Sterilizarea prin caldura uscata

Sterilizarea prin caldura uscata

Flambarea consta in trecerea obiectului de sterilizat prin flacara sau trecerea flacari pe suprafata obiectului.

Aplicatii: sterilizarea lamelor de microscop,a gurii eprubetelor,suprafetei externe a pipetelor,a custilor de animale,a meselor.

Incalzirea la rosu consta in mentinerea obiectului de sterilizare in flacara pana la incandescenta.

Aplicatii: sterilizarea ansei de insamantare si spatulelor.

Sterilizarea cu aer supraincalzit se realizeaza in cuptoare electrice (ex: etuva Poupinel).

Aplicatii: sterilizarea sticlariei,a obiectelor din ceramica sau portelan,a instrumentului metalic fara suduri din cositor.

Fazele sterilizarii la etuva

Pregatirea materialului consta in spalarea ,uscarea aplicarea dopurilor de vata la eprubete,pipete si ambalare obligatoriu in hartie alba.

asezarea materialelor pe rafturile etuvei.

Conectarea etuvei la sursa de caldura. In functie de temperatura stabilita materialele se lasa un anumit timp la sterilizat,iar cel mai folosit program este 180 timp de 30 minute.

Cel mai bun indiciu ca sterilizarea a fost bine efectuata il reprezinta culoarea bruna a hartiei de ambalaj.

Sticlaria sterilizata la etuva nu poate fi utilizata in laboratoarele de virusologie datorita gudroanelor rezultate in timpul sterilizarii din hartie.

Cap. 2. Sterilizarea prin caldura umeda

Fierberea se realizeaza cu ajutorul sterilizatoarelor. Se utilizeaza apa distilata la care se adauga carbonat de sodiu sau Borax din doua motive:

pentru a ridica punctul de fierbere al apei

pentru a preveni corodarea instrumentului metalic. Timpul de fierbere este de 30 minute din momentul fierberii apei.

Aplicatii: sterilizarea instrumentului (foarfeci, pense, bisturie, siringi, dopuri de cauciuc, etc.).

Tindalizarea sau incalzirea factionala sau discontinua. Consta in incalzirea de 3 ori succesiv a produsului de sterilizat la temperaturi cuprinse intre 56 si 100^oC timp de 1 pana la 3 ore, iar intre incalziri produsul se mentine la termostat adica 24 ore la 37^oC.

Aplicatii: sterilizarea mediilor de cultura ce contin ingrediente care se denaturalizeaza la temperaturi superioare celei de 100^oC. (exemplu: medii cu ou, solutii concentrate de glucide, polialcooli, serul coagulat, etc.).

Autoclavarea este sterilizarea cu ajutorul vaporilor de apa supraincalziti sub presiune. Se realizeaza cu ajutorul autoclavului.

Partile componente ale autoclavului:

un cazan metalic cu pereti dubli prevazuti cu tub de nivel

un gratar metalic pe care se aseaza materialele

un capac care se inchide etans

o supapa de siguranta

un manometru

un termometru

un robinet care are dublu rol, de admisie evacuare a aerului

o sursa de caldura

Etapele autoclavarii:

se verifica nivelul apei distilate din cazan

se introduc containerele cu materiale pe suport

se inchide capacul

se deschide robinetul de admisie - evacuare si se conecteaza la sursa de caldura

In momentul in care jetul de vapori devine continuu se inchide se inchide robinetul si se reduce sursa de caldura astfel incat presiunea si temperatura sa fie constante un anumit timp. Cel mai utilizat program de autoclevare: temperatura 120 C, presiunea 1 atmosfera, timpul 30 min.

Dupa scurgerea timpului se opreste sursa de caldura ,iar cand momentul arata 0, se deschide robinetul de admisie a aerului, apoi capacul.

Controlul autoclavarii se realizeaza cu ajutorul unor martori ai autoclavarii de exemplul substante chimice sub forma de cristale cu punct de topire cunoscut (ex. floarea de sulf cu punct de topire de 115^oC.).

Aplicatii:sterilizarea sticlariei mediilor de cultura, instrumentarului, infectelor.

Microbiologia este o ramura a stintelor biologice care se ocupa cu studiul microorganismelor .Denumirea ei deriva de la cuvintele grecesti micro = mic , invizibil cu ochiul liber , bios = viata , logos = stiinta .

In conceptul de microorganism se incadreaza virusurile ,bacteriile , ciupercile microscopice ,protozoarele ,algele unicelulare .

Prin intelegerea in cadrul microbiologiei nu se studiaza decat 3 grupe taxoni : virusurile, bacteriile , ciupercile microscopice.

Bacteriologia generala

Caracterele generale ale bacteriilor:

bacteriile sunt organisme vii unicelulare , invizibile cu ochiul liber cu un mod de organizare de tip procariot(structurile prezente in interiorul celulei nu sunt marginite de membrane proprii, ce vin in contact direct una cu cealalta.

In compozitia lor chimica contin ambele tipuri de acizi nucleici(ADN dublu catenar , cilcular inchis covalent si ARN cu cele 3 forme de existenta ale sale; ARN ribozoman , de transport sau solubil si mesager).

In functie de modul in care isi obtin energia necesara pentru realizarea proceselor vitale , bacteriile se impart in 2 mari grupe: majoritatea folosesc energia rezultata din degradarea substantelor chimice si acestea alcatuiesc grupa bacteriilor chimiosintetizante

Altele mai putine ,folosesc reactiile fotochimice(lumina) si acestea alcatuiesc grupa bacteriilor fotosintetizante .

Bacteriile se multiplica foarte rapid in special prin procese asexuate (fara schimb de material genetic intre parteneri) prin diviziune directa (schiziparitate).

Bacteriile sunt dotate cu o mare plasticitate si capitate de a se adapta intre anumite limite la cele mai diferite conditii de mediu si pentru acest motiv au o raspandire ubicvitara .

Prin activitatea lor metabolica contribuie la circuitul materiei in natura Ele degajeaza anumite tipuri de materie organica in materie anorganica.

Poseda un echipament enzimatic complex cu ajutorul caruia degradeaza materia organica sau anorganica si utilizeaza energia rezultata pentru solidificarea nevoilor vitale (sa se inmulteasca ,sa se deplaseze in mediile lor de viata) .

Intervin, uneori in mod favorabil, alteori in mod nefavorabil in activitatea omului si a altor organisme vii.

Efectele favorabile. Unele bacterii care sunt denumite comensale traiesc la nivelul cavitatilor naturale ale omului si animalelor unde exercita rol de bariera prin aceia ca impiedica colonizarea acestor cavitati cu bacterii patogene (care produc imbolnaviri).

Alte bacterii numite simbiote traiesc in rumenul rumegatoarelor si actioneaza asupra celulozei prezente in fibrele cu care se hranesc aceste animale si o fac accesibila enzimelor digestive ale acestor animale. In plus sintetizeaza vitamine din grupul B necesare metabolismului rumegatoarelor.

Alte bacterii se fixeaza pe radacinile leguminoaselor, fixeaza azotul atmosferic si imbunatatesc compozitia solului in azot.

Alte specii bacteriene in urma unor procese de selectie sunt utilizate in diferite industrii pentru obtinerea unor materii prime, furaje sau alimente.

