Prepararea omogenatelor celulare, alegerea mediului de suspendare, notiuni despre centrifugare - criterii de apreciere a puritatii fractiilor celulare

Prepararea omogenatelor celulare, alegerea mediului de suspendare, notiuni despre centrifugare - criterii de apreciere a puritatii fractiilor celulare

I. Fractionarea celulara

Pentru o analiza mai buna a structurii celulei pana la nivel de molecula, este necesara efectuarea unor analize biochimice profunde. Aceste analize presupun fragmentarea partiala/totala a celulei - fractionarea celulara - si au drept rezultat separarea diferitelor structuri subcelulare.

Tehnica de fractionare celulara are doua aplicatii majore:

► extragerea organitelor celulare, separarea lor de mediul normal celular, intr-o cantitate suficienta si de o mare puritate, pentru a putea fi studiata compozitia chimica si functiile lor.

► identificarea localizarii intracelulare a unor molecule specifice, alaturi de celelalte tehnici de citochimie.

Principiile fractionarii celulare

Primul pas in extragerea unor cantitati suficiente de organite celulare il reprezinta ruperea membranelor plasmatice prin diferite procedee mecanice si chimice, urmata de separarea fractiunilor celulare prin centrifugare, in functie de volum si densitate.

Centrifugarea se foloseste pentru o rezolutie cat mai buna a diferentierii organitelor celulare, de diferentele dintre proprietatile lor fizice, din care cele mai importante sunt marimea si densitatea. Exista numeroase similitudini intre organite atat in ceea ce priveste marimea cat si densitatea lor, insa, in general, structuri care au un volum asemanator au densitati diferite.

Centrifugarea diferentiata presupune separarea fractiunilor celulare fie doar in functie de marimea particulelor subcelulare, fie doar dupa densitatea lor.

Pentru ruperea membranelor plasmatice, celulele sunt suspendate intr-o solutie ce contine o sare cu un pH apropiat de cel al mediului intracelular (de exemplu sucroza izotonica). Ulterior este necesara agitarea suspensiei celulare la o viteza foarte mare, prin centrifugare sau prin plasarea sa intr-un camp sonic de inalta frecventa.

II. Prepararea omogentelor celulare

In vederea izolarii fractiilor celulare si a studierii proprietatilor lor functionale, se porneste de la un tesut sau de la celule libere, a caror membrane plasmatice trebuiesc rupte. Omogenatul celular (tisular) este reprezentat de componentele celulare, suspendate intr-un mediu corespunzator.

Omogenatele celulare se pot obtine de la orice tip de celula procariota sau eucariota. Nu orice tip de tesut este adecvat omogenizarii si fractionarii. De regula, se folosesc tesuturi moi, relativ voluminoase si usor manevrabile: ficat, muschi, rinichi, creier.

Tesutul se mai alege si in functie de tipul de organite celulare pe care dorim sa le separam; pentru obtinerea mitocondriilor se prefera ficatul, pentru izolarea nucleilor se va utilize ficat sau timus, etc.

Operatiile de prelevare si spalare a celulelor sau tesutului trebuie sa se realizeze la rece si intr-o perioada de timp relative scurta. Pentru ruperea membranelor plasmatice se folosesc diverse procedee, in functie de tipul de celule.

Cele mai utilizate metode de distrugere a membranelor celulare sunt:

omogenizarea mecanica,

ruperea membranelor celulare prin inghet-dezghet,

ruperea membranelor celulare cu ajutorul detergentilor,

ruperea membranelor celulare prin ultrasonicare.

a. Omogenizarea mecanica se poate realiza prin mojararea celulelor cu nisip, praf de sticla, etc sau    in omogenizatoare foarte deosebite ca modele.

Cele mai utilizate omogenizatoare sunt omogenizatorul cu piston, tip Potter si omogenizatorul cu cutite, tip Waring-Blendor.

b. Ruperea membranelor celulare prin inghet- dezghet.

Inghetarea tesuturilor se poate face la congelator, cu zapada carbonica in azot lichid, in amestec de zapada carbonica - etanol. Principiul dupa care se realizeaza ruperea membranelor celulare consta in aceea ca, prin inghet se formeaza cristale de gheata intracelulare, care ulterior, prin incalzire determina ruperea membranelor. Acest procedeu nu este recomandabil pentru separarea organitelor celulare. Este utilizata pentru studii functionale mai ales a fractiilor celulare.

c. Ruperea membranelor celulare cu ajutorul detergentilor.

In multe cazuri, metodele uzuale nu sunt adecvate si de aceea se folosesc substante chimice de solubilizare a membranelor celulare (deoxicolatul de sodium, taurocolatul de sodium, etc).

d. Ruperea membranelor celulare prin ultrasonicare.

Se utilizeaza aparate special e care rup membranele celulare prin ultrasunete

(5 secunde-2minute la 20.000Hz).