BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE - Studii biotehnologice privind influenta sursei de Carbon si a parametrilor de fermentatie asupra producerii de exopolizaharide cu tulpini de bacterii lactice

 

Studii biotehnologice privind influenta sursei de Carbon si a parametrilor de fermentatie asupra producerii de exopolizaharide cu tulpini de bacterii lactice

Capitolul I. Introducere

Bacteriile sintetizeaza un numar de polizaharide care sunt definite dupa localizarea lor relativa in celula. Unele sunt intracelulare localizate in citosol si utilizate ca sursa de carbon, altele sunt constituenti ai peretelui celular ca peptidoglicanii si acizii teicoici, iar al treilea grup este localizat in exteriorul celulei. Ultimul grup poate lua o forma aderenta, adesea legata covalent, formand o entitate morfologica numita capsula sau polizaharide capsulare. Polimerul poate constitui un strat polizaharidic cu putine sau fara celule asociate sau atasate la suprafata celulara. În unele cazuri, polizaharidele capsulare sau cele neatasate sunt produse de catre organism iar delimitarea dintre cele doua forme poate fi dificila. În functie de relatiile structurale cu celula bacteriana, acesti polimeri au diferite denumiri, ca strat polizaharidic, polizaharide capsulare sau polizaharide microcapsulare. Termenul de exopolizaharide a fost propus de Sutherland in 1972, fiind atribuit pentru acele forme de polizaharide bacteriene gasite la exteriorul peretelui celular. Astfel, bacteriile lactice si propionibacteriile sunt cunoscute ca produc in principiu heteropolizaharide, compuse din unitati repetitive ca forma de la dizaharide la heptazaharide.[ 13, 14 ]

Exoplizaharidele produse de catre bacteriile lactice, care joaca un rol benefic in caracteristicile reologice si textura laptelui fermentat, sunt studiate intens in ultima perioada de timp. Exopolizaharidele sintetizate de catre bacteriile lactice au gasit cel mai valoros domeniu de aplicare prin imbunatatirea reologiei, texturii produselor lactate fermentate, cum ar fi iaurtul. Exista o mare cerere a consumatorilor pentru produse lactate si nu numai naturale, care sunt de obicei cunoscute prin cresterea continutului de grasimi, zaharuri, proteine sau stabilizatori (de exemplu, pectina, amidon, alginatului sau gelatina) din compozitia lor. Cererea consumatorilor pentru produse cu un nivel scazut de grasime, de zahar si aditivi, precum si datorita factorilor de cost, fac din exopolizaharide o alternativa viabila. Desi nu au nici un gust al lor, exopolizaharidele bacteriilor lactice cresc timpul petrecut de produsul din lapte in gura si, prin urmare, rezulta o mai buna perceptie a gustului. Un alt beneficiu il reprezinta efectele fiziologice ale exopolizaharidelor care raman pentru o perioada mai indelungata in tractul gastro-intestinal, sporind astfel colonizarea cu bacterii probiotice. În plus, exopolizaharidele bacteriilor lactice au demonstrat a avea efecte antitumorale, activitate imunostimulatoare, precum si un rol deosebit in scaderea colesterolului din sange. [ 36 , 37 ]

Scopul acestei lucrari a fost selectia de tulpini de bacterii lactice producatoare de exopolizaharide si stabilirea parametrilor optimi de cultivare a acestora pe medii de cultura adecvate in vederea obtinerii de exopolizaharide. [ 1 ]

Pentru obtinerea de exopolizaharide din tulpini de bacterii lactice principalele obiective ale studiilor au fost stabilirea sursei de Carbon, a temperaturii si a ph-ului la cultivarea acestora.

Capitolul II. Consideratii generale privind problematica exopolizaharidelor produse de catre bacterii lactice

Exopolizaharidele sunt un lung lant de polizaharide ramificate, unitati repetitive din glucide diferite sau nu. Aceste unitati sunt in principal compuse din glucoza, galactoza si ramnoza, in diferite raporturi.

Exopolizaharidele produse de catre tulpinile de bacterii lactice au fost determinate prin estimarea vascozitatii mediului unde sunt sintetizate. Cu toate acestea utilizarea masuratorilor de vascozitate ca un indicator pentru productia de exopolizaharide in medii lichide sunt dificil de interpretat,ele sunt reprezinta singura posibilitate de a interpreta rapid si usor. În ultimele decade, s-au impus noi metode de cuantificare mai precise a exopolizaharidelor care sunt bazate pe izolarea de exoplizaharide prin precipitare cu etanol. Majoritatea sunt laborioase, consumatoare de timp si necesita anumite dotari speciale pentru a determina structura polizaharidului si nu este intotdeauna disponibila in laboratoarele de microbiologie. De aceea, pentru o analiza completa este necesara o cooperare a mai multor laboratoare, in principal, cele de analiza fizico - chimica. Daca comparam tulpinile de Leuconostoc cu cele de bacterii lactice si propionibacterii, cele din urma sunt producatori slabi de exopolizaharide. Adica, cantitatea produsa este de ordinul miligramelor si nu de cel al gramelor, la litru de mediu. Aceasta aproximare analitica face ca izolarea exopolizaharidelor din mediul de fermentatie sa fie o operatiune destul de dificila. [ 50 ]

Cantitatile de exopolizaharide produse in lapte de catre diferite specii si tulpini variaza foarte mult. Au fost raportate cantitati de 50 pana la 350 mg/litru pentru tulpini de Streptococcus thermophilus, de 60 pana la 150 mg/litru pentru Lactobacillus bulgaricus si de 80 pana la 600 mg/litru pentru Lactococcus lactis subsp. cremonis. Pentru Lactococcus lactis subsp. cremonis au existat si cercetari recente care arata ca aceasta tulpina poate sintetiza chiar si cantitati mai reduse de exopolizaharide, de pana la 25 mg/litru. Productia de exoplizaharide pentru tulpini de Lactobacillus casei, are valori mici in lapte degresat cuprinse intre 50 si 60 de mg/litru, creste considerabil printr/o suplimentare cu glucoza sau cu sucroza si ajunge la un nivel de aproximativ 200 mg/litru. Pentru propionibacterii, valorile disponibile sunt foarte putine, iar cantitatile raportate sunt de aproximativ 15 mg/litru, in cazul unei precipitari directe, fara o deproteinizare anterioara. În consecinta, in precipitatul analizat pot exista glucide, minerale, zer, deoarece toate pot precipita cu etanolul, dar in mod normal sunt eliminate inaintea unei analize complete a exopolizaharidelor.[ 51, 52 ]

Bacteriile lactice sunt utilizate in fermentatii alimentare datorita abilitatii lor de a imbunatati aroma, textura si de a asigura conservarea unor materii prime perisabile ca laptele, carnea si vegetalele. Aceste bacterii sunt capabile sa produca, in mod normal, cantitati mici de exopolizaharide, 100 - 200 mg/l. O cantitate impresionanta (4 g/l) s-a obtinut cu o tulpina de Lactobacillus sakei. Chiar daca sintetizeaza cantitati mici de exopolizaharide in timpul fermentarii laptelui sau al fabricarii branzei, bacteriile lactice au un impact puternic asupra texturii si proprietatilor acestor produse. Cantitatea sintetizata este mica in comparatie cu exopolizaharidele comerciale utilizate frecvent, cum ar fi xantanul. În schimb, aceste polizaharide sunt o alternativa la cele produse de tulpini nealimentare datorita proprietatilor lor de legare. De aceea, se cauta noi tulpini cu proprietati importante si cu o productie insemnata de polizaharide. [ 36 , 37 ]

Studiile arata ca sinteza de exopolizaharide la bacteriile lactice termofile si mezofile au o mare doza de instabilitate. Aceasta instabilitate este atribuita pierderilor de plasmide in cazul bacteriilor lactice mezofile. Pentru cele termofile cum ar fi Lactobacillus bulgaricus si Streptococcus thermophilus, nu este o explicatie valabila deoarece aparent aceste tulpini nu adapostesc plasmide. Propionibacteriile se stie ca au in componenta lor plasmide, dar functionarea lor nu a fost foarte clar stabilita, existand o serie de cercetari contradictorii. Astfel, faptul ca propionibacteriile au ca centru de sinteza plasmidele nu este inca o certitudine.

Scaderea vascozitatii si a cantitatii de exopolizaharide direct proportional cu timpul de incubare a fost recent explicata prin aceea ca rezulta o hidroliza a exopolizaharidelor determinata de catre glicohidrolazele extracelulare in cazul Streptococcus thermophius si Lactococcus lactis subsp. cremonis, desi dovezile experimentale sunt putine. Observatii asemanatoare au fost facute si in cazul Propionibacterium acidi propionici intr-un mediu bazat pe zer de lapte. [ 21 ]

Abilitatea de a produce polizaharide este larg raspandita printre bacterii, in special a celor producatoare de acid lactic. Exista microorganisme care sintetizeaza polizaharidele sub forma de glicogen (localizat in citoplasma), polizaharide structurale ale peretelui celular ca peptidoglican, acizi lipoteicoici in cazul bacteriilor Gram pozitive si lipopolizaharide legate de membrana externa a bacteriilor Gram negative (Figura 2.1.). Unele bacterii pot secreta straturi polizaharidice la suprafata care, impreuna cu unele glicoproteine, se regasesc sub denumirea de glicocalix. Acesti polimeri exocelulari cuprind polizaharidele capsulare, care formeaza un strat aderent sau capsula legata la suprafata celulara si exopolizaharide, care formeaza un strat mucoid strans atasat la suprafata celulara sau eliminat in mediu. Este cunoscut faptul ca polizaharidele exocelulare nu sunt folosite ca sursa de carbon si energie de catre microorganismul producator. Rolul fiziologic al acestor molecule nu a fost inca stabilit cu exactitate. [13 , 16 ]

Figura 2.1. Localizarea celulara a polizaharidelor produse de catre bacterii Gram negative si Gram pozitive (glicocalix - polizaharide capsulare si exopolizaharide)

Multe cercetari despre exopolizaharide sintetizate de catre bacteriile acido lactice (BAL) au abordat caracteristicile fiziologice, fermentative, chimice si structurale ale moleculelor de exopolizaharide. De asemenea, au fost atinse si aspecte legate de biosinteza, ingineria metabolica si genetica si proprietatile functionale ale acestor biomolecule. Cateva exopolizaharide microbiene sunt utilizate in industrie datorita faptului ca proprietatile lor fizico-chimice sunt similare cu cele ale celulozei, pectinei si amidonului din plante. Un grup aparte il reprezinta acele exopolizaharide similare alginatului si caragenanului. În industria alimentara, exopolizaharide produse de catre BAL si alte bacterii sunt utilizate ca agenti de ingrosare, stabilizatori, emulsificatori si agenti de gelifiere datorita modificarii proprietatilor reologice si texturii produselor. Ca exemplu, se pot enumera xantanul, acetanul si gelanul produse de catre bacteriile Gram pozitive Xanthomonas campestris, Acetobacter xylinum si Sphingomonas paucimovilis sau dextranul produs de catre tulpini de Leuconostoc mesenteroides. Aceste exopolizaharide bacteriene sunt utilizate ca aditivi alimentari, iar culturile starter de BAL le pot produce in situ in timpul fermentarii laptelui. Din aceasta cauza, utilizarea tulpinilor producatoare de exopolizaharide ca o sursa naturala de bioaditivi a atras tot mai mult atentia in ultimii ani. Suplimentar, exopolizaharide produse de catre BAL au efecte benefice asupra sanatatii umane. Acestea se manifesta prin abilitatea de scadere a colesterolului, activitati imunomodulatoare si antitumorale, precum si efecte prebiotice. Majoritatea BAL producatoare de exopolizaharide apartin genurilor Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc si Pediococcus. De asemenea, a fost demonstrat ca unele tulpini ale genului Bifidobacterium sunt capabile de a produce astfel de biopolimeri. [ 8, 10 ]

Exopolizaharidele bacteriilor lactice sunt secretate in mediul de cultura in timpul multiplicarii celulare si nu sunt atasate permanent la suprafata a celulei microbiene. Acest lucru le distinge de polizaharidele capsulare structural similare, care raman permanent atasate la suprafata celulei.