Sunt folosite in industria farmaceutica pentru obtinerea antibioticelor naturale.

In industria chimica - pentru obtinerea diverselor tipuri de alcooli.

In industria pielariei - pentru argasirea pieilor

In industria textila - pentru obtinerea fibrelor de in si canepa.

In agricultura - pentru fermentarea balegarului, pentru combaterea daunatorilor.

In industria geologica - pentru obtinerea gazelor naturale, unor zacaminte.

Efectele nefavorabile. Toate bacteriile determina scaderea calitatii unor materii prime (furaje si alimente) prin consumul unor nutrienti.

Alte microorganisme pe langa faptul ca scad calitatea nutritiva, elaboreaza metaboliti toxicii, iar in urma consumului acelor produse se produc intoxicatii grave, chiar mortale.

Unele bacterii sunt patogene pentru diferite grupe de vietuitoare la care determina infectii desemnate cu termenul de bacterioze.

In compozitia lor chimica contin substante antigenice (care ajunse in organism declanseaza producerea de efectori imunologici: anticorpi sau celule specifice sensibilizate). Pe baza acestei proprietati se obtin vaccinurile sau serurile hiperimune folosite in prevenirea infectiilor la animale si la om (prin vaccinuri) sau in tratamentul infectiilor (prin serurile hiperimune).

Bacteriile sunt sensibile la actiunea antibioticelor si chimioterapicelor, dar inainte de administrarea lor este obligatorie antibiograma.

In natura bacteriile pot exista sub una din urmatoarele doua forme biologice:

unele intotdeauna numai sub forma de celula vegetativa si acestea alcatuiesc grupa bacteriilor nesporogene.

Altele, alternativ, cand sub forma de celula vegetativa cand sub forma de spor si acestea alcatuiesc grupa bacteriilor sporogene.

Morfologia si structura celulei vegetative

Celulele vegetative ale bacteriilor sunt formele metabolic active la nivelul carora se desfasoara totalitatea reactiilor metabolice.

Spre deosebire de alte organisme vii, bacteriile prezinta particularitati morfo - structurale     unice in sensul ca o singura celula este capabila sa desfasoare activitati de sinteza incat in 10 - 20 minute sa apara o noua generatie.

Morfologia externa a celulei vegetative se studiaza numai cu ajutorul instrumentelor de marire optica sau electronica folosind tehnici adecvate. In cadrul morfologiei externe se apreciaza:

forma

dimensiunile

modul de grupare

afinitatea tinctoriala

unele constante fizice

Forma bacteriilor este data si se mentine constanta de prezenta peretelui celular. Din aceasta cauza, bacteriile fara perete celular nu au forma constanta. Din punct de vedere al formei bacteriile apartin a doua mari grupe:

Bacterii de forma rotunda care mai sunt desemnate cu termenul coc (sg.) - coci (pl.).

Bacterii de forma alungita in cadrul carora exista mai multe grupe principale.

Atat in cadrul bacteriilor de forma rotunda, cat si a celor de forma alungita, exista forme principale (de baza) si forme derivate din formele principale.

Bacteriile de forma rotunda. O bacterie are forma rotunda atunci cand intre diametrele sale nu exista diferente semnificativestatistic. Forma princilpala este considerata aceea cand celula, in spatiu, este o sfera. De la aceasta forma principala exista mai multe forme derivate intre care:

Forma reniforma (de bob de cafea) - se intalneste la gonococ (produce blenoragia la om)

Forma de flacara, varf de lance sau picatura de apa in cadere - se intalneste la streptococus pneumoniae.

Forma alungita. Consideram ca o celula are forma alungita atunci cand intre cele doua diametre exista diferente semnificative din punct de vedere statistic. La bacteriile din aceasta categorie intalnim mai multe tipuri de forme principale in functie de aspectul celulei in spatiu.

Bacilul (bastonas) - diametrul longitudinal al celulei este semnificativ mai mare decat cel transversal si se gaseste pe toata intinderea lui in aceeasi directie a planului (este o linie dreapta). In spatiu aceste celule au aspect de cilindru sau uneori de cilindru turtit. La un bacil trebuie sa apreciem aspectul extremitatilor si din acest punct de vedere exista trei posibilitati:

v     Bacili cu capetele rontujite

v     Bacili cu capetele retezate drept

v     Bacili cu capetele ascutite sau furiforme

Forma de vibrion (virgula, paranteza mica). In acest caz diametrul longitudinal este semnificativ mai mare decat cel transversal, dar nu se gaseste pe toata intinderea lui in aceeasi directie a planului.

Spiril - diametrul longitudinal este mai mult mai mare decat cel transversal, iar in spatiu este incurbat formand daua sau mai multe bucle cu pasul inegal.

Spirochet - seamana cu spirilul numai ca buclele care se formeaza pe lungimea diametrului longitudinal cu pasul egal, iar in spatiul celula are aspectul de spirala. Fac parte leptospirale si treponemele (produc sifilisul la om).

Filamentul - este asemanatoare cu bacilul numai ca diferentele dintre lungime si latime sunt foarte mari (de cateva zeci sau sute de ori).

Forme derivate din forma alungita:

Forma de piscot

Forma de maciuca

Forma de cocobacil

Dimensiunile. Bacteriile au dimensiuni reduse, sub limita vizibilitatii cu ochiul liber. Dimensiunile lor se exprima in microni: la cele de forma rotunda printr-o singura valoare, aceea a diametrului, iar cele de forma alungita prin doua valori, una care exprima lungimea si alta care exprima latimea.

In functie de dimensiunile lor bacteriile se pot imparti in trei mari grupe:

Bacterii de dimensiuni mici (ex. Micoplasmele, rickettsiile, Brucella, Pasteurella)

Bacterii de dimensiuni mijlocii - in aceasta grupa se incadreaza majoritatea bacteriilor cunoscute

Bacterii de dimensiuni mari (Bacillus, Clostridium)

Datorita dimensiunilor reduse, bacteriile pot traversa anumite membrane sau materiale filtrante. Desi au dimensiuni mici, lasate in repaus, atunci cand se gasesc in medii lichide ele sedimenteaza formand la partea inferioara a recipientului depozit sau sediment.

Modul de grupare reprezinta felul in care se dispun celulele unei populatii in mediul lor de viata sau pe suprafata frotiurilor. Este consecinta planurilor sau planului dupa care se face diviziunea celulelor si a raporturilor care se stabilesc intre celule dupa diviziune. Majoritatea bacteriilor nu au un mod de grupare caracteristic, si in aceasta situatie spunem ca ele se dispun intamplator. Exista insa si bacterii la care modul de grupare este caracteristic:

Gruparea diplo (cate doi): diplococ (forma rotunda) si diplobacil (forma alungita)

Gruparea strepto (in sirag, in lant): streptococ si streptobacil

Gruparea stafilo (cu aspect de ciorchine de struguri) - este caracteristica pentru coci

Grupare in palisada (

Grupare in litere chinezesti (    ) - corine bacterium

Grupare in forme ramificate - nocardia asteroides

Grupare tetrada (88) - cate 4

Grupare sarcina - daca se suprapun doi tetrade.

Seminarul 2

Recoltarea, ambalarea si expedierea probelor in vederea examenului microbiologic

Proba este reprezentata de orice material sau produs destinat examenului microbiologic.

