primare pot fi identifica i:

Pigmen ii : porfirinele (fluorescen a ro ie), lipocromii sau pigmen ii carotenoizi (fluorescen a verde), cromolipidele (fluorescen a galben-verde), lipofuscina (fluorescen a ro u- brun).

Acizii amina i : fenilalanina, tirozina, triptofan (fluorescen a albastra).

Virusuri i bacilul Koch emit fluorescen a verde.

Aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescen a verde).

Cu ajutorul fluorocromarii cu acridin orange se pot identifica:

Acizi nucleici ARN- fluorescen a ro ie, ADN- fluorescen a verde.

Fibrele de colagen, elastice i de reticulina- fluorescen a verde.

Nucleii leucocitelor au o fluorescen a verde, iar citoplasma lor i eritrocitele raman opace.

Mucinele - fluorescen a verde.

Colora ia cu acridin orange se mai utilizeaza in citodiagnosticul precoce al cancerului. Cea mai importanta aplica ie este imunofluorescen a care se bazeaza pe cuplarea unui acid cu un fluorocrom i poate fi identificata localizarea antigenelor in celule.

Fluorescen a in citologie

Microscopia in contrast de faza

Metoda utilizeaza un tip special de microscop fotonic ce realizeaza contrastul unor obiecte de examinat, permi and astfel studiul celulelor in stare vie, nefixate i necolorate. Aparatul propriu-zis este un microscop obi nuit cu unele particularita i: condensatorul are un diafragm inelar, iar in obeictiv se gase te o placa sau inel de faza care are rol de a modifica transmisia unei par i din razele luminoase care formeaza imaginea campului microscopic (este un proces de defazare intre razele luminoase care sunt transmise direct i cele care sunt difractate de preparat).

Aplica ii:

Studiul celulelor in stare vie;

Scoate in eviden a unele detalii de structura i func ionare celulara (endocitoza, diviziunea celulara);

Studiul reac iilor celulare la diferi i agen i chimici i fizici;

Studiaza benzile cromosomiale.

Microscopia in lumina polarizata

Prin aceasta tehnica se ob in imagini ale unor constituien iin care structurile analizate sunt anizotrope[i] acestea facand ca viteza de propagare a luminii polarizate sa varieze cu direc ia de propagare . Mediile respective se numesc birefringente.

Birefringen a pozitiva este atunci cand indicele de refrac ie este mai ridicat in lungime decat in plan perpendicular (caracterizeaza mediile reprezentate de structurile fibrilare: colagen, mielina, fibrele musculare striate) , iar negativa in caz contrar (fibrele nuceoproteice).

Microscopul are doua dispozitive speciale numite polarizor i analizor . Polarizorul se gase te sub condensator, iar analizorul se afla deasupra obiectivului. Daca planul de polarizare al analizorului este perpendicular pe cel al polarizorului, lumina va fi transmisa. Punand pe platina microscopului un preparat birefringent, planul de polarizare va devia datorita intarzierii provocate de intreruperea probei de examinat.

Aplica ii practice

Se studiaza structuri a caror compozi ie chimica macromoleculara au un aspect liniar ca de exemplu fibrele de colagen, mielina, fibrele musculare striate;

Se utilizeaza pentru studiul membranelor biologice;

Se eviden iaza structurile cu simetrie radiara: granule proteice, lipide, colesterol.

Microscopia electronica

Microscopul electronic reprezinta un instrument de vizualizare directa a ultrastructurilor celulare, cu o putere de rezolu ie mult mai mare decat al microscopului fotonic.

Microscopul electronic se bazeaza pe proprietatea electronilor de a fi devia i de un camp elecrostatic sau electromagnetica. Daca se plaseaza un filament (catodul) intr-un tub cu vid, dupa care filamentul se incalze te, el emite electroni ce pot fi accelera i, prin intermediul unei diferen e de poten ial.

Fluxul de electroni astfel realizat are proprieta i similare luminii, prezinta caracteristici corpusculare i vibratorii, insa lungimea de unda este mult mai mica in compara ie cu lumina alba. Acest flux trece printr-o bobina electromagnetica    (cu rol asemanator unui condensator) prin care electronii se concentreaza in direc ia obiectivului. Instrumentul mai prezinta o bobina electromagnetica cu func ii similare lentilei obiectivului prin care se ob ine o imagine marita a obiectului, iar una care func ioneaza ca i ocular sau lentila de proiec ie. Aceasta permite o marire suplimentara a imaginii.

Limitele de rezolu ie calculate pentru microscopul electronic sunt cuprinse intre 3-5Å. In cercetarea biologica aceasta limita de rezolu ie este de 10Å. Un microscop electronic ce prezinta o marire ini iala a obiectului de 100x, poate mari imaginea de 200x, cu ajutorul bobinei proiectoare, ceea ce echivaleaza cu o marire totala de 20.000x. Instrumentele perfec ionate pot realiza mariri suplimentare de 160.000, iar imaginea poate fi fotografiata la 1.000.000x marire.

Microscopul electronic este un instrument ideal pentru studiul structurilor submicroscopice celulare, al unor constituien i chimici celulari sau macromolecule purificate. Se poate urmari structura in relief a moleculelor ceea ce ofera o serie de avantaje privind in elegerea acestora.

Exista i dezavantaje prin faptul ca preparatele biologice trebuiesc fixate, deshidratate i colorate, procedee ce produc o serie de alterari ale structurilor celulare.de asemenea, bombardamentul cu electroni induce alterari de ordin structural sau chimic.