În functie de compozitia chimica, exopolizaharide produse de catre BAL sunt clasificate ca:

homopolizaharide (HoPZ) care contin un singur tip de monozaharid;

heteropolizaharide (Hexopolizaharide) care sunt formate din unitati repetitive de monozaharide diferite.

HoPZ care contin glucoza sunt α - dextranul, α - mutanul, α - alternanul si β - glucanii. HoPZ care contin fructoza sunt fructani (de tipul levanului si inulinei). Aceste HoPZ au grade diferite de polimerizare care difera in functie de tulpinile bacteriene sintetizatoare. Unitatile repetitive ale Hexopolizaharide variaza ca numar de la trei pana la opt. Adesea contin combinatii de D - glucoza, D - galactoza si L - ramnoza. În cateva cazuri, contin N - acetilglucozamina, fucoza, acid glucuronic, substituenti ai carbohidratilor (acetil si glicerol). Compozitia chimica, legaturile lanturilor, structura acestor subunitati si masa molara determina caracteristicile fizice si proprietatile lor de crestere a vascozitatii. Marimea Hexopolizaharide este de 4×10⁴ - 6×10⁶ Da, iar HoPZ pot fi chiar mai mari. Marimea totala a exopolizaharide produse de catre BAL poate fi influentata de compozitia mediului de cultura si conditiile de cultivare. HoPZ sunt produse in cantitati mai mari decat hexopolizaharide. [ 34, 38 , 39 ]

Deoarece polizaharidele derivate din diferite bacterii lactice arata o mare variatie in compozitia, schimbul, aranjamentul spatial, rigiditatea si capacitatea de a interactiona cu proteine, nici o corelatie intre concentratiile de exopolizaharide si vascozitate nu a fost inca stabilite intr-un mod foarte clar. Aceasta corespondenta este deosebit de importanta, pentru ca va furniza o baza pentru o strategie care vizeaza producerea de polizaharide functionale valoroase, care se va comporta intr-o maniera relativ predictibila atunci cand sunt incorporate in produsele alimentare sau vin din produse functionale. Pentru a realiza acest lucru sunt necesare, lanturi de subunitati (masa moleculara ridicata) si/sau lanturi rigide. Chiar daca o relatie intre rigiditatea lantului si compozitia exopolizaharidelor nu a fost inca stabilita, se sustine ca exista premize pentru acest lucru. Legaturile de tipul β1-4 , au fost gasite in cazul Lactococcus lactis subsp. cremoris B40. Viscozitatea a fost, de asemenea, corelata cu cresterea masei moleculare in unele cazuri.[ 25 ]

Un element intermediar care leaga cai anabolice ale productiei de exopolizaharide si caile catabolice de degradare pare a fi cel al glucozo-6-fosfat, , in care fluxul de carbon se imparte intre formarea de fructozo-6-fosfat de catre produsele de glicoliza, biomasa si formarea ATP si biosinteza de nucleotide glucidice si precursori. Fosfoglucomutaza, o enzima implicata in conversie de glucozo-6-fosfat la glucozo-1-fosfat, are un rol important in trecerea intre caile catabolice si anabolice. Glucozo-1-fosfat serveste ca punct de plecare a nucleotidelor UDP-glucoza si dTDP-glucoza prin actiunea UDP-glucoza pirofosforilazei si dTDP-glucoza pirofosforilazei. De retinut este ca aceste nucleotide sunt utilizate pentru a forma o varietate de polizaharide in celule si, in consecinta, enzimele asociate acestora sunt des utilizate. Conversia galactozei la glucozo-1-fosfat prin galactoza-1-fosfat (calea Leloir) este posibila in cazul in care sistemul este prezent in celula. Etapa ulterioara de sinteza a exopolizaharidelor in bacterii lactice - montarea monoglucidelor in unitati repetitive - este realizata de mai multe enzime specifice, asa cum a fost identificat initial in Streptococcus thermophilus S6 si in Lactococcus lactis NIZO B40. Aceasta unitate repetitiva este asamblata de o molecula de transport lipidica, care este anexata la membrana citoplasmica din celula.

Glucidele sunt legate formand unitati repetitive sub actiunea mai multor gene producatoare exopolizaharide. Mecanismul de polimerizare al unitatilor repetitive la bacterii lactice, si exportul din celula, nu este clar. Nivelul ridicat de omologie intre organismele Gram-pozitive si Gram-negativ cu privire la sinteza de unitati repetitive inseamna ca un mecanism similar va avea loc la nivel de polimerizare al exopolizaharidelor si la export. Un model simplu pentru aceasta actiune presupune ca pentru a muta unitati repetitive se leaga de lipide de la partea citoplasmica la partea periplasmica. Folosind aceeasi analogie, polimeraza putea cataliza o legatura intre unitatile repetitive si o enzima si se poate dispensa de legatura lipid-polimer si astfel poate controla lungimea lantului. [ 44 ]

Genele ce codifica sinteza de exopolizaharide ar putea fi amplasat in plasmide, cum ar fi in Lactococcus lactis si Lactobacillus casei, sau localizat in cromozom, la fel ca in toate bacteriile lactice termofile studiate la ora actuala. Stingele si colaboratorii au identificat regiuni eps la Streptococcus thermophilus Sfi6, dezvaluind o regiune codificatoare de15,25 kb, in care o regiune codificatoare de 14,52 kb cu 13 gene (epsA pana la epsM) capabile de a conduce sinteza de exopolizaharide. Omologia proteinelor a demonstrat un nivel ridicat de omologie (intre 40 - 68%) pentru gene de codificare eps A, B, C, D si E, in Streptococcus pneumoniae si Streptococcus agalactiae. Van Kranenburg si colaboratorii au stabilit ca toate informatiile esentiale necesare pentru biosinteza de exopolizaharide la Lactococcus lactis NIZO B40 au fost codificate intr-un singur cluster de gene 12 kb situat intr-o singura plasmida de 40 kb . [ 39,41]

Un nivel ridicat de similitudine intre genele altor bacterii lactice este acum din ce in ce mai evident: un studiu recent al clusterilor genelor eps de la Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dezvaluit o regiune de 18 kb, constand din 14 de gene, (eps de la A pana la N), cu organizare genetica similara si la alte bacterii lactice. Genele in clustere sunt orientate intr-o singura directie si transcrise ca un singur mRNA. Secventele functionale din aceste grupari de bacterii Gram-pozitive, care sintetizeaza polizaharide la suprafata celulelor, par sa urmeze o tendinta similara, determinarea lungimii lantului, biosinteza unitatilor repetitive, polimerizare si export.

Unul dintre avantajele utilizarii bacteriilor lactice pentru inginerie metabolica apare de la decuplarea completa de caile catabolice de baza si caile biosintetice celulare. Nu sunt clare principiile fundamentale ale ingineriei metabolice a bacteriilor lactice de a produce diferite exopolizaharide. Gama larga de structuri si compozitii de heteropolizaharide produse de bacteriile lactice, precum si diferite efecte functionale, arata ca nu exista nici un mod cert de a stabili un punct de reper universal pentru nivelul de exopolizaharide dorite. Din punct de vedere economic nivelul de exopolizaharide produse in fermentatie, pentru a fi folosite ca un aditiv alimentar ar trebui sa fie in intervalul 10 - 15 g/litru. Cu toate acestea, din cauza limitarilor energetice celulare, cea mai mare cantitate de exopolizaharide raportata pana in prezent este de 2,767 g /litru la Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. În formularea unei strategii pentru supraproductia de exopolizaharide, este util pentru a afla de la experiente trecute genetice si metabolice privind capacitatea acestor organisme pentru a genera diferite produse. Strategiile care au fost aplicate pentru a reutiliza carbonul pentru a determina o supraproductie de produse specifice includ, caile ingineresti.[ 17, 22, ]

Un element cheie a metabolismului BAL este marea proportie de carbon care merge la lactat. Sa sugerat ca, daca productia de exopolizaharide s-a cuplat la cresterea celulara cand are loc reducerea in formarea de lactat, care este cunoscut ca inhiba cresterea, ar putea determina formarea de exopolizaharide. Mai mult de carbon ar putea fi transferat de la glycoliza si in formarea de exopolizaharide. Aceasta strategie a fost utilizata pentru a obtine supraproductie de produse finale de metabolism, cum ar fi de alanina prin supraexpresia genei pentru alanina dehidrogenazei de la Bacillus sphaericus alaD in tulpina deficitara LDH-un de Lactococcus lactis. Aceasta a fost, de asemenea, eficienta pentru productia de etanol, acetoina, manitol, 2,3 - butandiol, succinat piruvat si de a face o tulpina 'dublu knockout' de Lactobacillus plantarum (NCIMB 8826), in care expresiile de _L - LDH si _D - LDH au fost atenuate. În cazul in care aceasta strategie a fost adoptata pentru a realiza randamente mai mari de exopolizaharide, atunci este de asteptat ca modificarile suplimentare de reglementare sa fie necesare pentru a se asigura ca nu a fost excesiv deturnat volumul de carbon pentru a sintetiza metaboliti nedoriti, prin intermediul caii piruvatului. Aceasta abordare a generat mutante LDH-deficiente fara greutati fiind important sa se ia in considerare impactul cu privire la echilibrul redox in celula. În conditii anaerobe, bacteriile lactice transfera toti echivalentii reducatori la produsi finali de metabolism si NAD care se regenereaza de la NADH. În Streptococcus mutans, de exemplu, eliminarea activitatii LDH s-a dovedit letala pentru ca organismul nu poate recicla NADH prin rute alternative. Restaurare acestui echilibru, teoretic, ar putea fi atins prin exploatarea unei oxidaze NADH (NOX), de a crea o rata NADH: NAD⁺ necesara pentru a sprijini nivelul metabolic necesar pentru supraproductia de exopolizaharide. De exemplu, supraproductia oxidazei NADH a fost efectuata prin clonarea genei Streptococcus mutans nox-2 de plasmida vectorului pNZ8020 in Lactococcus lactis, sub controlul promotorului endogen nisA. În mod similar, supraexpresia NOX a fost realizata de clonarea genei nox sub controlul unui promotor nisA, in Lactococcus lactis.[ 51, 54, 55 ]

În acest caz, o reducere semnificativa a productiei de lactat implica o reducere concomitenta a cai glicolitice si un efect negativ asupra formarii ATP. Pentru ca este nevoie de ATP pentru biosinteza de nucleotide glucidice si molecule lipidice de transport C55-izoprenoid, este necesar pentru polimerizare si exportul de exopolizaharide, o reducere de energie disponibila ar putea fi de asteptat sa compromita formarea exopolizaharidelor. Aceasta opinie este sustinuta de Looijesteijn si colaboratorii, care au aratat ca eficienta productiei de exopolizaharide in Lactococcus lactis a fost mai mare atunci cand ATP a fost in exces fata de nivelul necesar pentru cresterea celulelor.