Recoltarea, ambalarea si expedierea probelor se efectueaza in conformitate cu legislatia sanitar - veterinara respectand cateva norme:

recoltarea probelor se executa in stricta asepsie (steril)

probele se vor introduce in recipienti sterili si vor fi individualizate prin notarea numarului probei pe recipient conform tabelului care insoteste probele respective

din momentul recoltarii si pana in momentul pelucrarii probelor trebuie sa treaca un timp, cat mai scurt cu putinta, iar daca acesta depaseste doua ore vara, probele vor fi transportate in lazi izoterme sau termose cu gheata

probele vor fi expediate impreuna cu un document oficial, numit nota de insotire care va cuprinde date privind provenienta probelor. In cazul probelor provenite de la animalele bolnave sau cadavre se vor mentiona toate evenimentele care ar putea avea legatura cu declansarea bolii si se solicita examen microbiologic.

Probele pot fi reprezentate de alimente, furaje, apa, animale vii, bolnave (de talie mica) sau cadavre provenite de la animale mici, organe recoltate in timpul necropsiei, cat mai repede dupa moartea animalului; obligatoriu un os lung nedeschis (fermur de la amnimalele mici si metacarp sau metatars de la animalele mari), produse de secretie sau excretie (urina, fecale, lapte etc) lichide obtinute prin punctie (lichidul cefalorahidian, sange, lichid pericardic, pleural, etc) frotiuri executate din sange sau din organe uscate dar nefixate si ambalate in hartie.

Examenul bacteriologic

1. Examenul bacterioscopic - se face cu microscopul optic. Se efectueaza pe preparate proaspete si frotiuri (preparate uscate, fixate si colorate).

Examenul preparatelor proaspete:

a)      Examenul intre lama si lamela

b)      Examenul in picatura suspendata

a) Se examineaza extemporaneu (in momentul examinarii). Se utilizeaza pentru examinarea lichidelor biologice a culturilor bacteriene in mediul lichid.

Tehnica de lucru:

- Pe o lamela de microscop, curata, uscata, degradata si sterilizata prin flambare, se depune o picatura din lichidul de examinat, se aplica o lamela si se examineaza la microscopul optic cu obiective uscate, iar condensatorul trebuie sa fie coborat.

Tehnica executarii frotiurilor. Etape:

Etalarea

Uscarea

Fixarea

Colorarea

Etalarea este operatia de depunere si intindere a materialului de examinat pe suprafata unei lame de microscop.

v     In cazul lichidelor biologice sau a culturilor bacteriene in mediul lichid etalarea se poate realiza cu ansa de insamantare sau cu pipeta Pasteur. Mai intai se agita lichidul respectiv, apoi cu ansa sterila se preia in mod steril (flambam gura eprubetei inainte si dupa recoltare) o picatura din lichidul de examinat, se depune pe lama si prin miscari circulare se intinde pe suprafata cat mai mare fara sa atingem marginile.

v     In cazul culturilor de pe suprafata mediului steril etalarea se executa cu ansa. Cu ansa sterila se preia in mod steril o mica cantitate de cultura care se suspensioneaza intr-o picatura de apa depusa pe lama.

v     In cazul frotiurilor din organe etalarea se executa prin amprenta, stergere sau strivire intre doua lame.

Uscarea asigura aderarea materialului la suprafata lamei. Se executa la temperatura laboratorului sau mentinand lama deasupra flacarii la 25 - 30 cm.

Fixarea asigura o mai buna aderare a materialului si distruge viabilitatea germenilor. Se poate executa prin: flambare, alcool flambare sau prin alcool.

Colorarea este un proces fizico - chimic de schimb ionic intre solutia coloranta si structurile intime ale celulei bacteriene.

Clasificarea metodelor de colorare:

1) Dupa frecventa si scopul utilizarii:

Metode uzuale - cum ar fi coloratia Gram

Metode speciale - metode Ziehl Neelsin, verde de malachit (pentru evidentierea sporului bacterian) si metoda Giemsa (pentru evidentierea capsulei bacteriene).

2) Dupa numarul solutiilor colosante:

Metoda simpla (folosesc un singur colorant) - coloratia cu albatru de metilen

Metode complexe (folosesc doua sau mai multe solutii colorante): Gram si Ziehl Neelsen

Organizarea structurala a corpilor bacterieni

Structural bacteriile sunt alcatuite dintr-un invelis, un continut si in unele situatii din formatiuni accesorii numite organite.

1. Invelisul bacterian. Are componentele:

Membrana citoplasmatica

Peretele celular

Capsula

Membrana citoplasmatica - este componenta obligatorie a tuturor bacteriilor.

Are structura trilamelara. Cele trei straturi sunt formate din fosfolipide amfipatice orientate catre interiorul celulei. Exista doua straturi de fosfolipide care asigura rolul de bariera in calea patrunderii substantelor din mediul exterior.

Membrana citoplasmatica este un filtru care permite accesul substantelor nutritive in bacterie si eliminarea din bacterie unor metaboliti toxici.

Mezozomii sunt amplificari ale membranei citoplasmatice rezultate din plierea ei in interiorul celulei. In functie de configuratia lor mezozomii pot fi veziculari (ca niste saci), lamelari sau tubulari. Mezozomii au rolul de a transmite semnale chimice de la materialul nuclear catre invelisul bacteriei; ei reprezinta regiuni specializate prin care patrund in celula bacteriana fragmente ADN.

Peretele celular - este situat la exteriorul membrana citoplasmatice. Este mai gros decat aceasta, rigid, dar si foarte poros. Spre deosebire de celula vegetala peretele celulei bacteriene nu contine celuloza.

Structura peretelui determina la o bacterie gradul de rezistenta si afinitatea pentru anumiti coloranti (afinitate tinctoriala).

In functie de colorantii care se pot impregna in peretele celular, bacteriile se pot imparti in mai multe categorii. Tehnica de colorare Gram - permite clasificarea bacteriilor in gram-pozitive (violet) si gram-negative (rosu).

In functie de rezistenta la acizi, rezistenta testata prin coloratia Ziehl Neelsen, bacteriile se impart in:

Acidorezistente

Neacidorezistente

Peretele celular la bacteriile Gram-pozitive este constituit dintr-un ansamblu de molecule denumit Peprodo Glicam. Aceasta are doua componente:

Una peptidica formata de regula, din aminoacizii alanina, lizina si acid glutamic. Compozitia si proportia acestor aminoacizi variaza de la o specie bacteriana la alta.

Portiunea gliconica este constituita din acetil-glucozamina.

In structura acestui perete mai intra acizi Teichoici aflati intr-o stransa legatura cu acidul glucuronic.

Acizii teichoici intervin in mentinerea concentratiei unor ioni (de magmeziu) si au un rol de protectie antifagocitara pentru bacteriile tinere.

Peretele bacteriilor Gram negative. Este mult mai subtire, are un grad de rigiditate mai redus, dar o structura mai complexa. El este alcatuit dintr-o membrana externa si un complex lipopoliglucidic.

Membrana externa este alcatuita in proportie de 50 % din poliglucide intercalate cu fosfolipide (35 %) si proteine (15 %). Este complexul lipopoliglucidic.

