Functiile ADN

FUNCTIILE ADN

In majoritatea cazurilor, ADN celular se gaseste sub forma unor structuri compacte denumite cromozomi. De ex., ADN din E.coli formeaza un singur cromozom, ce contine ADN dublu helicoidal, circular, avand in total aprox. 4 x 10⁶ pb. Cromozomul din E.coli pare sa fie destul de tipic si pentru alte bacterii, dar este de 20 - 100 ori mai mic decat cel din eucariote, fiind insa mult mai mare decat cel din fagi (virusuri care infecteaza bacteriile - denumiti si bacteriofagi) sau din alte virusuri. Exista, de asemenea, si ADN extreacromozomial, de ex. ADN plasmidic (prezent in celule de procariote, fiind, ca si ADN cromozomial, circular si dublu catenar) sau ADN mitocondrial din eucariote.

Functiile ADN-ului sunt multiple, cele mai cunoscute fiind:

replicarea (duplicarea);

transmiterea informatiei genice (transcriptia).

Ambele procese necesita separarea ("denaturarea") celor doua catene ale ADN, vu formarea unor secvente monocatenare, facand astfel disponibila catena "matrita" (model) care este "copiata" prin complementaritate; una dintre diferentele majore dintre cele doua procese consta in faptul ca in cazul transcriptiei cele doua catene ADN initiale se reunesc, cu reformarea ADN initial, in timp ce in cazul replicarii (cf. modelului semiconservativ) fiecare dintre noile duplexuri ADN formate contin cite o catene veche si una nou-sintetizata.

Procese similare se intalnesc si in alte cazuri, cel mai bine cunoscut fiind cel al amplificarii ADN prin tehnicile PCR (polymerase chein reaction) - reactia [de polimerizare] in lant prin polimeraze.

Transmiterea informatiei genice se realizeaza prin intermediul unor secvente ADN bine definite, denumite gene, care prin intermediul ARN conduce la sinteza unor secvente proteice; totalitatea genelor dintr-o celula formeaza genomul caracteristic speciei respective.

In general - cel putin in procariote si virusuri - genele sunt apropiate de-a lungul catenei ADN, fiind separate prin cateva nucleotide. De ex. in fagul T7, ADN contine 50 gene care acopera ~92% din catena de 39936 perechi de nucleotide. In general, genele nu se suprapun, dar in genomul fagilor s-au determinat si secvante ce fac parte din doua gene diferite.

Dintre toate genomurile, cel mai studiat este cel al E.coli, in care au fost identificate circa 1000 gene; au fost determinate si secvente care nu codeaza proteine (de aprox. 200 pb), dar nu se stie daca ele nu reprezinta totusi gene, al caror transcript nu a fost inca identificat sau au alte functii inca necunoscute. O situatie similara se intalneste si in eucariote, care contin regiuni ce se exprima" - denumite exoni si regiuni care nu se regasesc in structura proteica, denumite introni.

1. Replicarea ADN

Replicarea ADN - autocopierea ADN - se realizeaza in cadrul unor unitati ale ADN, considerate independente, denumite repliconi.

De-a lungul timpului au fost realizate numeroase experimente care au incercat sa lamureasca mecanismul procesului de replicare.

Aceste experimente au dovedit intre altele urmatoarele:

celulele rezultate din diviziune (celulele "fiice") contin acelasi set de cromozomi ca si celulele parentale si deci aceleasi gene, in general duplicarea ADN se realizeaza in cursul unei faze bine definite a ciclului celular - faza de sinteza S. Exista - cel putin in procariote, in care evenimentele sunt mai bine cunoscute - molecule de ADN - plasmidele - a caror replicare este mai autonoma fata de ciclul celular. In mod cert insa, si acesta se multiplica inainte de diviziunea celulara, celulele fiice continand aceleasi plasmide (procesul poate fi insa mai complex deoarece exista celule ce contin plasmide, denumite F⁺ (sau masculine) si celule in care acestea sunt absente - selule F^- sau feminine, intre cele doua categorii realizandu-se un transfer genetic. Exista insa si cazuri, in care ADN celulei fiice nu mai este identic cu cel parental si anume cand se produc mutatii, deletii sau insertii; de ex. inserarea unui ADN viral;

