TUBERCULOZA

TUBERCULOZA
DEFINITIE. ETIOLOGE

Istoric

n     Tuberculoza- boala infectocontagioasa

n     Identificata la mumiile egiptene si schelete din epoca de piatra

n     Hippocrate gaseste legatura cauzala intre ftizie-hemoptizie, si intuieste caracterul contagios

n     evul mediu -localizare pulmonara insotita de casexie

n     Renasterea demostreaza extensia si la alte organe

n     Percival Pott (1720) descrie tuberculoza osoasa cu localizare vertebrala

n     Braille (1810) descriu tuberculii si evolutia spre ulcerare

n     Laennec intemeietorul metodei anatomoclinice precizeaza caracterul leziunilor tuberculoase( materia tuberculoasa cenusie ,ulterior galbena opaca)

n     Ranke sistematizeaza in 3 stadii evolutia tuberculozei:

-afect primar,

-perioada secundara de diseminare

-perioada tertiara de ftizie

n     Villlemin stabileste transmisibilitatea maladiei 1865

n     Koch 1882 evidentiaza bacilul tuberculozei, cultivarea lui, punctul de plecare in studiul imunitatii, primul plan de profilaxie

n     Rontgen 1896 a evidentiat "Razele X"(premiu Nobel 1902 !)

n     Cl von Pirquet utilizeaza tuberculina la cutireactie

n     1920 Uniunea Internationala Contra Tuberculozei la Paris

n     1921 Calmette si Guerin prepara vaccinul antituberculos dupa 13 ani de cercetare

1943:ERA MEDICANETELOR ANTITUBERCULOASE !!!

n     Waksman decopera SM 1943, HIN 1952, RMP 1965

n     Babes 1887 in Romania

n     Ioan Cantacuzino 1926 conserva tulpina originala de BCG

n     !926 primul dispensar antituberculos la Cluj-Daniello

n     1942 Leon Daniello -prof titular la catedra de Ftiziologie

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA

n     Ordinul ACTINOMYCETALES: structura citologica si citochimica similara bacteriilor tipice; au analogii cu micetele filamentoase,

n     4 genuri: actinomycetaceae,

n     streptomycetaceae,

n     actinoplanaceae,

n     mycobacteriaceae,

n     Genul Mycobateriaceae: acidoacoolerezistenta, aspectul de bastonas ( myces=ciuperca, mucegai

n     bacterion=bastonas).

n     CLASIFICARE:

n     1. dupa patogenitate:

n     -patogene exclusiv pt om: M leprae

n     -patogene ptr.om, animale si pasari: Complexul M.t.( hominis, bovis,africanum),

n     -oportuniste majore: kansasii, avium, xenopi, scrofulaceum,

n     -oportuniste minore: ranae, chelonei, terrae,

n     -saprofite: gordonae, flavescens, phei,     smegmatis.

n     2. dupa viteza de crestere (dezvoltare de colonii):

n     -cu crestere lenta: strict patogene-compl.M.t,

n     -M.leprae,

n     grupul fotocromogene- kansasii, marinum, simiae, africanum,

n     grupul scotocromogene- scrofulaceum, szulgai, gordonae,

n     grupul necromogene-comp.avium intracel, ulcerans, xenopi,

n     -cu crestere rapida: grI-necromogene (fortuitum, chelonei),

n     gr.II-termofile ( smegmatis, phei),

n     gr.III-scotocromogene ( flavescens),

n     gr. IV-aletele ( vacae).

MORFOLOGIA MICROSCOPICA

n     MICROSCOPUL OPTIC:

n     -acido-alcoolorezistenta

n     - bastonase drepte sau incurbate cu capete rotunjite,

n     - lungime: 1-5

n     - grosime: 0,2-0,4

n     - necapsulate, nesporulate,imobili

n     - dispozitia in gramezi( un plus de rezistenta) sau filamente

n     MICROSCOPUL ELECTRONIC:

n     Perete celular tristratificat

n     Dublat pe fata interna de m.celulara,

n     Membrana invaginatii citoplasmatice cu rol de mitocondrii ( mezosomi),

n     Citoplasma: structura nucleara: AND, granulatii, vacuole, incluzii citoplasmatice.