Este alcatuit din trei portiuni:

Lipida A

Portiunea centrala R

Poliglucidul O

Lipida A este constituita din acizi grasi care au o structura foarte diferita de la o specie bacteriana la alta.

Portiunea centrala R este divizata intr-o zona interna in care predomina etanol-amina si o portiune externa formata din glucoza si galactoza (doua glucide de baza).

Poliglucidul O are compozitia foarte variabila. El reprezinta structura chimica prin care bacteriile isi tradeaza prezenta in organismului uman sau animal.

Spatiul periplasmatic este prezent numai la bacteriile Gram negativ. Este situat intre membrana citoplasmatica si peretele celular si contine numeroase enzime cu rol in pregptirea mecanismelor de transport celular (fosfataza, acetilamilaza).

Capsula bacteriana - structura a invelisului prezenta numai la unele specii bacteriene, iar la acestea numai in anumite conditii de mediu. In functie de capacitatea bacteriilor de a-si sintetiza capsula. Ele se impart in doua grupe:

Bacterii capsulogene

Bacterii acapsulogene

Cele capsulogene in functie de prezenta capsulei in momentul examinarii lor pot fi:

Acapsulate

Capsulate

Capsula bacteriana nu poate fi observata la microscopul electronic. Ea poate fi observata numai la microscopul optic folosind metode speciale de colorare. In functie de insusirile fizico-chimiceale capsulei pana in prezent au fost descrise urmatoarele tipuri de capsula:

Capsula adevarata (propriu-zisa): se prezinta ca o structura omogen repartizata in jurul celulei cu o consistenta gelatinoasa, dar fermaila prin metodele speciale de evidentiere a capsulei. Se intalneste la Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae.

Capsula mucoasa: se prezinta ca o structura neuniform repartizata in jurul celulei cu o consistenta gelatinoasa, dar mai putin ferma uneori se detaseaza de corpul celulei sub forma unor insule. Se evidentiaza prin metodele de colorare a capsulei. Se intalneste la Klebsiella pneumoniae.

Microcapsula: se prezinta ca o structura fina, subtire, nu poate fi evidentiata prin metodele de colorare a capsulei, ci numai prin tehnici imunologice (tehnica de gonflare a capsulei). Se intalneste la Pasteurella multocida.

Zoogleea: se prezinta ca o masa mucilaginoasa forma in care sunt inglobate mai multe celule vegetale. Se intalneste la bacteriile care traiesc in medii natrurale (scoarta copacilor, ape statatoare).

Compozitia chimica a capsulei difera in functie de specia bacteriana. Indiferent de specia bacteriana. Indiferent de specie contine: 70 - 90 % apa, restul fiind reprezentat de polipeptide (bacillus antracis) sau poliglucide (Streptococus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae). In anumite conditii bacteriile capsulogene nu-si pot sintetiza invelisul capsular temporar mai ales atunci cand ele sunt cultivate pe medii de cultura inerte, alteori bacteriile capsulogene isi pot pierde definitiv capacitatea de a-si sintetiza capsula si in acest caz apar mutante acapsilogene.

Exemplu: de la Bacillus antracis - tulpina 1190R nu-si poate sintetiza capsula.

Rolul capsulei:

Rolul de protectie fata de actiunea uscaciunii, a unor bacteriofagi

Reprezinta un factor de adeziunem fixare a celulelor bacteriene pe anumite substraturi in mediile naturale in care traiesc bacteriile

Pentru bacteriile patogene reprezinta un atribut al patogenitatii deoarece atunci cand ajunge in organism si prezinta invelis capsular, aceste bacterii nu mai pot fi distruse de fagocite sau alti factori umorali de aparare ale organismului

Reprezinta un criteriu important folosit pentru identificarea speciilor bacteriene capsulogene

Glicocalixul este o alta componenta a invelisului bacterian, prezinta numai la unele bacterii, iar la acestea numai atunci cand se gasesc in mediile lor naturale de viata. Nu se sintetizeaza cand bacteria se cultiva pe medii de cultura in laborator.

Glicocalixul se poate evidentia prin examen la microscopul electronic unde apare ca o impletitura de firisoare fine situat exterior peretelui celular, dand celulei aspectul de catifea. Nu se cunoaste cu exactitate rolul pe care il indeplineste, s-a stabilit insa, natura sa chimica, fiind constituit din poliglucide. Se pare ca intervine in fixarea bacteriilor de un substrat mai ales atunci cand acestea traiesc in ape repede curgatoare. De asemenea, la nivelul glicocalixului se gasesc anumite enzimi care predigera substantele nutritive cu care bacteriile se hranesc.

2. Organitele celulei vegetative

Sunt reprezentate de cili (flageli), pili si fimbrii.

Sunt structuri extraparietate prezente numai la unele specii bacteriene.

Cilii (flagelii) sunt structuri filamentoase foarte subtiri si foarte lungi (de cateva zeci de ori mai lungi decat lungimea celulei). Sunt flexibile, cu aspect tubular. In functie de capacitatea de a sintetiza cili bacteriile se impart in bacterii acilogene (atricha) si cilogene care in functie de moment pot sa fie ciliate sau neciliate.

Bacteriile cilogene in functie de numarul si dispozitia cililor pe suprafata celulei se impart in:

Bacterii monotricha - poseda un singur cil, de regula situat la una din extremitatile celulei, rareori pe partea laterala.

Bacterii lophotricha - prezinta un manunchi de cili la una din extremitati

Bacterii amfitricha - poseda cate un cil sau un manunchi de cili la fiecare extremitate

Bacterii peritricha - poseda mai multi cili uniform repartizati pe toata suprafata celulei.

Structura cilului. Se poate studia numai cu ajutorul microscopului electronic. Un cil este constituit din urmatoarele componente:

Blefaroplast (granula blazala)

Articulatie (carlig)

Filament axial (parte libera a ciclului)

Blefaroplastul - se gaseste situat in grosimea peretelui celular si a membranei citoplasmatice, venind in contact direct cu citoplasma.

La bacteriile Gram pozitiv blefaroplestul este constituit din doua discuri in timp ce la bacteriile Gram negativ este constituit din patru discuri notate cu simbolurile: M, P, S, L.

Discul M - este numit discul motor, deoarece este singurul responsabil de miscarea cilului. Pe el se gaseste sudat filamentul axial care se va misca concomitent cu discul motor.

Celelalte trei discuri sunt perforate si strabatute de filamentul axial. Ele au rolul de a ghida filamentul exial si a impiedica miscarea lui in lateral.

Articulatia - este o structura fixata, sudata pe suprafata peretelui celular cu aspect de tub indoit in unghi drept prin care trece filamentul axial. Are rolul de a multiplica viteza de rotatie a filamentului axal.

Filamentul axial - este mai subtire decat restul componentelor, are aspectul de tub gol, cresterea lui in lungime se face prin depunere de substanta de neoformatie la extremitatea sa libera.

Compozitia chimica a cililor

In ansamblul sau cilul are o compozitie chimica proteica, aceasta este insa caracteristica fiecarei specii. Proteinele difera in functie de componenta structurala a cilului. Proteinele din filamentul axial poarta numele de flagelina si se aranjeaza in structura lui dupa o simetrie helicoidala.