in cazul ADN dublu catenar, Meselson si Stahl, folosind baze marcate cu N15, au demonstrat ca sinteza este semiconservativa: noul duplex ADN contine o catena veche provenita din genomul parental care se leaga complementar cu o catena nou sintetizata;

replicarea ADN monocatenar ( ADN (prezent de exemplu in fagii Ф X174 si M13) se realizeaza prin intermediul unui duplex (±)-ADN care se insereaza in genomul celulei gazda, replicandu-se o data cu acesta;

replicarea genomului ARN (prezent in retroviride, ex. fagul MS2, in HIV si altele) se realizeaza prin retrotranscriptie - sinteza unui ADN complementar urmata de dublarea acestuia, inserare, replicare si resinteza ARN;

sinteza noilor secvente ADN incepe intr-o regiune bine precizata a ADN parental denumita secventa origine sau ori. Fiecare replicon contine secventa ori proprie care reprezinta nu numai zona de inceput a replicarii ci si gena in care se controleaza procesul, de catre proteinele reglatoare; o data initiata replicarea aceasta continua fara interventia altor reglatori. Fiecare secventa ori isi are propriile proteine de reglare astfel ca duplicarea fiecarui replicon se poate realiza independent de ceilalti. Absenta secventei ori impiedica realizarea procesului de replicare. Secventa este specifica fiecarei specii, astfel ca incorporarea unei secvente ADN - de ex. prin retrotranscriptie sau prin tehnica ADN-recombinant nu permite replicarea secventei incorporate decat daca ea intra sub controlul secventei ori a gazdei;

in procese sunt implicate numeroase sisteme enzimatice: polimeraze, giraze, ligaze si altele.

2. Replicarea ADN la organisme cu genom "simplu"

Folosind date experimentale, au fost elaborate modele teoretice ipotetice ale procesului de replicare care incearca sa coreleze diferitele date experimentale. Primele modele s-au referit la procariote - in special E.coli - care au fost cel mai intens studiate, modele ce au fost extinse apoi si la fagi, mai ales cei dublu catenari. Ulterior aceste modele "clasice" au suferit mai multe modificari, odata cu noi observatii experimentale. Astfel fata de varianta initiala s-a extins domeniul genomurilor "simple" a caror replicare se aseamana cu cea a procariotelor, ele incluzand alaturi de procariote, plasmide, bacteriofagi si eucariote inferioare de tipul protozoarelor (Tetrahymena), ciuperci, precum si ADN mitocondrial sau cel al virusurilor ADN.

Genomurile "complexe" - a caror origine de replicare nu este bine cunoscuta - contin grupul de "metazoare" - includ toate animalele pluricelulare cele men'ionate anterior

2.1. Modelul "clasic"

In cazul genomului "simplu" modelul "clasic", considera ca replicarea incepe de la secventa ori.

Se formeaza o furca de replicare inclusa intr-un ochi de replicare". Formarea "ochiului" implica denaturarea (separarea) celor doua catene si descolacirea lor, realizata sub actiunea unor giraze.

Studiile realizate au condus la mai urmatoarele concluzii:

exista o singura origine de replicare - repliconul coincizand astfel cu genomul organismelor "simple";

secventa ori are intotdeauna aceeasi secventa de baze, ea este situata in furca de replicare;

furca de replicare se deplaseaza de obicei bidirectional, dar uneori si monodirectional.

De exemplu cu ajutorul microscopului electronic au fost identificate structuri, de diverse dimensiuni, de forma literei θ - care reprezinta ochiul de replicare. Prin actiunea unor enzime de restrictie catena a fost liniarizata evidentiindu-se sensul de deplasare.