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

n     PARAZITISM OBLIGATORIU: indiv.Genului M,

n     Cultivarea M. se face pe medii artificiale speciale: Löwenstein Jensen,

n     Compozitie: saruri minerale, glicerina (sursa de C), asparagina, clorura de amoniu ( sursa de N), ou, amidon ( fecula de cartof), verde malachit ( indicator de pH),

n     Medii sintetice: Youmans, Sula, Dubos,

n     Conditii de dezvoltare: T=37,5-38°C, pH=7-7,5, aerobioza obligatoriu,

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

n     Cresterea: lenta ( durata de viata a unei generatii=18-24 h),

n     Primele microcolonii punctiforme: 10-15 zile, maturarea dupa 3-4 saptamani (tipul bovin dupa 2 luni),

n     Aspectul coloniilor: IDENTIFICAREA MYCOBACTERIEI,

n     M.t.hominis: colonii, proeminete, verucoase, uscate, rugoase ( tip R= rough), culoare galbuie, dezvoltarea este eugonica pe toata suprafata mediului ,

n     M.t.bovis: coloniile sunt netede, plate, culoare albicioasa, aspect cremos ( tip S- smouth), cresterea mai putin luxurianta ( caracter disgonic), lent in 2 luni.

n     M.t.hominis sub actiunea medicamentelor antituberculoase: aspect disgonic,

n     Din cultura matura fortiu ( col. Z-N): prezenta cord factor asigura dispunerea in forma de benzi serpuitoare ( substratul virulentei)

n     Absenta cord factor: M.t.bovis, hominis ( tratat cu medic) dispunere in gramezi compacte

STRUCTURA BIOCHIMICA

n     80-85%: apa, 15-20% reziduu uscat,

n     Saruri minerale, substante organice: lipide ( 30-40%), proteine, glucide,

n     Lipide: -caracterul .hidrofob al peretelui celular,

n     -fixeaza colorantii greu colorantii( fuxina fenicata, fluorcromii),

n     -acidoalcoolorezistenta la acizi, eteri, acetona, (in special prin ac micolic).

STRUCTURA ANTIGENICA

n     ANTIGENE PASIVE incapabile sa produca Ac, dar actioneaza specific cu Ac

n     Proteinele: reprezentantul tuberculina,

n     IDR: dg. Infectiei tuberculoase,

n     Este netoxica ptr. Org. animal neinfectat,

n     Produce hipersensibilitate de tip intarziat la org. alergizate sp. Prin M.bacilare,

n     Glucidele: legate de prot, lipide, ac.nucleici,

n     Enzime: amilaze, transaminaze, ureaze, fosfolipaze, lipaze, catalaze.

n     ANTIGENE ADEVARATE produc Ac in vivo si reproduc leziuni anatomopatologice

n    

REZISTENTA LA AG.FIZICI, CHIMICI

n     Rezistenta deosebita: lipide ( hidrofobia), gruparea in gramezi, invelis organic ( saliva),

n     Rezistenta la frig: - 180°C, rezistenta la uscaciune,

n     DISTRUGERE:

n     1. UV: componenta UV a luminii albe mor in 10 min

n     2. caldura umeda: fierbere, autoclavare ( timp raportat la gradul de infectare), 2 min prin fierbere,

n     3. substante antiseptice: formol la 50 grade, cloramina 5-10%, lizol, detergenti cationici, clorura de var20%,

n     4. medicamente antituberculoase ( bactericide ).