Rolul cililor

Rol in deplasarea celulelor bacteriene in mediul lor de viata. Pe suprafata filamentului axial exista anumite proteine senzor care percep informatiile din mediul de viata. Si pe acest principiu, bacteria se apropie (cand factorii de mediu sunt favorabili numiti factori atractanti) sau se indeparteaza (daca conditiile de mediu sunt nefavorabile si atunci factorii se numesc repelanti).

Viteza de deplasare a bacteriei este de cateva zeci de ori mai mare decat viteza unui cal de curse.

Cand filamentul axial se roteste in sens antiorar, bacteria se deplaseaza in linie dreapta si cu viteza mai mica. Cand filamentul axial se roteste in sens orar, celula se deplaseaza prin rostogolire cu o viteza mai mare.

Sinteza cililor la bacteriile cilogene depinde de factorii de mediu care se comporta ca si represori ai genelor raspunzatoare de sinteza proteinelor sau ca factori inhibitori. S-a constatat ca temperatura se poate comporta ca un represor pentru sinteza cililor.

Exemplu: Bacteria Listeria monocytogene si Bacteria Yersinia pseudotuberculosis sunt bacterii cilogene.

Daca culturile se obtin la temperaturi mai scazute de 30^oC, ele sunt ciliate.

Daca sunt incubate la 37^oC nu pot sa-si sintetizeze cili, deci sunt aciliate.

Coloratia Gram

Frotiul uscat si fixat se acopera cu solutia de violet de gentiana si se lasa un minut, dupa care se spala cu apa de robinet, se acopera cu solutia Lügol un minut, apoi se indeparteaza aceasta si fara spalare frotiul se decoloreaza cu alcool - acetona cateva secunde, apoi se spala si se coloreaza cu fuxina diluata 1 % timp de un minut, dupa care frotiul se spala, se usuca si se examineaza la microscopul optic cu obiectivul de imersie.

Rezultatul colorarii: bacteriile Gram pozitive se coloreaza in violet, iar cele Gram negativ se coloreaza in rosu.

Curs 5

Pili - sunt structuri filamentoase, subtiri, mai scurte decat cilii, prezenta pe suprafata peretelui celular in numar redus de la 1 la 7 a unor indivizi dintr-o populatie celulara a unei specii bacteriene date.

Se pot observa numai cu ajutorul microscopului electronic. In interior unii prezinta lumen, altii sunt plini.

Din punct de vedere al aspectului morfologic si al funtiei pe care o indeplinesc au fost descrise doua tipuri de pili:

Pilii F (pili de sex sau fertilitate)

Pilii I (infertilitate)

Pilii F se intalnesc la bacteriile care poseda in citoplasma de tip F sau de tip R. Ei prezinta lumen interior. Intervin in procesele de sexualizare primitiva (conjugare) in sensul ca prin intermediul portiunii libere a pilului F celula F⁺ si F^-, iar prin intermediul lumenului plasmida dupa o prealabila replicare este transferata in citoplasma celulei acceptoare.

De asemenea s-a demonstrat ca pe lungimea pililor F se fixeaza anumiti bacteriofagi (virusuri patogene pentru bacterii) fara coada si isi introduc acidul lor nucleic in interiorul citoplasmei celulei care poseda pili F.

Pilii I se intalnesc la celulele bacteriene care poseda in citoplasma lor plasmide "col". Acesti pili nu prezinta lumen si au extremitatea libera butonata. Prin intermediul pilului I bacteria colicinogena (care poseda pili I) se ataseaza de o alta celula a aceluiasi populatii pe care o fixeaza si elaboreaza colicina, care va omori celula fixata.

Compozitia chimica a pililor

Indiferent de tipul lor pili sunt constituiti dintr-o proteina speciala denumita pilina, diferita la pilii F fata de cea de la pilii I.

Fimbrii

Sunt structuri extraparientale, foarte subtiri si scurte, drepte, cu lumen interior, foarte numeroase pe suprafata unei celule astfel incat ii confera acesteia aspectul de plus sau de perie. Se evidentiaza numai la microscopul electronic; se gasesc numai pe suprafata anumitor celule dintr-o populatie a unei specii bacteriene date.

Pana in prezent au fost descrise patru tipuri de fimbrii notate cu cifrele romane de la I la IV. Diferentierea lor se face pe baza compozitiei chimice.

Compozitia chimica. Fimbriile sunt constituite din punct de vedere chimic dintr-o proteina speciala numita fimbrilina.

Rolul fimbriilor incomplet elucidat, se presupune ca reprezinta un avantaj pentru celulele care le poseda si anume permit marirea suprafetei de contact a celulelor cu mediul lor de viata. Acest lucru este sustinut de observatia ca celulele fimbriate au un metabolism mai intens decat cele care nu contin fimbrii.

Pentru bacteriile patogene fimbriile constituie un atribut al patogenitatii deoarece prin intermediul lor, celulele se fixeaza pe suprafata epiteliilor (la nivelul tubului digestiv, la nivelul uretei si vaginului, al cavitatii nazale, pe conjunctiva).

Morfologia si structura sporului bacterian

Sporul bacterian este o alta forma biologica de existenta a bacteriilor in natura. El este o celula vie, metabolic inactiva ( nu se produc procese de sinteza) si reprezinta o forma de conservare sau de rezistenta a bacteriilor.

In functie de capacitatea bacteriilor de a forma spor, acestea se impart in:

Bacterii nesporogene (in nici o conditie nu sunt capabile sa genereze spori)

Bacterii sporogene (in anumite conditii de mediu celula vegetativa se transforma in spor)

Morfologia externa a sporilor

Sporul se formeaza in interiorul celulei vegetative. Dupa maturare la unele specii (genul bacillus) el se elibereaza prin liza celulei. La alte specii (genul clostridium) ramane permanent atasat de celula vegetativa in care s-a format.

La un spor trebuie sa apreciem:

Forma

Dimensiunile

Raporturile care se stabilesc intre spor si celula vegetativa in care s-a format

Afinitatea tinctoriala

Forma sporilor. Sporii pot avea forma rotunda, ovala sau cilindrica.

Dimensiunile. Se pot exprima in microni, dar in mod practic se exprima prin comparatie cu diametrul transversal al celulei in care s-au format. Exista spori cu dimensiuni mai mici decat diametrul transversal al celulei (dupa formare nu deformeaza celula) si spori cu dimensiuni mai mari decat diametrul transversal al celulei, pe care o deformeaza.

Raporturile cu celula

Afinitatea tinctoriala - sporii nu se coloreaza prin metoda Gram. Ei, in acest caz, apar ca vacuole necolorate in interiorul celulei. Se coloreaza prin metode speciale, energice, in care solutiile colorante utilizate trebuiesc incalzite.

Structura interna a sporilor bacterieni

Sporul bacterian este constituit din:

Un continut

Un invelis

Continutul este reprezentat de:

Sporoplasma

Material nuclear

Sporoplasma se gaseste in cantitate foarte redusa. Este echivalentul citoplasmei de la celula vegetativa. Nu contine ribozomi sau alte structuri intracitoplasmatice.

Materialul nuclear se mai numeste sambure sau inima sporului. Este reprezentat de o singura molecula de ADN dublu catenar. Este identic cu materialul nuclear al celulei vegetative din care s-a format sporul.