Sinteza noii catene se realizeaza prin actiunea mai multor enzime, mai importante fiind ADN polimerazele I, II si III, dintre carte mai studiate au fost I si III; ambele au activitate 5'→ 3' polimerazica (unisens !), respectiv, 3'→ 5' si 5'→ 3' exonucleazica (activitate in ambele sensuri !); se pare ca enzima care participa efectiv la sinteza noilor catene este ADN polimeraza III. Reactia necesita prezenta unei catene matrita, care este reprezentata de vechea catena, a celor patru nucleotide, sub forma de 5'-trifosfati, dar si a unei secvente de nucleotide, denumita secventa "primer" care are rolul de initiator. Nici o ADN-polimeraza cunoscuta - spre deosebire de ARN-polimeraze - nu poate realiza sinteza "de novo" de la nivelul unei singure nucleotide; ele nu pot decat sa prelungeasca o catena "primer" de cel putin 15-30 nucleotide. Sinteza primerului este realizata de o ARN-polimeraza denumita AND-primaza (in E.coli fiind sintetizata de gena dnaG) secventa care este complementara fie secventei vecine ori (pentru catena principala), fie secventelor anterioare fragmentelor Okasaki. ADN-primazele se deosebesc de alte ARN-polimeraze prin faptul ca ele pot include atat ribonucleotide cat si deoxiribonucleotide, astfel ca primerul are o structura mixta.

Dupa sinteza primerului incepe sinteza propriuzisa a noilor catene ADN. ADN-polimerazele cunoscute pana in prezent au activitate exclusiv 5'→ 3' polimerazica. Cum sistemul polienzimatic de sinteza inainteaza intr-o singura directie 3'→ 5' fata de catena principala (leading - conducatoare) exista un model care sa corespunda activitatii 5'→ 3' a polimerazelor si existentei celor doua catene matrita antiparalele 5'→ 3' si 3'→ 5'.

Se considera ca cele doua catene sunt diferite:

catena 3'→ 5' este denumita catena conducatoare (principala); ea permite sinteza unei secvente 5'→ 3' continua, pornind de la primer (ori)

catena 5'→ 3' este denumita catena intarziata (secundara, lagging); pe aceasta matrita se sintetizeaza, tot in directia 5'→ 3' fragmente scurte, discontinue, de 1-2 kb, denumite fragmente Okazaki, sinteza pornind de la mai multi primeri.

Cel mai bine au fost studiate procesele in cadrul ADN plasmidic din E.coli p col E1 (dublu catenar circular); se pare ca procesele sunt similare si in celelalte cazuri. Replicarea incepe cu formarea unui primer de 555 nucleotide in amonte de origine (spre capatul 3') ca secventa complementara la catena conducatoare. Sinteza se termina chiar in pozitia O (origine), de la nucleotidul urmator (ori + 1) incepand sinteza noii catene. Sinteza nu incepe imediat, ci sub actiunea unei alte RNA-aze - RNA-aza H, care desface partial duplexul ADN-ARN primer, primerul liber adoptand o conformatie asemanatoare ARNt, respectiv de frunza de trifoi; totodata, creaza conditiile la capatul 3' al primerului pentru inceperea sintezei ADN.

O a doua secventa ARN, denumita ARN I este sintetizata pe catena intarziata, aproximativ in aceeasi zona cu primerul ARN (respectiv de la -440 in amonte de ori). Acest ARN este mai scurt - contine 108 nucleotide si este complementar cu secventa din celalalt ARN situata spre capatul 5 al acestuia, modificandu-i si conformatia. Cei doi primeri pot forma un duplex ARN care nu mai este substrat pentru RNaza H.

ARN I actioneaza astfel ca un sistem de reglare a replicarii ADN. Se presupune ca pe masura ce concentratia sa scade - de exemplu ca urmare a maririi volumului celular inainte de diviziune - ARN primer devine liber si poate permite initierea replicarii.

Alungirea lantului se realizeaza diferit:

pe catena principala, sinteza este continua 5'→ 3', realizata sub actiunea ADD-polimerazei III;

pe catena intarziata, aceeasi enzima sintetizeaza segmente scurte Okazaki; trebuie precizat faptul ca, complexul enzimatic este unic si el inainteaza intr-un singur sens: 5'→ 3' fata de catena conducatoare; cea de a doua catena sufera o modificare conformationala care sa permita sinteza in acelasi sens. Fragmente scurte de ADN sunt sensibile la actiunea nucleazelor astfel ca este necesara protectia lor, proces realizat de ssp (single binding protein - proteina de legare monocatenara). Ulterior, ssb este indepartata de polimerazele ce leaga fragmentele Okazaki intrte ele.