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

n     PRODUSUL PATOLOGIC:

n     1. EXPECTORATIA( sputa, saliva):

n     A. Recoltarea corecta: recipiente speciale, identitate,

n     Dimineata, a jeun, inainte de mancare, toaleta, inainte de inceperea tratamentului

n     Spontan: tuse

n     provocare a tusei: aerosoli, spalatura bronsica, iritatia faringe, ef.fizic cu glota inchisa,

n     Dirijat: endoscopie bronsica, sondaj gastric matinal,

n     Se recolteaza cel putin 3 esantioane din produsul patologic ( 10-12), in zile consecutiv,

Produsul patologic

n     2.Urina de dimineata

n     3.Sperma sau sange menstrual sau sange bioptic dupa chiuretaj

n     4.Lichid pleural

n     5.LCR

n     6. Aspirat de maduva osoasa

n     7. Lichid ascitic, pericardic

n     8. Fragmente de peritoneu, intestin , ganglioni

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

n     2. Transportul si prelucrarea: cat mai rapid ( pastrare la +4°C, max.5 zile, transport in cutii spaciale-lemn, metal) in laboratoare dotate in acest sens,

n     Decontaminare cu fosfat trisodic15%, antibiotice cu spectru larg

n     EVIDENTIEREA M.T. SE FACE PRIN: metode clasice (ex.M direct, dezvoltarea pe mediile de cultura, inocularea la animalul de laborator), metode moderne de evidentiere a M.t.

n     EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT:

n     Metoda simpla, rapida, ieftina, usor repetabila,fara aparatura sofisticata si personal superspecializat

n     DESCOPARA RAPID MARII ELIMINATORI DE B: criterii ptr. Inceperea traatmentului, izolarea bolnavului,

n     Controlul sterilitatiiexpectoratiei

n     Metode: coloratia Ziehln Neelsen ( fuxina fenicata la cald, flurocromi la rece),

n     Sensibilitatea metodei creste prin: concentrarea produsului patologic ( centrifugare, flotatie), omogenizare ( fluidificare cu NaOH),

n     Limite: sensibilitate (nr. mare de bacili 5.000-10.000pe ml ),

n     Nu ofera inf. asupra viabilitatii bacililor, identitatii, sensibiltatii la medic.antitub, Interpretarea rezultatelor.

Examenul microscopic

n     Se bazeaza pe proprietatea comuna tuturor speciilor de mycobacterium-acidoalcoolorezistenta

n     In celula patrund greu coloranti ( se folosesc mordanti sau caldura), dar odata intrati pot fi greu de extra cu ajutorul acizilor, alcoolului si a altor substante de decolorare

n     BAAR este o rezistenta la decolorare

n     persista si la cadavrele de bacili

n     Poate disparea prin procese enzimatice, tratamente tuberculostatice, UV

METODA ZIEHL-NEELSEN

n     Colorarea la cald a frotiului cu fuxina fenicata

n     Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric

n     Recolorare cu sol de albastru de metilen(verde malachit, acid picric)

n     Bacili rosii, subtiri, incurbati pe fond albastru (verde sau galben)

n     Tehnica Margineanu coloreaza la rece folosind xilol amestecat cu fuxina fenicata

Tehnica cu auramina-rodamina

n     Examenul microscopic in lumina fluorescenta

n     Colorare la rece cu ajutorul fluorocromilor ( auramina sau rodamina)

n     Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric

n     Recolorare cu permmmanganat de potasiu pentru diminuarea fluorescentei nespecifece

n     Examinare cu obiectiv uscat, la microscop dotat cu examinare pentru fluorescenta la care se anexeaza sursa UV, in camera intunecata