Invelisul este o structura complexa constituita din urmatoarele componente structurale:

Membrana sporala (intina) - este identica cu membrana citoplasmatica a celulei vegetative, dar nu formeaza niciodata mezozomi

Cortex - o structura groasa (omologul peretelui celular), este constituita din acid dipicolinic, impregnat cu saruri de Ca[1] (dipicolinat de Ca). Este impermeabila si responsabila de termorezistenta sporilor.

Tunicile (exina) - se gasesc exterior cortexului, au un aspect membranos si sunt implicate in hidratarea sporilor in cursul procesului de germinare.

Toate structurile enumerate la invelis sunt obligatorii pentru orice spor.

La unii spori, in afara acestora, din invelis fac parte:

Corpii parasporali: se intalnesc numai la sporii unor specii bacteriene patogene pentru insecte. Ei contin o substanta toxica pentru larvele acestora.

Apendicii parasporali: se intalnesc la una din extremitatile sporului si au aspectul unor panglici. Intervin in diseminarea sporilor prin curentii de aer.

Exosporium: se intalneste la sporii unor specii din genul Bacillus. El este dispus doar pe jumatatea tunicilor; la microscopul electronic are aspect lamelar si confera sporului aspectul de barca cu panze. Contine un antibiotic care se elibereaza in cursul procesului de germinare a sporului, in scopul protectiei celulei care a rezultat fata de actiunea nefavorabila a altor bacterii.

Sporogeneza si germinarea sporilor bacterieni

Formele de existenta ale virusurilor in natura

Virusurile sunt entitati microbiologice cu o structura subcelulara constituita dintr-un numar fix de molecule fara metabolism propriu si care por exista in natura in trei forme distincte fiecare dintre ele reprezentand o etapa a cilului biologic viral.

Virusul complet (virion) - are toate componentele structurale caracteristice unui virus. El este capabil sa reziste o perioada limitata in afara celulei gazda si are ca principala insusire infectiozitatea sau capacitatea de a patrunde intr-o celula si de a inocula propriul material genetic in nucleul celulei gazda.

Virusul vegetativ - este forma de existenta intracelulara; in acesta stare virusul este lipsit de structura proprie. Materialul viral este dispersat in celula gazda, inseparabil de continutul acesteia. Conform informatiei genetice induse de nucleul viral celula gazda sintetizeaza componentele structurale ale unui nou virus. Aceste componente sunt asamblate luand nastere noi virioni. In aceasta faza virusul este complet dependent de celula gazda.

Virusul integrat (provirus) - este tot o forma intracelulara totaldependenta de celula gazda cu deosebirea ca sub aceasta forma celula nu sintetizeaza material viral. Acidul nucleic viral se fixeaza in genomul celulei, se integreaza ca un material genetic propriu acestei celule si ramane intr-o forma de latenta un timp nedefinit.

Provirusul se poate transforma in virus vegetativ de obieci sub actiunea unor factori de stre, situatie in care genomul viral se activeaza, se desprinde din cromozomul celulei gazda si incepe sa codifice sinteza de material viral nou (trece in virus vegetativ).

Aceasta forma de existenta este caracteristica pentru virusurile tumorale.

Morfologia virusului

Descrierea unui virus se refera la forma de vision (virus complet) intrucat aceasta este singura in care virusul are o structura proprie.

Forma virusurilor - s-a constatat ca exista trei tipuri principale de forme:

Alungita

Corpusculara

Spermatozoidica

In cadrul acestor forme pot exista detalii de structura, astfel pot apare virusuri cu aspect de bastonas, filament pliat, de icozaedru, de corpuscul sferic, de caramida, de glont, de spermatozoid.

Dimensiunile - variaza intre 8 si 350 de nanometri (milimicromi)

Cele mai mici virusuri (parvovirusurile si piconavirusurile) se apropie de dimensiunile unor macromolecule organice.

Virusurile cele mai mari (poxvirusurile) se apropie de dimensiunile celor mai mici bacterii.

Structura interna a virusului - virusul este alcatuit din doua constituenti principali si un accesoriu. Cei principali sunt genomul viral si capsida, iar cel accesoriu este invelisul extern.

Genomul viral este alcatuit dintr-o molecula de ADN sau de ARN, a carei masa moleculara difera de la un virus la altul. Aceasta molecula poate avea diferite structuri astfel poate fi liniara, circulara, cu o catena sau cu doua catene, sau poate avea o structura helicoidala infasurata sau pliata in scopul asigurarii unei compactari maxime a materialului genetic.

Liniar (mono saudi catenar) circular helicoidal

Masa genomului viral reprezinta intre 5 si 30 % din masa totala a virusului. Genomul este purtatorul informatiei genetice care determina in celula gazda multiplicarea virusului si modificarea metabolismului celular in scopul sintezei de noi virioni.

Molecula de acid nucleic (ARN sau ADN) este purtatorul informatiei genetice si elementul principal al capacitatii de infectie a unui virus.

Capsida virala este alcatuita din unul sau mai multe tipuri de proteine si are rolul unui invelis protector pentru genom. Capsida are o structura rigida si este prezenta la toate virusurile. In alcatuirea ei intra numeroase unitati structurale numite capsomere. Aceste capsomere sunt dispuse dupa un tip precis de ametrie care variaza de la un virus la altul. Astfel pot exista tipuri de simetrie helicoidala, icozaedrala sau simetria binara rezultata din cuplarea celor doua.

Capsida virala este alcatuita dintr-o singura unitate proteica (monomere) sau din mai multe unitati proteice (oligomere).

Capsida cu simetrie helicoidala. Aceasta are forma tubulara, fiind alcatuita dintr-o spirala in helix (arc de pix). Genomul este paralel cu capsida, situat in santul dintre doua randuri de capsomere. Acest tip de capsida poate fi rigida sau flexibila.

Capsida cu simetrie icozaedrala (cubica). Icozaedrul este o forma geometrica alcatuita din 20 de fete triunghiulare, 30 laturi si 12 colturi. Aceasta structura geometrica are o rezistenta foarte mare la tensiuni si presiuni externe.

Genomul plasat in acest tip de capsida nu pastreaza o simetrie cu structura ei.

Capsida cu simetrie binara (dubla) - este caracteristica unor virusuri aparte denumite bacteriofage. Ea are doua componente: un cap icozaedral si o coada helicoidala.

Ansamblul genom - capsida poarta numele de nuclo-capsida.

Invelisul extern (pericapsida sau peplos). Este un invelis suplimentar, elastic, prezent numai la unele virusuri. In functie de prezenta sau absenta pericapsidei corelata cu simetria capsidei, virusurile pot fi grupate in patru categorii:

Virusuri helicoidale nude (fara peplos)

Virusuri helicoidale invelite (cu peplos)

Virusuri icozaedrale nude

Virusuri icozaedrale invelite

Virusurile invelite de peplos au intotdeauna o forma aproape sferica indiferent de simetria capsidei.

Pericapsida este constituita din unitati structurale numite peplomare. Acestea au o structura mai putin conturata decat cea a capsomerelor si nu sunt aranjate dupa un tip precis de simetrie. Ele au o structura proteica la care se poate asocia si o serie de glucide sau lipide care contribuie la stabilirea structurii antigenice a unui virus.