Odata formate, fragmentele necesara:

inlocuirea primerului cu un fragment ADN corespunzator;

legarea covalenta a fragmentelor.

Primul proces este realizat de ADN polimeraza I, o enzima mai abundenta decat ADN polimeraza III. Prin activitatea sa 5'→ 3' exonucleazica ea hidrolizeaza succesiv, cate o nucleotida din secventa primerului pe care o inlocuieste cu o deoxiribonucleotida, datorita activitatii sale 5'→ 3' polimerazice. Ea nu poate sa lega insa capatul 3' terminal cu cel 5' terminal al fragmentului Okazaki vecin; acest proces este realizat de ADN-ligaza. Prin legarea continua a fragmentelor Okazaki se obtine in final o catena ADN noua complementara cu catena intarziata parentala.

Schema prezentata este simplificatoare, intrucat se cunoaste faptul ca sunt mai multe gene implicate in procesele de replicare, de asemenea sunt numeroase articole care implica membranele celulare in proces, dar functia aceasta este inca necunoscuta.

2.2. Fidelitatea replicarii

Esentiala in transmiterea si pastrarea caracterelor genetice este pastrarea intocmai a structurii ADN - parental: copia trebuie sa aiba aceeasi structura primara.

Datorita unor modificari structurale "naturale" ale bazelor din catena parentala, de ex. ca urmare a modificarilor tautomerice, se modifica numarul de legaturi de hidrogen si rezulta o imperechere gresita, de ex. dG:dT in loc de imperecherea normala dG: dC. Calcule statistice conduc la o probabilitate a acestor evenimente de 1: 10⁴ - 10⁵ imperecheri normale. Determinarile experimentale dovedesc insa ca evenimentele mutationale se petrec mult mai rar - in mod spontan, respectiv 1:10⁹ nucleotide. Se pare ca motivul acestei discrepante il reprezinta faptul ca ADN-polimerazele au proprietatea de "prof-reading "citire corecta") - de "verificare" a corectitudinii replicarii. O data inserata o noua nucleotida, enzima se deplaseaza spre urmatoarea nucleotida, dar inainte de a introduce noua nucleotida verifica corectitudinea imperecherii anterioare. Daca se constata existenta unei imperecheri gresite, ultima nucleotida este excizata - datorita activitatii exonucleazice 3'→ 5' a polimerazelor, fiind apoi inlocuita cu nucleotida corecta. In aceste conditii probabilitatea de mutatie prin echilibru tautomeric scade la 1: 10⁸-10¹⁰ ceea ce corespunde valorilor determinate experimental.

Ipoteza existentei unei activitati exonucleazice 3'→ 5' a ADN - polimerazelor a fost emisa pe baza unei observatii indirecte; au fost izolate linii bacteriene "mutatoare" - linii ce prezinta o frecventa ridicata a mutatiilor. Sistemele enzimatice izolate din aceste linii bacteriene manifesta o activitate 3'→ 5' exonucleazica mult mai redusa comparativ cu liniile normale.

3. Modele "moderne" ale replicarii ADN

3.1. Modelul originii bidirectionale (OB)

Modelul clasic considera ca replicarea incepe de la furca de replicare, fiind realizata mai intai pe catena conducatoare si apoi pe catena intarziata.

Modelul originii bidirectionale considera ca originea se gaseste in centrul ochiului de replicare; el elimina conceptele de catena "conducatoare" si "intarziata" pe care il inlocuieste cu notiunile de brat "direct" si brat "invers" (retrograd).

Pe fiecare catena se gasesc atat brate directe cat si retrograde. Pe bratul direct sinteza este continua, iar pe cel de al doilea sinteza este discontinua, prin fragmente Okazaki. Existenta OB a fost evidentiata in cazul SV 40, ADN mitocondrial, E.coli, bacteriofagului l si a virusului poliomielitic.

Prin metode experimentale (ex. electroforeza bidirectionala) a fost stabilita pozitia OB in ochiul de replicare constatandu-se ca, in general, acesta este situat in planul simetric al ochiului de replicare sau foarte aproape de el (papiloma virus etc.).