Examinarea frotiurilor

n     La coloratiile obisnuite obiectiv de 100x si un ocular de 10x, in imersie cu ulei de cedru

n     Rezultatul examinariise exprima cantitativ9Nr de bacili pe 300, 100 sau 25 de campuri microscopice examinate

n     BAAR/100 campuri-1-9 BAAR/100 camp

n     BAAR 1+ -10-99b/100 camp

n     BAAR2+    -1-10b/100camp

n     BAAR3+    >10b/100 campuri

n     In fluorescenta permite evidentierea bacililor cu un obiectiv slab maritor(25), cu obiectiv de 20x si ocular de 10x, iar campul microscopului acopera o suprafata mai mare de aproape 16x, ceea ce scurteaza timpul de examinare

n     Bacili portocalii stralucitori pe fond intunnecat

n     Examinarea frotiului 1-2 min permite parcurggerea a 30 de campuri, ce coincide cu examinarea a cel putin 300 de camopuri la M cu imersie

n     Rezultate 0 BAAR/30 camp negativ

n     1-5 bacili se noteza nr exact

n     Se imparte nr de BAAR la 10

Cauze de eroare fals positive

n     -particule alimentare, precipitate, zgarieturi

n     -precipitate de coloranti, granule de polen in sputa

n     - spori de Bacillus subtilis, nocardia, alte micabacterii saprofite

n     -transferul de pe o lama pozitiva pe una negativa la colorare, saubacili aderenti in uleiul de cedru

Erori fals negative

n     Recoltare incorecta a expectoratie ( saliva)

n     Expunerea directa la soare a produsului patologic sau dupa mai mult de o saptamana

n     Fixarea necorespunzatoare a frotiului

n     Supraincalzirea sau contact insuficient cu fuxina

n     Citirea prea rapida sau superficiala a lamelor( sau daltonismul examinatorului)

Dezvoltarea pe medii de cultura

n     Mycobacteriile sunt pretentioase, necesitand medii speciale complexe, aerobioza obligatorie, temperatura optima de 37 grade si au dezvoltare lenta

n     Sursa de carbon( hidrocarbonate ca glucoza, glicerol)

n     Sursa de azot ( aminoacizi ca asparaginina, sau acidul glutamic, sau oua ser sau bulion de carne)

n     Ioni esentiali (Fierul si magneziu)

n     Verde malachit ca indicator de ph , bactericid si colorare de mediu facand mai vizibile coloniile de M

n     Mediu solid Lovenstein Jensen

n     Medii lichide Youmans, dubos, Middlebrook

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

n     EXAMINAREA PRIN CULTURI.

n     Insamantarea produsului patologic pe mediul de cultura,

n     Incubare la 37°C,

n     Citirea tuburilor la 3-7-14 -21-30-45-60

n     Aspectul coloniilor mature: identificarea tipului ( tipizarea coloniei),

n     Avantaje: sensibilitate ( produse paucibacilare ce contin 10-100 bacili),

n     Procedeu selectiv de confirmare al dg. etiologic M.t,

n     Viabilitatea bacililor, identificarea b, sensibilitatea (ABG),

n     Dezavantaje: metoda laborioasa, costisitoare, latenta rezultatelor de 2 luni,

Micobacterii atipice

n     Fotocromogene nu se pigmenteaza la intuneric, la lumina determinand aparitia pigmentului galben

n     Scotocromogeni au colonii colorate in portocaliu atat la intuneric cat si la lumina

n     Nefotocromogeni absenta pigmentarii sau pigment gri sau crem neinfluentat de lumina

n     Micobacterii cu crestere rapida se dezvolta in 2-5 zile

n     Testul catalazei pozitive

n     si testul Konno negativ

Interpretarea rezultatelor la culture

n     Absenta coloniilor - negativ

n     Mai putin de 30 de col -Nr exact/tub

n     30-100 coloni- cultura 1+

n     >100 colonii izolate -2+

n     Colonii confluente- 3+

n     Colonii de suprainfectie - cultura suprainfectata

Testarea sensibilitatii la tuberculostatice

n     Metode directe- insamantarea produselor patologice pe medii de cultura ce contin diferite concentratii de tuberculostatice,

n     Metode indirecte-Din cultura pura izolata se inoculeaza pe tuburi cu tuberculostatice,

Avantajele si dezavantajele insamantarii prin culturi

n     AVANTAJE

n     Mult mai sensibila decat microscopi 10 bacili/ml sputa)

n     depisteaza asimptomatici

n     diferentierea de cadavrele de bacili

n     identificarea tipului de mycobacterii

n     prin inglobbarea tuberculostaticelor testarea sensibilitatii

n     DEZAVANNTAJEccostisitoare

n     rezultate finale peste 60 de zile (pentru medii solide).