Originea componentelor pericapsidei poate fi una proprie virusului sau poate fi derivata din membrana celulei gazda in care a fost sintetizat vurusul. Partea proprie poarta numele de homeopeplor, iar partea provenita din celula gazda poarta numele de heteropeplos.

Pericapsida contribuie la aparitia unor insusiri deosebite la virusurile ce au aceasta structura, astfel aceste virusuri sunt sensibile la eter si cloroform, au o capacitete de absorbtie la diferite substraturi celulare si pot ataca hematiile gazdei datorita prezentei unor spiculi (antene) existente la suprafata virusului si care au rol hemaglutinant.

Sporogeneza si germinarea

Sporogeneza este procesul de transformare a celulei bacteriene vegetative in spor bacterian.

Etape:

Pregatirea celulei vegetative - are loc contopirea materialului genetic nuclear intr-o singura masa urmata de segmentarea si reorganizarea acestuia in doi cromozomi diferiti.

Formarea presporului - prin constituirea unui sept transversal realizat prin invaginarea membranei citoplasmatice care separa cei doi cromozomi. Cele doua segmente celulare evolueaza pe doua cai diferite unul devenind prespor, iar cel de al doilea segment devine sporangiu. In prespor incepe organizarea invelisurilor sporale. Sporangiul reprezinta restul celulei vegetative si ramane atasat de spor un timp nedefinit.

Maturarea sporului in care are loc organizarea finala a constituentilor sporali avand loc urmatoarele transformari in prespor:

Se termina morfogeneza invelisurilor sporale

Apar unii compusi chimici specifici sporului

A reduce drastic activitatea metabolica

Dobandirea rezistentei crescute la factorii de mediu extern

Germinarea este transformarea sporului in celula bacteriana vegetativa. Se realizeaza in doua faze distincte:

Initierea germinarii cand sporul se mareste in volum, consecutiv absorbtiei de apa. Pentru aceasta invelisului sporale se lezeaza (se distrug).

Cresterea postgerminativa in care celula vegetativa redobandeste toate perticularitatile unei bacterii.

Sporogeneza si germinarea sunt procese cu mecanisme determinate genetic si sunt influentate de o arie de factori externi cum ar fi temperatura, umiditatea, gradul de aerare, pH-ul, existenta unor antibiotice in mediu.

Seminar 4

Mediile de cultura

Mediul de cultura este un suport nutritiv steril care permite dezvoltarea si studiul unui microorganism in afara nisei ecologice a acestuia.

Ingrediente utilizate la prepararea mediilor de cultura

Ingrediente rezultate in urma digestiei enzimatice a unor produse animale (carne, creier, cord) sau vegetale (orez, soia) sub actiunea unor enzime cum ar fi tripsina, pepsina, papaina. Ex: peptona, triptona - acestea se adauga in proportie de 5 - 20 grame la litru.

Ingrediente rezultate in urma hidrolizei acide a unor produse anumale vegetale sau chiar microbiene. Ex: extract de carne, extract de drojdii, hidrolizat de cazeina.

Sarurile minerale - orice mediu de cultura contine NaCl 5 pana la 7 grame la litru.

Apa este solventul celorlalte ingrediente. Se poate utiliza apa distilata, bidistilata sau deionizata.

Agarul - pentru prepararea mediilor solide sau semisolide se utilizeaza agarul care este obtinut din corpul unor alge ce traiesc in marile Japoniei. Agarul este rezistent la actiunea enzimelor bacteriene si are punctul de solidificare cuprins intre 40 si 50^oC.

Alte ingrediente: glucide, aminoacizi, vitamine, enzime, indicatori de pH, galbenus de ou, legume, ser, sange, atc.

Etapele prepararii unui mediu de cultura:

Dizolvarea la cald intr-o anumita succesiune a ingredientelor in apa.

Ajustarea pH-ului la valoarea 7,2 - 7,6.

Incalzirea mediului la temperatura de dierbere pentru precipitarea substantelor precipitabile.

Filtrare.

Pentru prepararea mediilor solide se adauga 14 - 20 grame la litru agar si mediul se incalzeste pana la completa topire a agarului.

Repartizarea in eprubete, flacoane.

Sterilizarea prin autoclavare.

Controlul sterilitatii mediilor se face prin incubarea la 37⁰C, 24 ore.

Clasificarea mediilor de cultura:

1) Dupa scopul si frecventa utilizarii:

A.    Medii uzuale

B.     Medii speciale:

a.      Medii de crestere: - acestea contin anumite substante numite factori de crestere care stimuleaza dezvoltarea unor bacterii care nu cresc pe mediile uzuale. Ex: bulionul cu ser.

b.     Medii de imbogatire: - permit dezvoltarea unor bacterii care se afla intr-un numar redus in materialul de insamantat. Ex: medii utilizate pentru izolarea salmonelelor - mediul cu selenit acid de natriu, Kauffman Müller.

c.      Medii selective: - prin compozitia lor chimica inhiba dezvoltarea unor specii bacteriene favorizand dezvoltarea speciilor pe care dorim sa le izolam.

Ex: mediul Chapman - pentru izolarea stafilococilor.

Mediul Töwenstein - pentru izolarea bacililor tuberculozei

d.     Medii de diagnostic diferential: - acestea permit diferentierea, deosebirea a unor specii bacteriene inrudite pe baza aspectului cultural diferit pe aceste medii de cultura. Se utilizeaza pentru izolarea enterobacteriaceelor.

Ex: mediul lactozat cu albastru de Br timol, mediul Drigalski, mediul Mac Conkey, mediul SS, mediul Levin, Endo.

e.      Medii politrope: - permit studierea mai multor proprietati biochimice prin insamantarea pe un singur mediu de cultura.

Ex: mediu MIU (mobilitate indol urec), mediu TSI

f.      Medii de conservare: - se utilizeaza pentru pastrarea tulpinilor bacteriene in colectii. Ex: agarul moale.

g.     Medii de transport: - mentin nemodificat raportul numeric intre diferitele specii bacteriene in timpul transportului.

2) Dupa compozitia chimica

A.    Medii maturale (laptele turnesolat, cartoful glicerinat).

B.     Medii sintetice (agar, bulion).

C.     Semisintetice (bulion cu ser, agar cu sange).

3) Dupa consistenta mediile se impart in:

A.    Medii lichide (bulion)

B.     Medii solide (agarul)

C.     Medii semisolide (agarul moale)

D.    Medii bifazice (cartoful glicesinat)

4) Dupa tipul respirator al bacteriilor

A.    Medii pentru bacterii anaerobe (nu suporta oxigenul) (bulionul si agarul VL,VF, geloza Veillon)

B.     Medii pentru bacterii aerole sau facultativ anaerobe (bulionul si agarul)

Curs 7

Caracterele generale ale virusurilor

Virusurile sunt entitati etiologice cu structura acelulara.

Genomul virusurilor este alcatuit dintr-un singur acid nucleic ARN sau ADN. Din acest punct de vedere virusurile se impart in doua mari categorii: ribovirusuri - virusuri cu genom ARN si dezoxiribovirusurile - virusuri cu genom ADN.

Virusurile sunt microorganisme parazite obligatoriu, absolute, deoarece sunt metabolic inert.