Desi s-a dovedit experimental existenta OB, totusi sunt si cazuri care confirma modelul clasic, cel al inceperii replicarii din punctul de separare a catenelor; mai mult au fost decelate si cazuri in care sinteza incepe in afara regiunii ori (SV40).]

3.2. Modelul structurii multicompartimentate a originii de replicare

Modelul structurii multicompartimentate a originii de replicare ori considera - atat pe baza unor date experimentale, cat si pe cea a analogiei cu promotorul pentru transcriptie, - existenta mai multor zone ale secventei ori. Astfel ori contine un element de recunoastere a originii (ORE) un element de descolacire a ADN (DUE) = DNA-Unwinding Element), un element bogat in adenina si timidina (AT element - mai exact una dintre catene este poliA iar cealalta poliT) precum si doua elemente auxiliare de flancare AUX-1 si AUX-2. Orientarea, conformatia sunt de obicei critice pentru buna functionare a ori. Compartimentarea nu este intotdeauna aceeasi. Astfel, in unele cazuri, ORE include si segmentul A/T (adenovirus, ciuperci) in timp ce in alte cazuri elementul A/T faciliteaza activitatea DUE (SV40, papilomavirus) iar in alte cazuri coincide chiar cu DUE (virusul herpes simplex).

Elementul de recunoastere a originii (ORE) are dimensiuni variabile: 9 pb (adenovirus), 15 - 30 pb (incluzand si elementul A/T) in S.cerevisiae sau 114 pb in virusul Epstein Barr.

La elementul ORE se leaga un grup de proteine specifice. proteine de recunoastere a originii. Acestea pot avea activitate helicozida (descolacire) sau se pot cupla cu enzimele de replicare pe care le pot ghida spre ori sau le activeaza. Spre exemplu, in cazul SV40 se produce un antigen tumoral mare (large tumor antigen - T-ag) care se leaga specific de secventa ORE ce contine 24 pb; pentru legare nu este necesara participarea segmentului A/T, care este insa necesar pentru descolacirea si replicarea ADN. T-ag actioneaza ca o helicaza care desface cele doua catene.

Proteine cu functii similare au fost intalnite si in alte cazuri (virus herper simplex, ciuperci etc.).

Elementul de descolacire al ADN (DUE) reprezinta o secventa caracterizata prin mai multe proprietati:

capacitate ridicata de descolacire;

o mare sensibilitate la actiunea nucleazelor monocatenare, a unor agenti chimici;

se produc usor mutatii punctiforme si chiar modificari secventiale extinse care afecteaza care afecteaza proprietatile termodinamice ale ADN.

Prima data existenta secventelor DUE a fost observata de Kowalski, la drojdii si bacterii - presupunand ca aceasta ar reprezenta punctul de initiere a replicarii ADN. In ciuperci, DUE se afla intr-o regiune de 100 pb care flancheaza capatul 3' al regiunii poli T care, la randul ei este vecina cu ORE, iar in SV40, DUE este localizat intre nucleotidele5209-5217.

Faptul ca cele doua segmente sunt diferite ca activitate a fost demonstrat prin inducerea unor mutatii in DUE, blocandu-se astfel descolacirea (procesul fiind insa reversibil), fara insa a se bloca si ORE.

Ca functie, se considera ca DUE reprezinta zona in care incepe descolacirea (separarea catenelor), dar inca nu se poate preciza cu certitudine zona (nucleotidul) de la care incepe propriu zis replicarea .

In SV40, sub actiunea unui hexamer T-ag, care se leaga de ori, determinand "topirea" (separarea catenelor) ADN intre nucleotidele 5210-5211; pentru compensarea modificarii numarului de spire din zona DUE sub actiunea aceluiasi hexamer se produce o rotire a catenelor in zona T/A.

Componente auxiliare AUX -1 si AUX-2 flancheaza zona centrala ce contine elementele A/T, ORE, si DUE. Nu se cunosc in totalitate functiile acestora, dar, se pare ca ele reprezinta elemente de transcriptie, proces care faciliteaza si procesul de replicare. Sunt posibile mai multe variante: interactii intre factorii de transcriere si proteinele de replicare sau codarea in aceste elemente proteinelor replicare (ADN-polimeraze).