Conversia de glucozo-6-fosfat la glucozo-1-fosfat de catre fosfoglucomutaza si, ulterior, formarea de UDP-glucoza, care este catalizata de UDP-glucozo pirofosforilaza, au fost propuse ca potentiale puncte de control in productia de exopolizaharide. Supraexpresia genei pgm (pentru fosfoglucomutaza) si genei gal_U (pentru UDP-glucozo pirofosforilaza) duce la o acumulare de UDP - glucoza si UDP - galactoza, in Lactococcus lactis. Mai recent, supraexpresia genei galU, in combinatie cu gena pgm in Streptococcus thermophilus LY03 (Gal^-), a condus la o crestere a nivelului de exopolizaharide de la 0,17 la 0,31 g/mol carbon din lactoza. Mutanta Gal⁺ a Streptococcus thermophilus LY03 a determinat obtinerea de cantitati mari de exopolizaharide fata de tulpina salbatica (0,24 g/mol carbon de la lactoza). Acest fapt determina posibilitatea de decuplare a caii Leloir de la glicoliza: glucoza din lactoza si galactoza poate fi folosita pentru reactiile de glicoliza si pentru formarea de exopolizaharide. Acesta a aratat ca galactoza ar putea fi utilizata exclusiv pentru functiile celulare in tulpinile ce folosesc galactoza prin calea galactozo-6-fosfat, si glucoza ar putea fi utilizata pentru sinteza de exopolizaharide. Enzima Leloir, UDP-galactoza-4-epimeraza, ar putea fi o tinta specifica pentru supraexpresia in unele bacterii lactice; UDP-galactoza are un rol crucial in formarea exopolizaharidelor in Lactobacillus casei. [ 33 ]

O alta abordare pentru a spori productia de exopolizaharide exista la nivelul biosintezei polimerului exopolizaharidic, si, in special, prin cresterea activitatii asociate glicosiltransferazei. Un exemplu in acest sens este o crestere mica in productia de exopolizaharide obtinute prin supraexpression genei epsD in Lactococcus lactis. Supraexpresii similare s-au prezentat pentru Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus si Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

O metoda alternativa ar putea presupune clonarea intreagii gene eps pe o singura plasmida cu un mare numar de copii, dar stabilitatea tulpinei in productie va ramane un element cheie de luat in considerare. Alternativ, plasmide continand operon eps ar putea fi transferate intr-un alt organism pentru a genera niveluri ridicate de exopolizaharide, ca o consecinta a fluxului metabolic endogen mai mare. De exemplu, expresia completa a genei eps de la Streptococcus thermophilus Sfi6 intr-o tulpina de Lactobacillus lactis (MG 1363) a fost realizata. Valoarea comerciala a folosirii clonarii intreagului operon sau a grupurilor de gene asociate cu productia de exopolizaharide este reflectata de brevete si publicatii. Piata unor astfel de tulpini, trebuie sa fie supusa controalelor si acceptarii publice a acestor tipuri de produse. [35 ]

În afara de importanta de a creste productia de exopolizaharide in cazul bacteriilor lactice, acestea trebuie sa aiba efect functional dorit. Centrul acestui obiectiv este intelegere interactiunii intre diferite structuri ale exopolizaharidelor si componentele matricei alimentare la nivel molecular. Modelarea moleculara a fost folosita ca un instrument valoros in aceasta privinta. Faber si colaboratorii au descris o metoda pentru constructia unui model conformational a unei heteropolizaharide si au aplicat-o la o exopolizaharida produsa de Lactobacillus helveticus 766. Cercetarea in sinteza de polizaharide din bacterii lactice se afla inca in faza incipienta, iar cea mai mare parte a activitatii se refera la controlul structurii exopolizaharidelor din BAL prin intermediul glicosiltransferazei. S-a propus ca informatiile colectate de la genele care exprima aceste enzime, impreuna cu informatiile specificitatii donor-acceptor sa fie utilizate intr-o maniera combinatoriala de asamblare a unor mecanisme biosinthetice, care ar putea genera polizaharide, cu atribute structurale dorite. Exista potential pentru controlul formarii structurii exopolizaharidelor prin introducerea de noi sau deja existente glicosiltransferaze in bacteriile lactice. În plus, manipularea functiilor genelor implicate in exportul, polimerizarea, si determinarea lungimii lantului ar putea reprezenta un mijloc de a modifica structura exopolizaharidelor. Productia de o exopolizaharide dorite ar putea fi, de asemenea, realizata prin controlul conditiilor de cultura.

În unele cazuri, structura exopolizaharidelor a fost gasita ca ar depinde de sursa de carbon. Structural, analiza producerii de exopolizaharide la Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 crescuta in cultura continua a aratat ca exopolizaharidele au fost constituite prin repetarea de unitati de glucoza si galactoza (in raport de 1:2,4) cand au fost crescute in mediu cu fructoza; si de glucoza, galactoza si rhamnoza intr-o proportie de 1:70:0,8 cand au fost crescute intr-un amestec de fructoza si glucoza. Aceasta abordare ar putea sa nu fie aplicabila tuturor tulpini de bacterii lactice. De exemplu, compozitia exopolizaharidelor la tulpina Lactobacillus sakei 0-1 este independenta de tipul sursei de carbon folosite.

În concluzie, conversia relativ ineficienta a energiei din glucide de catre bacterii lactice, comparativ cu producatori aerobi de polizaharide prezinta o bariera in calea productiei economice. Cea mai valoroasa aplicare a ingineriei metabolice de productie a exopolizaharidelor in bacterii lactice este, cel mai probabil, ceea ce rezulta dintr-o combinatie de cantitatii si structurii, ceea ce da o valoare functionala sau anumite caracteristici alimentului in care exista. Pana acum, nu au fost raportate imbunatatiri semnificative in productia de exopolizaharide din bacterii lactice, din punct de vedere economic. Sunt necesare mai multe informatii in legatura cu reglarea sintezei exopolizaharidelor inainte ca un impact important sa fie observat in cantitatea specifica de polizaharide microbiene. O abordare integrata care necesita solutii metabolice multiple constrangerilor cailor metabolice ale exopolizaharidelor produse va fi probabil necesara, necesitand abilitati de combinare experimentale la nivel metabolic, molecular. Acest lucru va necesita un efort de cercetare, disponibilitate de energie, concurenta pentru precursori si substraturi, de expresia genelor si interactiuni fizico-chimice. [ 49, 28, 16, 15 ]

2.1. Screeningul tulpinilor producatoare de exopolizaharide

Nomenclatura utilizata la descrierea diferitelor tipuri de tulpini de BAL producatoare de exopolizaharide este dificila. Nu toate tulpinile ce produc stratul mucoid sau mucilaginos reprezinta tulpini producatoare de exopolizaharide. La ora actuala, cresterea nevoilor consumatorilor pentru noi produse lactate determina industria alimentara sa defineasca efectele exopolizaharidelor in produsele traditionale si sa caute noi tulpini producatoare. Izolarea de noi tulpini de BAL din medii pe baza de lapte sau nu, necesita utilizarea metodelor specifice de detectie a tulpinii dorite. În ultimii ani, s-au publicat cateva studii referitoare la screeningul de tulpini de BAL producatoare de exopolizaharide din alimente traditionale fermentate.

Mediul utilizat a fost mediul ESM (g/l): 90 g lapte degresat , 3,5 g extract de drojdie, 3,5 g peptona, 10 g glucoza pentru izolarea de BAL din muraturi, carnati, masline, branza si alte produse nelactate. Dupa izolare si cultivare, din peste 600 de tulpini testate, doar 30 au manifestat aceasta proprietate. Rezulta un procent de aproximativ 5%. Daca se creste concentratia de glucoza la 50 g/l, s-a reusit izolarea a 11 tulpini producatoare. [ 34 ]

De asemenea, s-au utilizat si alte glucide pentru izolarea si imbunatatirea capacitatii de detectie a tulpinilor producatoare de exopolizaharide. Au fost izolate tulpini diferite din genul Lactobacillus din alimente fermentate, sistem digestiv animal, placa dentara umana care produc exopolizaharide in mediu MRS suplimentat cu o concentratie (100 g/l) ridicata din diferite glucide, ca: glucoza, fructoza, maltoza, rafinoza, sucroza, galactoza sau lactoza.

Testele s-au realizat cu o incubare de 3 zile, la 37⁰C si o precipitare ulterioara realizata cu etanol pastrat la rece. S-a observat ca cea mai buna sursa de carbon a fost sucroza, obtinandu-se peste 100 mg/l exopolizaharide. S-a observat ca, cu cat sursa de carbon in mediu este mai mare, cu atat se determina mai multe tulpini producatoare si se realizeaza o cantitate mai mare de exopolizaharide la litru de mediu.

Studiile efectuate au demonstrat ca sursa de carbon adaugata mediilor de cultura joaca un rol important in detectarea tulpinilor ce sintetizeaza exopolizaharide. Cantitatea totala de polizaharide produse demonstreaza ca sunt puternic influentate de glucidele disponibile din mediu. Nu un glucid unic in mediul de cultura conteaza in obtinerea rezultatului, de cele mai multe ori. Aceste constatari sunt determinate de rezultatele testelor efectuate. [ 27 ]

De exemplu, o tulpina de Lactobacillus casei in mediul minimal ce contine glucoza a avut o productie mai mare decat in cazul utilizarii aceluiasi tip de mediu, dar cu un continut de lactoza sau galactoza. În schimb, o alta tulpina de Lactobacillus casei a produs de 1,7 ori mai multe exopolizaharide prin utilizarea galactozei, in comparatie cu glucoza. În acest caz, diferentele au fost corelate cu variatia activitatii enzimelor implicate in sinteza nucleotidelor glucidului ce actioneaza ca precursori ai unitatilor repetitive care construiesc Hexopolizaharide. O tulpina de Lactobacillus lactis var. cremonis produce cantitati insemnate de exopolizaharide prin folosirea glucozei, in comparatie cu fructoza.