DIAGNOSTIC POZITIV

n     METODE MODERNE DE DETECTIE A M.T.

n     1. Detectia rapida a diviziunii (BACTEC):

n     Principiu: masurarea CO2 marcat cu carbon radioactiv (14 C), eliberat in timpul multiplicarii in cultura lichida ( sursa de C este ac. Palmitic marcat cu 14 ),

n     Metoda este sensibila ( detectarea unor cant. Minime de 14C, in timp scurt 10-21-28 zile.

n     MB Bact Utilizeaza mediile lichide si un sistem computerizat de citire pe principii colorimetrice, ceea ce permite obbtinerea mai rapida a rezultatelor

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

n     INOCULAREA LA ANIM. DE LABORATOR:

n     Metoda sensibila, inocularea prod.patol. la animale de experienta ( cobai, iepure),

n     Metoda laborioasa, costisitoare,

n     Metoda de alternativa: nesigura la bolnavii tratati, utilizata in situatii de exceptie ( Tub. extrapulmonara)

n     Pentru cercetare

n     2. NAP-test.

n     Principiu: NAP: nitro acetil amino hidroxipropiofenon) inhiba dezvcltarea M.t. h. si b. dar nu si pe cele atipice,

n     Dg.# cu M.atipice ( in 5 zile).

n     3. Cromatografia ac. Micolici.

n     Principiu: determinarea. profilului ac.micolici ( sunt specifici cant. Si calit. fiecarei specii ai g. My),

n     Identificarea in 24 h, doar M.t. in cultura pura.

n     4. Sonde genetice.

n     Principiu: separarea lant de AND sub act. Caldurii,

n     Fiecare lant, la temp. se reasociaza ( hibrideaza) specific cu lantul specific, fiecare secventa nucleotidica cu secventa nucleotidica complementara,

n     Sonde genetice: secvente nucleotidice artificiale se hibrideaza cu secv. Complementara,

n     Sondele permit in cateva ore identificarea col. M.t,

n     Un singur produs patologic.

n     5. Detectarea ac. tuberculostearic.

n     Pricinpiu:prin cromatografie gazoasa ( spectrofotometrie de masa),

n     Ac. Micolic este prezent la toate M.t,

n     Evidentierea ac. Tuberculostearic indica o infectie tuberculoasa,

n     Metoda este sensibila, dar necesita un volum mare de munca si costisitoare.

n     6. Serodiagnosticul in detectarea antigenelor M.t.

n     Principiu: RFC, hemaglutinarea, hemagregarea, precipitarea si difuziunea in gel, imunofluorescenta, ELISA,

n     Antic. Monoclonali si antig.recombinate,

n     Se apreciaza gradul de activitate a tuberculozei.

n     7. amplificarea genomica prin reactia de polimerizare in lant ( PCR).

n     Principiu: AND polimeraza respons. de replicarea AND e capabila sa copieze in vitro secv. Sp. Ale AND cu cond. De a dispune de tipare, ele insele specifice,

n     Utilizarea AND polimeraza sp-Taq polimeraza a carei termoresistenta ii confera rezistenta la temperaturi inalte se poate amplifica pana la 1.000.000 X secventa de AND pe care dorim sa-l detectam,

n     Metoda: este laborioasa, costisitoare, prea sensibila ( uneori se inregistreaza o amplificare nespecifica sau contaminarea prod. Patol. De catre AND exogen).