Existenta elementelor transcriptionale in cadrul ori a fost decelata pentru prima data in virusul poliomielitic si in SV40, ulterior fiind decelate si in alte secvente ori; se banuieste ca ele exista in orice organism.

Se considera ca elementele transcriptionale controleaza momentul in care incepe replicarea. Astfel, elementul ori al virusului poliomielitic nu este activ in celule de soarece decat in cazul in care activeaza factorul pentru transcriptie. Datele existente pana in prezent conduc la concluzia ca desi elementele auxiliare favorizeaza replicarea ele nu conditioneaza acest proces. Astfel, componentele elementului AUX-1 din SV40 nu impiedica deplasarea bidirectionala a furcii de replicare.

Alte variante de replicare

1. Replicarea prin     metoda "discului rotitor"

In general, ADN dublu catenar, circular se replica prin modelul prezentat anterior: formarea furcii si a ochiului de replicare (a unei structuri de tip θ). Exista insa si cazuri in care replicarea se realizeaza prin metoda "discului rotitor", varianta intalnita la replicarea si transferul ADN plasmidic. S-a constatat ca nu toate celulele bacteriene contin plasmide. De ex., cazul E.coli cele care contin ADN plasmidic au fost denumite "masculin", "donoare" sau (notate si F⁺) in timp ce cele defective au fost denumite "receptoare" sau "feminine" (notate F^-). Intre cele doua tipuri de celule se realizeaza o legatura de tip proteic (pseudopod) prin care se transforma material (si deci si informatie) genetic.

Sinteza si transferul presupun un mecanism propriu: una dintre catenele ADN (in lungime de 95 kb) este taiata intr-o pozitie bine definita ori T ("originea de sinteza de transfer") - alta decat ori normala (plasmidele se pot replica si prin metoda "ochiului"). Procesul de taiere este realizat de o endonucleaza codata de gena tra YZ. Capatul 5 al catenei libere incepe sa se deplaseze prin pseudopod traversand in celula F^-. Pe masura ce ea se indeparteaza de catena complementare (circulara), incepe sinteza unei noi catene pe matrita circulara, prin fragmente Okazaki. In momentul in care s-a parcurs un cerc complet (catena circulara s-a rotit) capatul 3 al celeilalte catene ajunge in oriT, moment in care sinteza se termina. Noul fragment este taiat de cel vechi, se circularizeaza, refacandu-se astfel plasmidul din celula F⁺. Celalalt fragment, patruns in F^-, se circularizeaza si el, reprezentand matrita pentru sinteza catenei complementare, astfel ca, in final, si celula F^- contine un ADN circular, dublu catenar, devenind astfel celula de tip F⁺.

S-a constatat ca, uneori, ADN plasmidic se integreaza in ADN cromozomial putand initia replicarea hibridului format la pozitia ori T, intreg hibridul fiind transferat in celule F-. Acest proces a fost intens utilizat in maparea genetica a ADN din E.coli.

2. Replicarea fagului λ

Fagul are un ADN dublu catenar care contine insa capete monocatenare, coezive, denumite secvente cos. Odata patruns intr-o celula gazda, se circularizeaza prin capetele cos, capetele fiind apoi legate covalent de catre ADN-ligaza gazdei. ADN circular creat astfel se replica prin ambele mecanisme:

formarea ochiului de replicare θ pornind de la o secventa ori;

majoritar insa replicarea se realizeaza prin varianta "discului roritor". Spre deosebire de cazul anterior, procesul de rotire se repeta de mai multe ori rezultand astfel mai multe copii succesive ale ADN fagului , copii legate covalent; acest ADN multiplu a fost denumit ADN concatameric. Inainte de integrarea lui in capsida virala, el este taiat enzimatic in zona secventelor cos; se refac astfel structurile dublu catenare liniare, inclusiv capetele cos.

S-a reusit sinteza in vitro a unor secvente "sintetice" de lungime asemanatoare (~49 kpb) si cu capete coezive, care au putut fi ulterior integrate in fagi , care au reprezentat astfel vectori eficienti de inserare in E.coli.