Acest aspect a fost explicat prin activitatea scazuta a enzimei fructozobifosfatazei, care catalizeaza conversia fructozo - 1, 6 - difosfat in fructozo - 6 - fosfat, un pas esential in biosinteza lantului glucidic de la fructoza, dar nu si de la glucoza. Alte diferente in productia de exopolizaharide bazate pe sursa de carbon din mediul de cultura au fost atribuite prezentei diferitelor sisteme de transport al glucidelor in tulpinile BAL. Daca intra ca mono - si dizaharide in celula acesta reprezinta pasul initial al sintezei exopolizaharide

Pentru tulpini de Streptococcus thermophilus s-a demonstrat abilitatea de a produce exopolizaharide in medii bazate pe zer, precum si in medii complexe de laborator. Cantitatea de exopolizaharide nu a depasit, in mod normal, 400 mg/l, dar sunt studii care arata si obtinerea a 1,1 - 3 g/l. exopolizaharide produse de catre Streptococcus thermophilus care sunt heteropolizaharide ce contin lanturi de glucoza, galactoza si manoza si uneori N - acetil - glucozamina. Masa moleculara a acestor exopolizaharide variaza intre 1 - 9×10⁶ Da. [ 26 ]

Productia de exopolizaharide este stimulata de temperatura scazuta pentru tulpinile de Streptococcus thermophilus, desi in mod normal acest lucru nu stimuleaza sinteza, la fel ca si de cantitatile scazute de glucide adaugate in fermentatii semicontinue. Efectul pH a fost putin studiat, deoarece in putine fermentatii acesta a fost controlat. Se stie ca, in mediile de cultura ce contin lactoza pH ideal trebuie sa fie 7, iar in cele cu sucroza pH ideal este 5,5. Lactoza dintr-un mediu de cultura influenteaza atat cinetica productiei de exopolizaharide, cat si compozitia exopolizaharidelor. Sinteza de exopolizaharide cu tulpini de Streptococcus thermophilus a avut valori maxime in medii ce contin glucoza si fructoza si a avut valori scazute in prezenta lactozei si a sucrozei. [37 ]

Secretia si sinteza de exopolizaharide are loc in perioade diferite ale fazelor de crestere bacteriene si tipul polimerului este influentat de conditiile de crestere, cum ar fi temperatura si timpul de incubare. Cantitatea de exopolizaharide sintetizate nu este direct proportionala cu cresterea microbiana. În schimb, s-a gasit ca productia de exopolizaharide este adesea mai mare la temperaturi scazute. Schellhaass, Taggatz si Mozzi au aratat ca productia de exopolizaharide creste la tulpinile de Streptococcus thermophilus si Lactobacillus bulgaricus la temperaturi de fermentatie cuprinse intre 32 si 37⁰C, fata de o temperatura de 42⁰C.

Productia de exopolizaharide a bacteriilor lactice mezofile este cu peste 50% mai mare cand tulpinile sunt crescute la 25⁰C, fata de 30⁰C. Pentru unele tulpini de Lactococcus lactis subsp. cremonis, temperaturile de sub 20⁰C sunt utilizate pentru a sintetiza cantitati sporite de exopolizaharide. Propionibacterium acidi propionici produce mai multe exopolizaharide la 25⁰C, o temperatura mai scazuta decat cea optima de crestere. La aceste tulpini de propionibacterii, Skogen a demonstrat ca vascozitatea creste cu 100% cand sunt crescute la 15⁰C fata de 21⁰C sau la 21⁰C fata de 32⁰C. Din aceste cercetari reiese ca scaderea cresterii celulare determina o sinteza mai scazuta a polimerilor peretelui celular, lasand metabolismul sa sintetizeze exopolizaharide. [ 11 ]

Corectarea pH la 6 la un mediu de cultura pe baza de zer pentru cultivarea tulpinilor de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus si Lactococcus lactis se presupune ca determina sinteza de exopolizaharide deoarece are loc si o crestere a vascozitatii. Skogen si colaboratorii au aratat ca variatia nivelului pH initial al mediului are un efect direct asupra vascozitatii mediului. Astfel, cea mai ridicata vascozitate intr-un mediu pe baza de zer s-a obtinut la un pH de 6.

Multe cercetari asupra formarii de exopolizaharide de catre bacteriile lactice, utilizate la realizarea de produse probiotice, se realizeaza prin utilizarea de lactoza, ca si glucid fermentescibil. Astfel, se incearca realizarea sintezei de exopolizaharide, in general, intr/un mediu de cultura ce provine din lapte sau care are laptele ca si component principal, acesta fiind ultrafiltrat sau zerul concentrat. De curand, mediile de cultura cu compozitie strict definita au fost utilizate cu scces la sinteza de exopolizaharide utilizand tulpinile Lactobacillus casei si Lactococcus lactis subsp. cremonis. Facand o comparatie intre lapte sau zer, mediile sintetice determina o izolare mai rapida si mai usoara a exopolizaharidelor. De asemenea, faciliteaza studierea influentei componentelor individuale ale mediului, in special a sursei de carbon reprezentata de glucide.

Rezultate contradictorii au fost prezentate cu referire la efectul factorilor ce stimuleaza sinteza de exopolizaharide. Cresterea productiei de exopolizaharide si a multiplicarii celulare s-a obtinut cand cazeina a fost suplimentul adaugat la laptele degresat, in cazul culturilor de Lactobacillus bulgaricus. Desi nu s-a gasit o legatura directa intre prezenta cazeinei sau a proteinelor din zerul de lapte in mediile de cultura ale bacteriilor lactice termofile si mezofile si cresterea celulara la Lactobacillus bulgaricus, acestea au o influenta certa asupra sintezei de exopolizaharide. Este demonstrat faptul ca tulpinile de Lactobacillus bulgaricus sunt capabile sa produca cantitati reduse de exopolizaharide in lapte si lapte ultrafiltrat, pe cand cele de Streptococcus thermophilus nu. [ 4 ]

Se stie ca suplimentarea laptelui ultrafiltrat cu glucoza sau sucroza stimuleaza productie de exopolizaharide si conduce la modificari ale structurii exopolizaharidelor la tulpinile de Lactobacillus casei. Studiile realizate cu tulpinile de Lactococcus lactis subsp. cremonis au aratat ca se sintetizeaza cantitati relativ similare in medii de cultura cu compoziii standard in comparatie cu laptele.

Experimentele fermentative pentru producerea si analiza de exopolizaharide s-au realizat in principal in medii de cultura pe baza de zer suplimentat cu clorura de amoniu si lactoza. Mediile ce contineau extract de drojdie se suplimenteaza cu lactat, glucoza sau sucroza. Prin testarea a numerose surse de carbon, Skogen a demonstrat o crestere considerabila a vascozitatii atunci cand se folosette glucoza, maltoza si rafinoza ca sursa de carbon. De asemenea, exista studii care arata capacitatea tulpinilor de Streptococcus thermophilus de a sintetiza exopolizaharide in asociere cu tulpini de Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus.

Exopolizaharidele sunt sintetizate in diferite faze ale curbei de crestere si sub o diferite conditii de crestere in functie de tulpina utilizata la realizarea studiilor. Astfel, se cunosc doua mecanisme principale ale sintezei de exopolizaharide. Homopolizaharidele, de tipul levanului si dextranului, de catre leuconostoci si streptococi sunt procese extracelulare ce implica enzime care sunt secretate de catre bacterii.

Heteropolizaharidele sunt sintetizate printr-un sistem complex in care ele sunt produse la nivelul membranei citoplasmatice prin utilizarea de precursori formati intracelular. În contrast cu exopolizaharidelor si polizaharidele capsulare din bacterii gram negative, exopolizaharidele bacteriilor lactice sunt inca un aspect mereu nou de cercetate. Exista cercetatori care declara ca mecanismul propus pentru sinteza de exopolizaharide la bacteriile gram negative, este similar cu cel de la sinteza de exopolizaharide la bacteriile gram pozitive. Aceasta este pusa pe seama faptului ca structura de baza pentru polimerizare are cam aceleasi unitati glucidice repetitive.

Sinteza exopolizaharidelor bacteriene implica multe enzime care nu sunt unice la formarea acestor polimeri. Nucleotidele glucidice joaca un rol important in sinteza exopolizaharidelor: ele sunt forma activata a monoglucidelor si provin prin conversia monoglucidelor prin epimerizare, dehidrogenare si reactii de decarboxilare.

Lipidele sunt implicate in sinteza exopolizaharidelor. Lipidul implicat in sinteza polimerilor peretelui celular de tipul lipopolizaharidelor, peptidoglicanului si aciziilor teicoici este identic. Aceasta explica de ce productia de exopolizaharidele este redusa in cazul conditiilor in care este stimulata productia de lipopolizaharide sau acid teicoic, rezultand o competitie pentru acelasi mod de transport. Astfel, in general productia de exopolizaharide la bacteriile lactice este mai semnificativa la temperaturi scazute. Daca multiplicarea bacteriana este scazuta, formarea polimerilor peretelui celular este scazuta si fac ca o cantitate mai mare de izoprenoid fosfat sa fie disponibil pentru sinteza de exopolizaharide.

Metode actuale de izolare a exopolizaharidelor

Diferite medii de cultura au fost utilizate la studierea cantitativa si calitativa a exopolizaharide si la determinarea influentei nutrientilor in productia tulpinilor, biosinteza si genetica acestor biopolimeri in BAL. Mediile care sunt cel mai des mentionate contin lapte degresat si zer. A fost stabilit ca anumite conditii de cultivare si compozitia mediului de cultura (nu doar sursa de carbon) influenteaza cantitatea de exopolizaharide, dar si caracteristicile moleculare ale biopolimerilor. Alegerea unui mediu adecvat are o mare importanta data de faptul ca unele dintre aceste componente pot interfera cu productia de exopolizaharide. Astfel, extractul de drojdie, extractul de carne si peptona sunt responsabile pentru 94% din exopolizaharide sintetizate prin folosirea MRS ca mediu de crestere si sinteza a Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus. Studiile au aratat ca glucomananii prezenti in extractul de drojdie si peptona sunt materialul polimerului - glucidic care interfera cu cuantificarea exopolizaharide intr-un mediu de cultura complex. Mediile semisintetice elimina componentele care interfera cu o cuantificare a exopolizaharide. Mediile care contin strict sursa de carbon, aminoacizi, vitamine, saruri minerale faciliteaza analiza exopolizaharide

În general, complexitatea metodei utilizate pentru izolarea si purificarea exopolizaharide depinde de compozitia mediului de cultura utilizat. O procedura simpla consta in dializa mediului de cultura (dupa indepartarea celulelor), urmata de liofilizare. Aceasta tehnica a fost utilizata la izolarea exopolizaharide sintetizate de catre Lactoccocus lactis var. cremonis care a fost cultivata in mediu semisintetic. Precipitarea cu etanol poate fi utilizata la izolarea exopolizaharide sintetizate de tulpini termofilice (Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus, Streptococcus thermophilus) si mezofilice de BAL (lactococi si lactobacili). Cu cat mediul de cultura creste in complexitate, o etapa suplimentara de purificare este necesara pentru a reduce continutul in proteina si alti compusi. Pentru exopolizaharidele obtinute din medii cu continut proteic ridicat se utilizeaza precipitarea cu cantitati diferite de TCA (cuprinse intre 4 si 14%), digestia cu proteaze sau o combinatie a acestora.

O singura precipitare a proteinelor cu TCA 12% urmata de o dializa si liofilizare a supernatantului se utilizeaza la izolarea exopolizaharide produse de catre BAL din iaurt. Aceeasi procedura se foloseste si la izolarea de exopolizaharide produse in lapte de Lactococcus lactis var. cremonis. Cel mai utilizat protocol pentru mediile de cultura complexe implica precipitarea cu TCA si indepartarea proteinelor prin precipitare, urmata de concentrarea exopolizaharide prin precipitare cu etanol. Diferentele obtinute prin aceasta metoda sunt cuprinse intre 5 si 15%. Mai putin utilizata este precipitarea exopolizaharidelor dupa adaugarea de TCA cu acetona, in locul etanolului.

Alte cercetari prezinta o izolare a exopolizaharidelor din lapte dupa precipitarea proteinelor cu pronaza E provenita de la Streptomyces griseus, care are o specifitate mare a substratului. Se foloseste la izolarea exopolizaharide produse de catre tulpini starter termofilice si mezofilice, precum si de catre tulpini de Bifidobacterium longum. Dupa inactivarea termica a pronazei si etapa de concentrare (evaporare sau ultrafiltrare), exopolizaharidele se precipita cu etanol. Rezultatele prezinta variatii de aproximativ 10%. În final, o combinatie a precipitarii cu TCA si digestia cu proteaza a fost utilizata pentru culturile iaurtului.

Pe langa indepartarea proteinelor si precipitarea exopolizaharide, alte metode au fost utilizate pentru purificarea lor, cum ar fi tehnicile de filtrare ca microfiltrarea, ultrafiltrarea si diafiltrarea. Filtrarea prin membrane sintetice permite separarea exopolizaharide de molecule cu greutate mica prezente in mediile de cultura complexe. Diferentele dintre tehnicile de filtrare se bazeaza in principal pe variatiile dimensiunilor porilor membranelor. Dupa indepartarea celulelor prin centrifugare, protocolul de izolare include:

microfiltrarea supernatantului printr-o membrana ceramica (dimensiunea porilor de 14 mm, factor de concentrare 14);

ultrafiltrarea microfiltratului cu membrana de polisulfonat (limita de excludere molara 10kDa, factor de concentrare 10);

diafiltrarea cu aceeasi membrana de ultrafiltrare, impreuna cu 20 volume apa deionizata, dupa care produsul este liofilizat.

Dupa un astfel de proces de purificare, pudra liofilizata contine 63% exopolizaharide, 18% proteine, 8% cenusa, 6% resturi bogate in manan si 5% apa. Se mai poate realiza o purificare a liofilizatului cu 80% etanol, ce contine 0,1% acid formic pentru a favoriza solubilizarea proteinelor. Urmeaza o spalare cu etanol 96%, continutul de exopolizaharide crescand la 72%, iar cel de proteine scazand la 6%. Celelalte componente raman cu aceleasi procente. În unele cazuri, alte tratamente pot fi aplicate pentru cresterea continutului in exopolizaharide, cum ar fi coloanele schimbatoare de ioni, digestia cu DNA-za.

În general, metoda utilizata la izolarea fractiei exopolizaharidice exercita o influenta puternica asupra cantitatii totale de exopolizaharide obtinute. Diferite metode au fost utilizate pentru a determina exopolizaharide bacteriilor kefirului in lapte si mediu bazat pe zer.

Metodele au necesitat 1 pana la 2 etape de precipitare cu etanol, o etapa de precipitare cu etanol urmata de dializa cu membrane de 1000, 6000 si 12000 Da si precipitare cu TCA. Rezulta ca tratamentul termic al probei ca prim pas al izolarii exopolizaharidelor este critic pentru recuperarea completa a polimerului. [ 33, 42, 50 ]

O singura precipitare cu etanol nu elimina in totalitate lactoza reziduala. Precipitarea cu TCA reduce cu aproximativ 50% cantitatea de exopolizaharide recuperata, rezultand un biopolimer coprecipitat cu proteine. Aceasta este procedura aleasa cand o intreaga caracterizare fizico-chimica a exopolizaharide este ceruta, deoarece rezulta fractia polizaharidica cu impuritati.

Aplicatiile exopolizaharidelor produse de catre tulpini de bacterii lactice

Functia biologica exacta a exopolizaharidelor sintetizate de catre celulele bacteriene nu a fost complet elucidata, nici pana in acest moment. Pana la ora actuala exista rezultate care arata ca exopolizaharidele microbiene au un rol important in pierderea apei de catre celulele microbiene si, in general, extrapoland, la nivelul organismului prin fecale.

De asemenea, aceste polizaharide previn fagocitoza si atacul fagilor, avand si rol de protectie impotriva antibioticelor si a numeroase substante toxice (ioni metalici, dioxid de sulf, etanol). Pe langa toate aceste aspecte general acceptate, exopolizaharidele aduc numeroase beneficii sanatatii umane prin sinteza directa a lor la nivelul intestinului uman. În mod indirect, prin utilizarea lor in industria produselor lactate fermentate, acestea prin consum ajung sa isi exercite efectul pozitiv.

Aceste polizaharide s-a demonstrat ca au unele efecte imunostimulatoare, antitumorale, efecte antiulcer si de scaderea a colesterolului. Exopolizaharidele au o contributie consistenta la absorbtia ionilor metalici. Homopolizaharidele (glucanii si fructanii) sunt implicati in aderenta bacteriilor la altele sau la suprafata intestinala, prin modularea difuziei substantelor si prin faptul ca pot servi ca rezerve energetice extracelulare. [ 1, 2 ]

De exemplu, in industria alimentara si farmaceutica se utilizeaza multe tipuri de polizaharide si stabilizatori datorita proprietatilor de legare a apei, formarii de gel, ca si agenti de ingrosare, precum si celor de formare de vascozitate. Cele mai des intalnite sunt carbohidratii din plante (amidonul, gumele, pectina si alginatul) sau hidrocoloizi de origine animala (gelatina si cazeina). Xantanul produs de catre bacteria Xanthomonas campestris a fost prima exopolizaharida microbiana utilizata in industria alimentara, cosmetica si farmaceutica. Cu toate acestea, utilizarea sa nu este permisa in majoritatea tarilor europene si in USA.

În schimb, exopolizaharidele produse de catre bacterii lactice si-a castigat o popularitate ridicata, datorita faptului ca sunt considerate sigure si sunt utilizate ca si stabilizatori naturali. Pe langa toate acestea, in ultima perioada de timp se observa un interes crescut pentru exopolizaharidele produse de catre culturile probiotice de bacterii lactice datorita cererii crescute a consumatorilor pentru produse lactate fermentate cremoase si cu un continut scazut in grasimi. Astfel sinteza de exopolizaharide determina realizarea de produse cu o consistenta corespunzatoare.

La ora actuala, tulpinile de Streptococcus thermophilus si Lactobacillus bulgaricus sunt indispensabile de la fabricarea produselor de tipul iaurtului din șarile Uniunii Europene, deoarece suplimentarea cu aditivi este strict interzisa. Sunt utilizate deoarece cresc vascozitatea si imbunatatesc textura laptelui fermentat. De foarte multe ori vascozitatea mediului nu este influentata de catre cantitatea de exopolizaharide, dar datorita structurii lor diferite rezulta un comportament reologic caracteristic.

Exopolizaharidele sunt formate de catre bacteriile lactice in timpul fabricarii produselor din lapte fermentat, actionand ca si agent de ingrosare si emulsificator sau la cresterea proprietatilor reologice. De asemenea, se sintetizeaza in timpul colonizarii intestinului de catre bacteriile lactice probiotice, dar au si un rol extrem de important in cresterea capacitatii de formare a biofilmului. Se considera, ca aceasta proprietate este una esentiala in formarea biofilmului de catre o tulpina probiotica lactica. [ 37 ]

Orice studiu a biofilmelor trebuie sa accepte ca acestea se pot dezvolta intr-un numar foarte mare de medii, si ca structurile intrinseci al unui singur biofilm constituit in conformitate cu toate caracteristicile pot fi unice pentru un mediu si microflora. Un numar foarte mare de specii microbiene sunt capabile de a forma biofilm. În conditii naturale, biofilmele formate de catre o singura specie sunt relativ rare. Astfel, cele mai multe biofilme sunt compuse din amestecuri de microorganisme. Aceasta adauga la interactiunile interspecifice si intraspecifice si complexitatea generala a amestecului macromolecular prezent.

Exopolizaharidele sintetizate de celule microbiene variaza foarte mult in compozitia lor si, prin urmare, in proprietatile chimice si fizice. Unele sunt neutre macromolecular, dar majoritatea sunt polianionice datorita prezentei fie a acizilor uronici sau legate de piruvat. Reziduurile anorganice, cum ar fi de fosfat sau, rareori, sulfat, pot, de asemenea, conferi statutul de polianionic.

Foarte putine exopolizaharide pot fi chiar policationice, ca exemplu polimerul adeziv, obtinut din tulpini de Staphylococcus epidermidis asociate cu biofilmele. Compozitia si structura exopolizaharidelor determina structura primara a biofilmelor. Mai mult, configuratia secundara se prezinta sub forma de agregate helicale. Polizaharidele pot astfel forma diferitelor tipuri de structuri in cadrul unui biofilm. Cu toate acestea, in biofilme polizaharidele nu exista libere, dar pot interactiona cu o gama larga de alte specii moleculare, inclusiv lectine, proteine, lipide, etc, precum si cu alte polizaharide. Structura tertiara cuprinde o retea de polizaharide si alte macromolecule, in care celulele si produsele celulare sunt, de asemenea, prinse in acea retea.

În ciuda unor relatari ca existenta biofilmului este specific anumitor polizaharide, exista putine dovezi concludente pentru a sprijini astfel de afirmatie. O problema majora este de a obtine suficiente exopolizaharide, care sunt cu adevarat componente ale biofilmului.

În prezent exopolizaharidele biofilmului sunt componenti siguri corespunzatoare polimerilor sintetizati de catre celulele planctonice. Acest lucru a fost demonstrat prin utilizarea de anticorpi impotriva exopolizaharidelor celulelor planctonice si, de asemenea, prin comparatie a produselor de digestie planctonice si exopolizaharidelor biofilmului folosind polizaharaze specifice. Astfel poate fi crescuta in exces productia de polizaharide, ca parte a unui raspuns la stres, asa cum este vazut in sinteza acidului colanic de la Escherichia coli si alte specii de enterobacteriene. Aceste bacterii capabile de a forma mai multe tipuri de polizaharide pot produce cantitati mai mari fata de culturile planctonice; acest lucru din nou, este, probabil, parte a unui raspuns de stres.

Un rezultat ale acestui efect a fost rapotat in compozitia polizaharidelor, aproape sigur, datorita proportiei variabile de diferite polizaharide sintetizate in biofilm. Acest lucru este valabil in biofilmele care contin un amestec de specii microbiene. În acestea, trebuie amintit faptul ca tipurile relativ diferite de polizaharide si proportiile celulelor microbiene prezente va depinde foarte mult de statutul fiziologic din biofilm. Astfel de biofilme sunt, de asemenea, putin probabile sa aiba o compozitie uniforma. În consecinta, nici o proba luata pentru analiza nu va reprezenta numai o singura parte a compozitiei de exopolizaharide. Astfel, rezulta variatii in compozitia amestecului fiind rezultatul diferentei de sinteza din componenta polimerilor. De asemenea, este foarte posibil ca in biofilme subpopulatiile diferite ar putea avea diverse micro-medii care sa conduca la producerea de diferite amestecuri de polizaharide. [36 ]

Cantitatea exopolizaharidelor sintetizate in biofilm va depinde foarte mult de disponibilitatea substratului de carbon (atat din interiorul, cat si din afara celulelor), iar echilibrul consta in raportul dintre substratul de carbon si alte substante nutritive. Prezenta in exces a substratului de carbon si limitari in alte elemente nutritive, cum ar fi azot, fosfat de potasiu, va promova sinteza exopolizaharidelor. Cresterea bacteriana lenta observata in cele mai multe biofilme, de asemenea, sporesc productia exopolizaharidelor. Este clar dintr-o serie de studii ca mutantele ce prezinta imposibilitatea de a sintetiza exopolizaharide nu sunt in masura sa-si formeze biofilmul. În biofilmele naturale izolate, cea mai mare parte a bacteriilor ce nu sintetizeaza biofilme se prezinta ca si celule separate.