Prin acest mod de replicare se asigura multiplicarea genomului viral si deci, amplificarea virala.

3. Replicarea ADN monocatenar

Au fost identificati mai multi virusi ce contin ADN circular monocatenar: fagii ФX174, M13 - se pare ca nu exista genom ADN liniar monocatenar.

Existenta acestui tip de ADN a ridicat o serie de probleme astfel, conform modelelor de replicare prezentate anterior, pentru replicare, ADN-polimerazele au nevoie de un model, o matrita pe care o copiaza intr-o catena complementara; pentru copierea matritei este necesar un complement al complementului. Pentru respectarea acestei reguli, dupa infectia cu un fag monocatenar, catena acestuia (+) se replica intr-o catena complementara (-) rezultand astfel un ADN dublu catenar, notat RF sau (+,-).

In orice sinteza ADN, este necesara existenta unui primer ARN. Acesta este sintetizat intr-o regiune specializata a (+)ADN capabila sa genereze o bucla dublu catenara. Urmeaza apoi sinteza catenei (-), sub actiunea unei AND-polimeraze a gazdei. In final, primerul este inlocuit cu o secventa ADN de ADN-polimeraza I, iar catena este legata covalent de ADN-ligaza. Este posibila chiar supraincolacirea AND dublu catenar sub actiunea unei ADN-giraze.

Urmeaza apoi o succesiune de replicari prin varianta "discului rotitor", catena (-) servind ca matrita. Este necesara realizarea unei taieri (gatuituri) - similara celei intalnite la plasmid - sub actiunea unei nucleaze. Dupa realizarea unei copii, o alta nucleaza taie catena nou sintetizata, la capatul , care se leaga apoi covalent de capatul 5 , formandu-se astfel catena (+),     repetarea procesului de "rotire" conducand la sinteza mai multor replici ale catenei initiale.

5. Replicarea ADN la sistemele cu "genom" complex

Tinand cont de dimensiunile mult mai mari (20-10⁶ ori) ale ADN-ului ale ADN-ului sistemelor cu genom complex este de la sine intrlrs ca replicarea acestuia se va produce prin mecanism mult mai complex. Un calcul aritmetic simplu conduce la concluzia ca, daca replicarea ar incepe de la o secventa ori unica, similara cu cea a organismelor cu genom simplu, timpul necesar duplicarii ADN-ului pe care il vom denumi, pentru simplificare, ADN-eucariotic, ADN-e, va fi de 1000 - 10000 ori mai lung, ceea ce este, evident departe de realitate, mai ales in fazele primare, germinative, in care viteza de multiplicare este relativ mare. Pentru depasirea acestei discordante, s-a emis o ipoteza, cea a existentei mai multor origini de initiere a procesului de replicare, studii experimentale incercand sa confirme aceasta ipoteza.

Datorita structurii mult mai complexe a ADN-e studiile experimentale sunt mult mai dificil de realizat, astfel ca, pana in momentul de fata exista modele experimentale care confirma existenta mai multor origini, dar exista si altele care infirma aceasta ipoteza, sau cel putin reduc dramatic numarul de secvente ori.

In continuare vom prezenta cateva dintre modelele propuse si incercarile de explicare a diverselor variante posibile. Studiile au evoluat progresiv, de la observatii "macroscopice", realizate cu ajutorul microscopului electronic, spre studii la nivel molecular, realizate prin metodele ingineriei genetice, tehnica PCR si altele.

Majoritatea studiilor au infirmat, intr-un anumit sens, ipoteza existentei unor mai multe origini, situate pe intreg ADN-ul. Desi, in general se accepta ideea existentei mai multor origini - desi asa cum vom vedea sunt si opinii potrivit carora exista o origine "primordiala" - se considera ca acestea sunt grupate intr-un segment relativ restrans de pana la55pb, denumit "zona de initiere".