Cu toate acestea, in cazul in care bacteriile sunt componente ale biofilmului, prezenta unor specii care produc cantitati mari de exopolizaharide sporesc stabilitatea altor tipuri de celule, chiar daca ele insele nu sintetizeaza exopolizaharide. Aceste efecte au fost considerate ca stabilizator de James si colaboratorii.

Asa cum s-a aratat de catre Skillman si colaboratorii, proportiile diferitelor exopolizaharide in biofilm nu reflecta proportiile dintre celulele prezente, cum exopolizaharidele nu contribuie in mod egal la structura si proprietatile biofilmului.

Multe dintre aceste polizaharide sunt relativ solubile, si din cauza masei moleculare mari, rezulta solutii apoase foarte vascoase.

Cateva vor forma geluri slabe, care se dizolva in exces de solvent, pe suprafata expusa a biofilmului. Modificarile se pot produce cand ionii sunt prezenti. Unii ioni mai specifici pot interactiona cu gruparile expuse ale acizilor carboxilici. Diversi cationii pot concura pentru acelasi sit, asa cum au demonstrat Loaec si colaboratorii.

Ioni obligatorii pot fi mai putin specifici. Cationii uneori pot fi importanti in determinarea gradului de interactiune intre lanturile de polimer. În cele mai multe cazuri, prezenta cationii multivalenti, cum ar fi Ca²⁺ va duce la formarea de helixuri mai extinse decat ioni monovalenti, cu toate ca unele polizaharide seamana cu carragenanul si dezvaluie agregate dublu helicale in prezenta K⁺.

Exopolizaharidele contribuie direct la proprietatile biofilmului, in sensul ca in mod normal, permita o cantitate considerabila de apa de a fi legata. Aceasta nu este o caracteristica larg examinata. Cu toate acestea, polizaharide pot lega pana la 1 kg de apa/g polizaharide. Este probabil ca multe dintre EPS, in biofilm leaga cantitati mai mici, in timp ce unele, exclud de cele mai multe ori apa din structura lor tertiara. EPS vor contribui de asemenea la stabilitatea mecanica a biofilmului,care sa le permita sa reziste la fortele de forfecare considerabile. În unii polimeri, interactiunea cu ionii pot genera geluri relativ rigide, care sunt mai putin deformate de forfecare, astfel producand un biofilm mult mai stabil. [25 ]

Mayer si colaboratorii au sugerat ca biofilmele s-ar putea prezenta, ca structuri de tip gel, dar acestea pot fi foarte slabe si, prin urmare, pot fi usor distruse de forfecare sau prin dizolvarea polizaharidelor.

Nu trebuie uitat faptul ca un numar mic de EPS, din cauza compozitiei lor si structurii tertiare, ar putea fi de fapt hidrofobe. Altii au localizate regiuni hidrofile si hidrofobe care le confera proprietati foarte diferite la multe tipuri de biofilme.

În concluzie, un biofilm (Figura 2.3.2.) este bine organizat prin cooperarea comunitatii de microorganisme. Celulele microbiene se ataseaza la suprafetele existente si dezvolta un biofilm. Celule asociate biofilmului se diferentiata de cele in suspensie prin rata de crestere redusa, si generarea de matrice extracelulara polimerica. Studiile genetice au aratat ca biofilmele se formeaza in mai multe etape. Ele necesita semnalizare intracelulara si transcriu seturi diferite de gene diferite de la celulele planctonice.

Prin urmare, formarea biofilmelor poate fi privita ca un proces de dezvoltare, care isi imparte unele dintre caracteristici cu alte procese de dezvoltare bacteriena. Dezvoltarea bacteriilor si activitatea este substantial imbunatatita prin includerea unor suprafete de care microorganisme s- ar putea atasa (efect de sticla). Unele cercetari, au observat ca numarul de bacterii de la nivelul diferitelor suprafete a fost mult mai ridicat decat in medii inconjuratoare.

Odata cu utilizarea de tehnici noi ce folosesc, rosu ruteniului si tetraoxid de osmiu, au fost, de asemenea, in masura sa demonstreze ca substanta extracelulara polimerica (EPS) este formata din polizaharide. O mare parte din sdudiile din ultimele doua decenii au elucidat multe aspecte cu privire la biofilme, prin utilizarea microscopului electronic si cercetarea genelor implicate in adeziunea celulara. [ 11 ]

Formarea biofilmelor are loc treptat si consta in formarea stratului de conditionat, dezvoltarea bacteriilor, adeziunea bacteriana (Figura 2.3.2.) si expansiunea biofilmelor. Biofilmele pot exista pe toate tipurile de suprafete, cum ar fi plastic, metal, sticla, particule de sol, lemn, materiale medicale - implant, tesuturi si produse alimentare. Atasamentul bacterian este mediat de fimbriae, pilli, flagella si exopolizaharide care actioneaza prin formarea de punti intre bacterii. Biofilmele, in natura, pot avea un nivel ridicat de organizare si in ele pot exista comunitatile de specii unice sau multiple, s-au poate fi format dintr-un singur strat sau dintr- o structura tridimensionala.

Important din perspectiva sanatatii publice este rolul biofilmelor in rezistenta la medicamentele antimicrobiene si combaterea acesteia prin integrarea sau inlocuirea cu cele din bacterii lactice. Diverse efecte asupra sanatatii au fost atribuite bacteriilor lactice, cum ar fi prevenirea si tratamentul diareei acute la copii, prevenirea diareei asociate antibioticelor, prevenirea si tratamentul diferitelor alergii, precum si, ocazional, efecte benefice pentru alte tulburari. Cu toate acestea, modul de actiune al bacteriilor lactice legat de aceste efecte de imbunatatire a sanatatii este, in principal necunoscut. Capacitatea de aderenta si colonizarea sunt considerate ca fiind factori ce contribuie la modularea raspunsului imunitar, excludere de patogeni si imbunatatirea contactului cu mucoasa de catre bacteriile probiotice.

În acest fel, probioticele ar fortifica rezistenta microbiotei ca o bariera impotriva agentilor patogeni. În studii comparative, bacteriile lactice determina o aderenta buna in vitro la celulele epiteliale si mucus. Astfel, bacteriile lactice studiate sunt capabile sa adere la mucoasa intestinala si sa persiste peste o saptamana dupa o administrare orala in cazul adultilor.

În plus, administrarea orala de bacterii lactice la gravide a fost raportata ca duce la colonizarea la copiii pana la 24 luni. În plus, bacteriile lactice sunt, de asemenea, in masura sa colonizeze gura si pot persista in saliva timp de 2 saptamani dupa ingestie.

Acesta capacitate de colonizarea ar fi legata de efectul inhibitor al bacteriilor lactice asupra dezvoltarii clinice a cariilor dentare la copii. Cu toate ca majoritatea bacteriilor lactice au fost initial izolate de la oameni, ele sunt, de asemenea, in masura sa colonizeze tractul digestiv al soarecilor. Lactobacillus rhamnosus s-a dovedit a fi asociat atat cu mucoasa stomacului si intestinului acestor soareci.

Multe bacterii lactice aderente apar in medii naturale, in componenta biofilmelor in cazul in care acestea sunt continute in matricea extracelulara care sa le protejeze impotriva conditiilor ostile de mediu. Biofilmele, de asemenea, joaca un rol in relatia dintre corpul uman si microbii gazduiti, la nivel intestinal. [ 11 , 12 ]

Capitolul 3. Materiale si metode

3.1. Mediile utilizate pentru izolarea si cultivarea acestor tulpini au fost medii specifice bacteriilor lactice:

Ø     Pentru izolarea bacteriilor lactice s-a folosit mediu Man-Rogosa-Sharpe (MRS) g/l: peptona-10.0; extract de carne-5.0; extract de drojdie-5.0; glucoza-20.0; K₂HPO₄-2.0; Tween 80-1ml; citrat de amoniu dibazic-2.0; acetat de sodiu-5.0; MgSO₄ x 7H₂O-1.0; MnSO₄ x H₂O -0.5; pH = 6,5 (De Man J.C., 1960).

Ø     Pentru selectia tulpinilor care biosintetizeaza acid lactic s-a utilizat mediu MRS + CaCO₃ 1%. Deoarece in momentul adaugarii CaCO₃ are loc o alcalinizare a mediului, a fost necesara ajustarea pH-ului mediului MRS inainte de sterilizare la pH 6,5 cu solutie de HCl 37%.

Material biologic:

Tulpinile utilizate la realizarea studiilor propuse sunt :

Lactobacillus rhamnosus 1

Lactobacillus rhamnosus 4.2

Lactobacillus paracasei IL 2

Lactobacillus plantarum IL 3

Tulpinile sunt pastrate la -82⁰C, in glicerol 20%. Revitalizarea tuturor tulpinilor s-a facut prin doua cultivari succesive pe mediu MRS.

3.3. Conditii de cultivare:

Urmatoarea etapa a studiului a fost determinarea, pentru fiecare tulpina, a sursei de carbon (glucoza, lactoza, sucroza) in scopul obtinerii unei cantitati mai mari de exopolizaharide, precum si a timpului maxim de fermentatie. Odata glucidul stabilit, se va determina concentratia optima prin cresterea valorii la 5, 10, 15 si 20%.

Toate testele se vor realiza pornind de la mediul standard MRS si prin inlocuirea glucozei cu lactoza si sucroza Testele s-au desfasurat pe o perioada de 72 de ore, cu probe luate la fiecare 24 de ore.

3.4. Izolarea si determinarea cantitatii de exopolizaharide:

Fiecare proba a fost tinuta 10 minute la 100⁰C intr-o etuva Memmert, dupa care racita pe baie de gheata. Precipitarea proteinelor s-a facut prin adaugare de 15% acid tricloracetic. Celulele microorganismului si proteinele s-au indepartat prin centrifugare la 5.000 rpm, timp de 10 minute intr-o centrifuga Hettich Eba 32R cu racire.

Exopolizaharidele sintetizate au fost precipitate din supernatantul rezultat prin adaugare de doua volume de etanol 100%. Amestecul se lasa peste noapte la 4⁰C si polizaharidul se indeparteaza prin centrifugare cu acceasi centrifuga la 13.000 rpm, timp de 15 minute.

Determinarea densitatii optice

Pentru a se urmari gradul de dezvoltare al celulelor de bacterii din mediul de fermentatie, se face o determinare colorimetrica la un spectrofotometru de tip Heidolf (λ = 600 nm) dupa o prealabila diluare cu apa distilata. În acest scop 1 ml de mediu de fermentatie omogen, se dilueaza cu 9 ml de apa distilata, se agita si se citeste extinctia la spectrofotometru in cuva de un cm fata de martor reprezentat de apa distilata. Calculul densitatii optice se realizeaza dupa urmatoarea formula: D.O. = E₆₀₀ × 10, unde:

E₆₀₀ - extinctia citita la 600 nm;

10 - dilutia probei.