Modelul "zonei de initiere"

Studii realizate in faza S a ciclului celular au demonstrat existenta in structura ADN a unor "basicute re replicare" de 100-500pb situate intr-un domeniu de 3-30 kpb. Astfel de studii au fost realizate pe larve de xeropus pe ovar de hamster (CHO cells). Celulele CHO contineau 1000 copii ale genei dehidro folat reductazei (DHPO) in jurul carora au putut fi realizate studii intensive. Celulele au putut fi sincronizate in faza G1 prin tratare cu mimozina. Odata inceputa replicarea s-a observat aparitia "basicutelor" iar furca de replicare inainta in ambele directii, originea de replicare fiind prezenta in majoritatea copiilor de gene DMFR.

rezultate similare au fost obtinute si in cazul altor specii:

Drosofila chorion, in care s-a reusit amplificarea unor gene, proces ce are loc in celulele foliculare in timpul oo genezei. S-a apreciat ca peste 80% din evenimentele de initiere a replicarii se produc in aceasta regiune amplificata, intr-o secventa de nucleotide relativ redusa.

Studiile au evoluat in sensul incercarilor de stabilire a structurii zonei de initiere, denumita si locus de replicare; ele au fost realizate pe celule de soarece, de hamster, in special intr-o zona de aprox 300kpb in jurul genei DMFR din celule CHO.

Folosindu-se mai multe enzime de restrictie si diverse marcari radioactive au fost identificate, in celule CHo C 400 noi zone de initiere a replicarii ori α, oriβ, oriγ, studiile fiind axate pe oriβ. o metoda ingenioasa utilizata de Anachkova si Hamlin, care au realizat legaturi intercatenare utilizand psoralen, a permis identificarea unei origini de replicare intr-o zona de numai 500 pb:

La un moment dat s-a pus sub semnul intrebarii existenta reala a mai multor origini - identificarea acestora implicand amplificarea unor secvente ADN ca si sincronizarea culturilor celulare, realizata fie prin utilizarea de compusi chimici, fie prin lipsirea culturii de aminoacizi; s-a considerat ca, in aceste conditii existenta originilor multiple reprezinta un antefact experimental.

Ulterior insa, procesul de amplificare genica (mai corect secventiala) a putut fi evitat; prin folosirea tehnicii PCR a putut fi studiata o singura secventa (copie) de interes.

Folosirea in continuare, a enzimelor de restrictie si a altor metode experimentale a permis chiar analiza secventiala a zonei (locusului) de initiere, ca si localizarea altor gene situate in locusul de initiere sau in vecinatatea acestuia.

Astfel, in afara de gena DMFR, au mai fost decelate:

gena pentru adenozin-deaminaza (ADA) la soarece;

la om, la ADN plasmidic s-a decelat o origine de replicare autonoma (replicare independenta de ciclul celular normal) in vecinatatea genei c-myc.

Structura zonei de initiere

Prin diverse metode, a putut fi determinata pozitia diverselor originilor in cadrul locusului de initiere, astfel ori α se afla in amonte de gena DMFR, ori β in aval, la distanta de 22 kb de ori β se gaseste ori γ iar mai "la vale" se gaseste o alta gena 2BE2121, care flancheaza locus-ul de initiere. Secventa mai contine si regiunea de atasare a matrix-ului (MAR).

Studii mai amanuntite au demonstrat existenta in zona ori β a mai multor secvente necunoscute de enzime de restrictie (Eca RI, XbaI, Bam MI si Mind III, care au permis secventierea zonei cuprinse intre 0-30kb. In final a putut fi identificata originea propriu zisa, o origine de tip bidirectional (OBR) intr-o zona cuprinsa intre 16 - 20kb, fiind flancata de doua secvente Alu, implicate in amplificarea ADN.

Zona mai cuprinde secventele recunoscute de Hind III (H), Eco RI(E) si Xba I(X), ca si de legare a unor proteine R1P60, PUR, Oct-1 si AP-1, iar in afara, o secventa omoloaga ARG (secventa de replicare autonoma, identificata si in plasmide precum si o secventa curbare). Functiile proteinelor nu sunt in intregime cunoscute: R1P60 este copurificata cu o helicaza, PUR este o proteina care se leaga la zone bogate in purina - zone prezente atat la hamster, cat si la om - QCT1 este un factor de transcriptie, o proteina similara facilitand initierea in adenovirus Ad2 iar Ap1 faciliteaza (initiaza) in SV40 virusul poliomelitic; ramane in studiu comportamentul acestor proteine la eucariote.