Se mentioneaza faptul ca pe parcursul procesului de fermentatie se pot utiliza si alte dilutii in functie de capacitatea de crestere,pentru a putea efectua masuratorile.

3.6. Determinarea producerii de acid lactic:

Se urmareste acumularea de acid lactic in cazul mediilor de cultura utilizate. Aciditatea s-a determinat prin titrare cu NaOH 0,1N, prin utilizarea unui titrator automat. Pentru determinare se ia in consideratie faptul ca 1 ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g acid lactic.

Capitolul 4. Rezultate si discutii:

Stabilirea sursei de carbon, temperaturii si pH la cultivarea tulpinilor Lactobacillus rhamnosus 1 si Lactobacillus rhamnosus

Influenta sursei de carbon (glucoza, lactoza, sucroza) asupra celor doua tulpini de Lactobacillus a fost studiata prin determinarea densitatii optice, a productiei de acid lactic si de exopolizaharid. Rezultatele sunt prezentate in Tabelul 4.1.1.

Din datele prezentate reiese ca sucroza este sursa de carbon cu ajutorul careia se obtine cea mai mare cantitate de exopolizaharide, la 48 de ore de fermentatie. Aceste constatari sunt valabile pentru ambele tulpini, 41 mg/L pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1, si respectiv 74 mg/L pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus

De remarcat pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 4.2 este faptul ca, la utilizarea sucrozei, la 48 de ore de fermentatie, se obtine o cantitate de exopolizaharide cu aproximativ 50% mai mare. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1 nu se observa acelasi fenomen. Din contra, cantitatea de exopolizaharide obtinute se mentine constanta.

Prin utilizarea de glucoza se obtine cea mai mica cantitate de exoplizaharide, chiar si la 72 de ore de fermentatie. Prin utilizarea de lactoza, pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1, cantitatea de polizaharid este apropiata de cea realizata cu sucroza, 38 mg/L.

Sinteza de acid lactic este maxima tot la utilizarea sucrozei ca sursa de carbon. Aceasta se constata pentru ambele tulpini utilizate, cu un plus pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 4.2 la 72 de ore de fermentatie.

Din determinarea densitatii optice reiese faptul ca valoarile mici se obtin acolo unde sinteza de exopolizaharide este maxima. Aceasta inseamna ca tulpinile utilizeaza cu preponderenta sursa de carbon pentru sinteza de exopolizaharide si nu pentru multiplicarea lor. În cazul celorlalte doua surse de carbon , predomina cresterea celulara, in special atunci cand se utilizeaza glucoza. Prin utilizarea de lactoza se creeaza un echilibru relativ intre cresterea celulara si sinteza de exopolizaharide.

Tabelul 4.1.1. Influenta sursei de carbon asupra sintezei de exopolizaharid

În Tabelul 4.1.2. este prezentata cantitatea de exopolizaharid sintetizata de catre cele doua tulpini in cazul cresterii concentratiei de sucroza la 5, 10, 15 si 20%. Din analiza datelor prezentate reiese ca, la o concentratie de 15% sucroza, se obtine cantitatea maxima de polizaharid. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 cantitatea maxima obtinuta este de 55 mg/L. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 cantitatea maxima obtinuta este de 145 mg/L. Pentru ambele tulpini timpul necesar sintezei maxime de polizaharid este de 48 de ore.

Din datele prezentate reiese ca, pentru Lactobacillus rhamnosus IL1, suplimentarea cantitatii de sucroza la 15% determina o crestere a sintezei de polizaharid cu aproximativ 25%. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4 cresterea realizata este cu aproximativ 51% mai mare. În general, tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 sintetizeaza doar 38% din cantitatea obtinuta prin cultivarea tulpinii Lactobacillus rhamnosus IL4.

Si in cazul densitatii celulare se observa o crestere semnificativa a valorilor realizate pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4. Din rezultatele obtinute rezulta ca sinteza de exopolizaharide are loc in timpul fazei exponentiale de crestere, in ultima perioada a sa. Sinteza are loc atunci cand tulpinile tind sa intre in faza stationara.

Tabelul 4.1.2. Influenta concentratiei de sucroza asupra sintezei de exopolizaharid

Daca temperatura scade sau creste, pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 se observa o scadere a cantitatii sintetizate de exopolizaharide. Maximul obtinut se regaseste la 37⁰, fapt observat la ambele tulpini (Figura 4.1.3. si Figura 4.1.4.). La temperaturi de 30 sau 45⁰C, sinteza de exopolizaharide aproape ca inceteaza. Aceasta constatare este corelata si cu aceea ca multiplicarea tulpinilor Lactobacillus rhamnosus IL1 si Lactobacillus rhamnosus IL4.2 este extrem de scazuta, fapt confirmat de o densitate optica foarte mica.

Facand o comparatie intre cele doua tulpini, rezulta ca Lactobacillus rhamnosus IL4.2 este mai puternic influentata de cresterea sau scaderea temperaturii, fata de Lactobacillus rhamnosus IL1. La tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 scaderea sau cresterea temperaturii determina doar scaderi ale sintezei de exopolizaharide. Tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 are o variatie foarte mare a capacitatii de sinteza a polizaharidelor la 24, 48 si 72 de ore de fermentatie.

Din punct de vedere al pH, se observa ca scaderea sau cresterea sa inhiba semnificativ sinteza de exopolizaharide (Figura 4.1.5. si Figura 4.1.6.). O cantitate mai mica de exopolizaharide rezulta daca pH scade sub valoarea 7.

De asemenea, valorile extreme de pH (2, 4 si 10) inhiba total sinteza, fapt corelat in mod direct si cu inhibitia cresterii celulare. Tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 are o capacitate de sinteza mai mare atat la pH 8, cat si la pH 6, la 48 de ore de fermentatie.

Scaderea sau cresterea pH cu o unitate, la tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2, determina obtinerea unei cantitati similare de exopolizaharide, reprezentand doar aproximativ 30% din cantitatea obtinuta la pH 7, de 145 mg/L.

4.2. Stabilirea sursei de carbon, temperaturii si pH la cultivarea tulpinilor Lactobacillus paracasei IL2 si Lactobacillus plantarum IL3

Influenta sursei de carbon (glucoza, lactoza, sucroza) asupra celor doua tulpini de Lactobacillus a fost studiata prin determinarea densitatii optice, a productiei de acid lactic si de exopolizaharid. Rezultatele sunt prezentate in Tabelul 4.2.1

Tabelul 4.2.1 Influenta sursei de carbon asupra sintezei de exopolizaharid

Pentru tulpina Lb. bulgaricus 2 prin utilizarea celor 3 surse de carbon rezulta ca glucoza este cea mai buna. Se observa un maxim la 48 de ore de fermentatie de 201 de mg/L. Pentru lactoza si sucroza maximul cantitatii de exopolizaharide se observa la 24 de ore de fermentatie, 122 si respectiv 117 mg/L. Din datele prezentate reiese ca utilizarea glucozei, in comparatie cu celelalte doua surse de carbon, determina obtinerea unei productii de exopolizaharide cu aproximativ 50% mai mari. Utilizarea glucozei determina si obtinerea valorii maxime a densitatii optice, tot la 48 de ore de fermentatie. Aceasta inseamna ca sinteza de exopolizaharide se realizeaza in timpul fazei logaritmice de crestere.

Pentru lactoza si sucroza, sinteza exopolizaharidului are loc in prima parte a fazei de crestere logaritmice. Aceasta constatare reiesind din aceea ca faza de crestere continua si dupa obtinerea cantitatii maxime de polizaharid. Sinteza de acid lactic urmeaza profilul celei de exopolizaharid. Exceptie este atunci cand se foloseste glucoza cand nu exista o sincronizare.

Odata stabilita sursa de carbon, glucoza, cu ajutorul careia se obtine cea mai mare cantitate de exopolizaharide, in Figura 4.2.3. si Figura 4.2.4 este prezentata cantitea de polizaharid obtinuta in prezenta a diferite concentratii de glucoza. Testele s-au realizat atat pentru tulpina Lactobacillus paracasei IL2, cat si pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3.

Pentru ambele tulpini folosite rezulta ca la o concentratie de 10% glucoza la 48 de ore de fermentatie rezulta cea mai mare cantitate de exopolizaharide sintetizate. Indiferent de ce cantitate de polizaharid se foloseste rezulta ca tot la 48 de ore de fermentatie se obtine valoarea maxima.

În cazul cultivarii la diferite valori de temperatura nu se observa o crestere a cantitatii de exopolizaharid sintetizat, in comparatie cu cea de la 37⁰C. Acelasi lucru se observa si in cazul pH. La pH 7 se obtine cantitatea maxima de polizaharid sintetizat. Scaderi semnificative ale sintezei se observa atat la cresterea, cat si la scaderea valorilor de temperatura si pH. Aceste constatari sunt valabile pentru ambele tulpini testate.

În cazul cultivarii tulpinii Lactobacillus paracasei IL2, la 35 si 40⁰C, Figura 4.2.5, sinteza scade cu aproximativ 92% pentru ambele valori de temperatura. Pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3, Figura 4.2.6., se observa o scadere cu 60% a sintezei exopolizaharide, la aceleasi valori de temperatura.

Din Figura 4.2.7. reiese ca scaderea sau cresterea pH cu o unitate determina o scadere cu aproximativ 75% a sintezei de exopolizaharid, in cazul tulpinii Lactobacillus paracasei IL2. Pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3, Figura 4.2.8., scaderea pH cu o unitate reduce sinteza de exopolizaharide tot cu aproximativ 75%. Pe cand, cresterea pH cu o unitate, determina o scaderea cu peste 90%. Aceste constatari sunt facute la 48 de ore de fermentatie, atunci cand in conditiile prezentate, tulpinile au o sinteza maxima.

Din datele obtinute rezulta ca ambele tulpini produc cantitati insemnate de exopolizaharide, daca sursa de carbon (glucoza) are concentratii mari, de 10 g/L.

De asemenea, reies unele diferente referitoare la multiplicarea tulpinilor la diferite concentratii de glucoza. Cea mai semnificativa diferenta este aceea ca la 10 g/L glucoza, se obtine cea mai mare cantitate de biomasa (exprimata prin densitate optica). Aceasta este corelata si cu cantitatea de exopolizaharide obtinute. La cresterea concentratiei de glucoza, cantitatea de biomasa obtinuta remane constanta, in schimb are loc o scadere a exopolizaharidelor sintetizate.

Concluzii

Din testele efectuate rezulta ca tulpinile Lactobacillus sp. IL1 si Lactobacillus sp.IL4.2 sunt capabile sa sintetizeze exopolizaharide atunci cand sursele de carbon sunt reprezentate de glucoza, lactoza si sucroza. Cea mai mare cantitate de exopolizaharide se obtine atunci cand se utilizeaza sucroza, in concentratie de 15%, la 48 de ore de fermentatie. Se obtin 55 mg/L, pentru tulpina Lactobacillus sp. IL1 si 145 mg/L, pentru tulpina Lactobacillus sp. IL4.2. Scaderea sau cresterea valorii 7 a pH si a temperaturii de fermentatie, 37⁰C, determina scaderea sintezei de exopolizaharide. Aceasta constatare este corelata cu o multiplicare mai redusa, indiferent de valorile de pH sau temperatura folosite.

2. Lactobacillus paracasei IL2 si Lactobacillus plantarum IL3 sunt capabile sa produca exopolizaharide, atunci cand sursa de carbon difera, in mediul MRS. Cele mai bune rezultate fiind gasite atunci cand se foloseste glucoza. Odata cu cresterea cantitatii de glucide, creste si cantitatea de exopolizaharide sintetizate, aceasta fiind corelata si cu o crestere a cantitatii de biomasa obtinuta. O marire a cantitatii de glucide, peste 10%, nu are ca efect si cresterea capacitatii de sinteza a tulpinilor sau a numarului de celule viabile.

3. Pentru realizarea partii experimentale s-au utilizat tulpinile de bacterii lactice Lactobacillus sp. IL1 , Lactobacillus sp.IL4.2 , Lactobacillus paracasei IL2 si Lactobacillus plantarum IL3 cultivate pe mediu Man-Rogosa-Sharpe ( MRS ) si mediu MRS + CaCO3, care contin ca sursa de Carbon : glucoza, lactoza si sucroza.

4. Principalii parametrii analizati au fost : determinarea sursei de Carbon, a temperaturii , a ph-ului, a densitatii optice si a producerii de acid lactic.

Bibliografie

1. Alan D. Welman1,2 and Ian S. Maddox, 2003, Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges, TRENDS in Biotechnology, 21, 269 - 274.
2. Al-Tahhan, R. A., Sandrin, T. R., Bodour, A. A. & Maier, R. M., 2000, Rhamnolipid-induced removal of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa: effect on cell surface properties and interaction with hydrophobic substrates. Appl Environ Microbiol, 66, 3262±3268.
3. Burne, R. A., Wen, Z. T., Chen, Y.-W. M. & Penders, J. A. E. C., 1999, Regulation of expression of the fructan hydrolase gene of Streptococcus mutans GS-5 by induction and carbon catabolite repression. J Bacteriol, 181, 2863-2871.
4. Boels, I.C. et al., 2001, Sugar catabolism and its impact on the biosynthesis and engineering of exopolysaccharide production in lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 11, 723-732.
5. C. Ni Mhurchu, C. Dunshea-Mooij, D. Bennett, A. Rodgers, Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuals: A systematic review of randomized controlled trials, Obesity, 6 (2005) 35-42.
6. C.C. Lim, L.R. Ferguson, G.W. Tannock, Dietary fibres as prebiotics: Implications for    colorectal cancer, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 609-619.
7. C.S. Brennan, L.J. Cleary, The potential use of cereal (1-3, 1-4)-beta-D-glucans as functional food ingredients, J. Cereal Sci. 42 (2005) 1-13. J. WARRAND: Healthy Polysaccharides, Food Technol. Biotechnol. 44 (3) 355-370 (2006) 369
8. C. Delattre, P. Michaud, B. Courtois, J. Courtois, Oligosaccharides engineering from plants and algae applications in biotechnology and therapeutics, Minerva Biotec. 17 (2005) 107-117.
9. Chabot, S. et al., 2001, Exopolysaccharides from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured immunocompetent cells, and IFN-g in mouse splenocytes., Lait 81, 683-697.

10. Cui, W., Winter, W. T., Tanenbaum, S. W. & Nakas, J. P., 1999, Purification and characterization of an intracellular carboxylesterase from Arthrobacter viscosus NRRL B-1973. Enzyme Microb Technol 24, 200-208.
11. C R Kokare, S Chakraborty, A N Khopade and K R Mahadik, 2009, Biofilm: Importance and applications, Indian Journal of Biotechnology, 8, 159-168.
12. Duboc, P. and Mollet, B., 2001, Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. Int. Dairy J., 11, 759-768.

13. De Vuyst, L. and Degeest, B., 1999, Exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Technological bottlenecks and practical solutions.Macromol. Symp., 140, 31-41.
14. De Vuyst, L. et al., 2001, Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 11, 687-707.
15. Degeest, B. and De Vuyst, L., 2000, Correlation of activities of the enzymes a-phosphoglucomutase, UDP-galactose 4-epimerase, and UDP-glucose pyrophosphorylase with exopolysaccharide biosynthesis by Streptococcus thermophilus LY03. Appl. Environ. Microbiol., 66, 3519-3527.
16. De Ruyter, P.G. et al., 1996, Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol., 62, 3662-3667.
17. De Vos, W.M. et al., 1998, Making more of milk sugar by engineering lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 8, 227-233.
19. Faber, E.J. et al., 2002, Modelling in aqueous solution of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus 766. Biopolymers, 63, 66-76.
20. German, B. et al., 1999, The development of functional foods: lessons from the gut. Trends Biotechnol., 17, 492-499.
21. G.G. Gelders, J.P. Duyck, H. Goesaert, J.A. Delcour, Enzyme and acid resistance of amylose-lipid complexes differing in amylose chain length, lipid and complexation temperature, Carbohydr. Polym. 60 (2005) 379-389.

40. H. Taniguchi, Carbohydrate research and industry in Japan and the Japanese society of applied glycoscience, Starch/ Stärke, 56 (2004) 1-5.

22. Grobben, G.J. et al., 1996, Influence of fructose and glucose on the production of exopolysaccharides and the activities of enzymes involved in the sugar metabolism and the synthesis of sugar nucleotides in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 279-284.
23. Hosono, A. et al., 1997, Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidobacterium adolescentis M101-4. Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 312-316.
24. Hugenholtz, J. and Kleerebezem, M., 1999, Metabolic engineering of lactic acid bacteria: overview of the approaches and results of pathway rerouting involved in food fermentations. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 492-497.
25. Hols, P. et al., 1999, Conversion of L. lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering. Nat. Biotechnol., 17, 588-592.
26. I.A. Brownlee, A. Allen, J.P. Pearson, P.W. Dettmar, M.E. Havler, M.R. Atherton, E. Onsoyen, Alginate as a source of dietary fiber, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 45 (2005) 497-510.
27. Ian W. Sutherland, 2001, Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework, Microbiology, , 3-9.
28. J. Warrand, H.G. Janssen, b-lactoglobulin glycoconjugates: Impact of the degree of polymerization of sugars on the Maillard reaction kinetic, Abstracts of Glyco XVIII, Florence, Italy (2005).
29. .J. Galvez, M.E. Rodriguez-Cabezas, A. Zarzuelo, Effects of dietary fiber on inflammatory bowel, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 601-608.
30. J. Rudolfova, L. Curda, Galactooligosaccharides as prebiotics and their production from lactose, Chemicke Listy, 99 (2005) 168-174.
31. Jolly, L. et al., 2002, Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 82, 367-374.
32. Jolly, L. and Stingele, F., 2001, Molecular organization and functionality of exopolysaccharide gene clusters in lactic acid bacteria. Int.Dairy J., 11, 733-745.
33. Kitazawa, H. et al., 1998, Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Int. J. Food Microbiol., 40, 169-175.
34. Kleerebezem, M. et al., 1999, Exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis: from genetic engineering to improved rheological properties? Antonie Van Leeuwenhoek 76, 357-365.
35. Kleerebezem, M. et al., 2002, Metabolic engineering of Lactococcus lactis: the impact of genomics and metabolic modelling. J. Biotechnol., 98, 199-213.
36. Laws, A. et al., 2001, Biosynthesis, characterisation, and design of bacterial exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Biotechnol. Adv., 19, 597-625.
37. Laws, A.P. and Marshall, V.M., 2001, The relevance of exopolysaccharides to the rheological properties inmilk fermented with ropy strains of lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 11, 709-721.
38. Looijesteijn, P.J. et al., 2000, Influence of different substrate limitations on the yield, composition, and molecular mass of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. Cremoris in continuous cultures. J. Appl. Microbiol., 89, 116-122.
39. Lamothe, G.T. et al., 2002, Genetic and biochemical characterization of exopolysaccharide biosynthesis by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Arch. Microbiol., 178, 218-228.
40. Lopez De Felipe, F. et al., 1998, Cofactor engineering: a novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase. J. Bacteriol., 180, 3804-3808.
41. Levander, F. et al., 2002, Enhanced exopolysaccharide production of Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol., 68, 784-790.
42. Levander, F. and Ra°dstro¨m, P., 2001, Requirement for phosphoglucomutase in exopolysaccharide biosynthesis in glucose- and lactoseutilizing Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol., 67, 2734-2738.
43. M. McIntosh, B.A. Stone, V.A. Stanisich, Curdlan and other bacterial (1-3)-beta-D-glucans, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2005) 163-173.
44. Macedo, M.G. et al., 2002, Effect of medium supplementation on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M in whey permeate. Int. Dairy J., 12, 419-426.
45. Mozzi, F. et al., 2003, UDP-galactose 4-epimerase: a key enzyme in exopolysaccharide formation by Lactobacillus casei CRL 87 in controlled pH batch cultures. J. Appl. Microbiol., 94, 175-183.
46. Mollet, B. and Stingele, F., 1996, Genes of exopolysaccharide biosynthesis of Streptococcus and their use in the development of novel exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria. European Patent Application EP 750042.
47. Osterreicher-Ravid, D., Ron, E. Z. & Rosenberg, E., 2000, Horizontal transfer of an exopolymer complex from one bacterial species to another. Environ Microbiol 2, 366-372.
48. R.N. Tharanathan, Starch-value addition by modification, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 45    (2005) 371-384.
49. 78.R.F. Tester, J. Karkalas, X. Qi, Starch-composition, fine structure and architecture, J. Cereal Sci. 39 (2004) 151-165.
50. Ruas-Madiedo, P. et al., 2002, An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 12, 163-171.
51. Rallu, F. et al., 2001, Streptococcus thermophilus operons involved in exopolysaccharide synthesis. PCT International Application WO179500.
52. Rickard, A. H., Leach, S. A., Buswell, C. M., High, N. J. & Handley, P. S., 2000, Coaggregation between aquatic bacteria is mediated by specific growth phase dependent lectin saccharide interactions. Appl Environ Microbiol 66, 431-434.
53. S.S. Koide, Chitin-chitosan: Properties, benefits and risks, Nutr. Res. 18 (1998) 1091-1101. 370 J. WARRAND: Healthy Polysaccharides, Food Technol. Biotechnol. 44 (3) 355-370 (2006)
54. Stingele, F. et al., 1996, Identification and characterization of the eps (exopolysaccharide) gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6. J. Bacteriol., 178, 1680-1690.
55. Stingele, F. et al., 1999, Lactic acid bacterial genes involved in exopolysaccharide biosynthesis and encoded glycosyltransferases. PCT International Application WO 9954475.
56. Tuinier, R. et al., 1999, Isolation and physical characterization of an exocellular polysaccharide. Biopolymers, 49, 1-9.
57. Van Kranenburg, R. et al., 1997, Molecular characterization of the plasmid-encoded eps gene cluster essential for exopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol., 24, 387-397.
58. Van Kranenburg, R. et al., 1999, Genetics and engineering of microbial exopolysaccharides for food: approaches for the production of existing and novel polysaccharides. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 498-504.
59. V. Fogliano, P. Vitaglione, Functional foods: Planning and development, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 256-262.
60. Villain-Simonnet, A., Milas, M. & Rinaudo, M., 2000, A new bacterial polysaccharide (YAS34). I. Characterization of the conformations and conformational transition. Int J Biol Macromol 27, 65-75.