In functie de aspectul de patogenitate al virusurilor, acestea se clasifica in mai multe categori:

Virusuri zoopatogene

Virusuri fitopatogene

Virusuri bacteriofogice - virusuri patogene pentru bacterii

Virusuri micofagice - virusuri patogene pentru ciupercile microscopice

In functie de tropismul virusurilor pentru diferite tesuturi se clasifica in:

Virusuri epiteliotrofe (febra aftoasa)

Virusuri neurotrofe (virusul rabil)

Virusuri hepatotrope (hepatite)

Virusuri limfotrope (virusul HIV)

Virusuri pantrope (afecteaza toate tesuturile)

Virusurile sunt antigenice, deci pot fi utilizate pentru prepararea unor vaccinuri.

Bolile produse de virusuri se numesc viroze.

Familia Poxviridae

Familia Rhabdoviridae, Bacteriofagii

Unele virusuri nu respecta modelul clasic prezentand o structura mai complexa.

Familia Poxviridae - virusuri variolice

Virusul are aspect de caramida cu colturile rotunjite.

Virusurile incadrate in aceasta familie poseda urmatoarele elemente structurale de la interior la exterior. Genomul viral (inima, samburele) care are aspectul unui disc biconcav si este constituit din ADN dublu-catenar. Prezinta doi corpi laterali de natura proteica situati in escavatiile genomului. Prezinta o membrana interna de natura proteica, un strat alcatuit din unitati proteice cilindrice, asemanatoare capsomerelor si o membrana externa formata dintr-o retea de structuri tubulare.

Familia Rhabdoviridae - virusul turbarii

Virusul are aspect de ghiulea si prezinta, urmatoarele elemente structurale de la interior la exterior:

Genomul viral constituit din ADN monocatenar dispus helioidal

O capsida helicoidala formata din doua straturi de capsometre

O membrana proteica neteda

Peplos (pericapsida) alcatuita din peplomere cu aspect de bec asezate cu extremitatile mai inguste pe membrana proteica

Virusurile bacteriofagice au o structura mixta. Prezinta urmatoarele elemente structurale:

v     Capul cu simetrie icozaedrala

v     Piesa intermediara - este un disc hexagonal

v     Coada - prezinta simetrie helicoidala.

La extremitatea cozii se afla aparatul de fixare alcatuita dintr-o placa terminala, fibrilele cozii si croset situate la unghiurile placii terminale cu aspect hexagonal.

Replicarea virusurilor are loc in celula gazda, virusurile fiind paraziti celulari absoluti. Ciclul de replicare cuprinde mai multe etape:

Absorbtia virusurilor

Patrunderea virusurilor

Decapsidarea

Sinteza proteinelor precoce

Replicarea genomului viral

Sinteza proteinelor tardive

Ansamblarea

Eliberarea virionilor progeni

1. Absorbtia virusurilor - absorbtia particulelor virale la membrana celulei gazda are loc in urma miscarilor browniene cand practic particulele virale se ciocnesc de membrana celulei gazda si se fixeaza reversibil de membrana datorita fortelor electrostatice, apoi urmeaza absorbtia specifica ireversibila prin intermediul receptorilor virali de pe celula gazda. Deci, permisivitatea unei celule pentru infectia cu un virus este conditionata de prezenta pe celula a receptorilor specifici pentru acel virus.

2. Patrunderea (internalizarea) virusurilor.

Bacteriofagii dupa absorbtie injecteaza direct in celula gazda acidul nucleic.

Majoritatea virusurilor patrund in celula gazda prin viropexie, adica se produce o invaginare a membranei celulei gazda la locul de absorbtie a virusurilor astfel incat particula virala este inglobata intr-o vacuola de endocitoza. Virusurile ARN in general, patrund prin viropexie, insa la virusurile cu o structura mai complexa se intalneste un alt mecanism de patrundere prin fuziunea invelisului viral datorita interactiunii glicoproteinelor de suprafata virale cu glicoproteinele membtanei celulare in urma carui proces virusul patrunde in celula.

3. Decapsidarea. Dupa patrunderea in celula virionii elibereaza acidul nucleic viral la nivelul sediului replsicarii virale.

In general pentru virusurile ARN este citoplasma, iar pentru ADN cu exceptia familiei poxviride si iridoviride este nucleul.

Decapsidarea este procesul de eliberare a genomului viral de structurile care il inconjoara - capsida virala la virusurile nude si capsida si peplosul la virusurile invelite (anvelopate).

Dupa decapsidare acidul nucleic eliberat fie este rezistent la endonucleazele celulei gazda, fie este insotit de enzime preformate care-l protejeaza de actiunea endonucleazelor. Dupa decapsidare acidul nucleic viral substituie genomul celulei gazda si preia comanda tuturor sintezelor care au loc in celula gazda in sensul producerii de noi virioni. Acidul nucleic viral are dublu rol:

Functioneaza direct ca mesager in cazul virusurilor ARN monocatenare de sens pozitiv, care au aceeasi polaritate cu ARN mesager al celulei gazda sau ca matrita pentru sinteza mesagerilor, pentru sinteza proteinelor virale.

Serveste ca matrita pentru sinteza acizilor nucleici progeni

4. Faza precoce. Unele virusuri dupa decapsidare pun in libertate enzimele pe care le contin sau le activeaza pe cele care se aflau ca proenzime. Insa la majoritatea virusurilor enzimele necesare procesului de replicare se sintetizeaza in interiorul celulei gazda si reprezinta proteinele precoce.

Faza precoce consta in transcrierea unor ARN mesageri de pe genele precoce ale genomului si traducerea acestor ARN medageri cu sinteza proteinelor precoce.

Genele precoce sunt secventele din genomul parental care se transcrie inaintea replicarii genomului.

5. Replicarea genomului se realizeaza dupa mai multe strategii de replicare in functie de grupul din care face parte virusul respectiv.

6. Faza tardiva. In aceasta etapa se transcriu atat de pe genomul parental cat si de pe genomurile progene. Genele tardive (tarzii) la ARN mesageri tardivi care vor di tradusi la proteine virale, structurale de obicei sau enzime cu rol de reglare. Se transcriu dupa replicarea genomurilor progene.

7. Asamblarea. Odata cu formarea in celula a genomului progene si proteinelor virale structurale are loc procesul de asamblare. La virusurile mici organizarea polipeptidelor si acizilor nucleici se produce in mod spontan prin autoasamblare. Insa la virusurile cu structura complexa procesul este mai complicat si implica prelucrarea unor structuri membranare celulare modificate prin insertia unor glicoproteine specifice virale.

8. Eliberarea se realizeaza prin mai multe mecanisme si anume:

prin liza celulei gazda

printr-un proces de inmugurire

printr-un proces de fuziune celulara

prin exorcitoza - eliminarea virionilor in spatiul intercelular prin liza membranei celulare intr-un punct.

Curs 8

Efectele prezentei virusului in celula gazda multiplicarea unui virus intr-o celula provoaca o serie de modificari morfologice si fiziologice celulei respective.

1. Efectul citopatic - se intelege dezorganizarea si modificarea structurala suferita de celula in urma multiplicarii virusului. De cele mai multe ori, efectul citoplasmatic se manifesta prin modificarea formei virusului si prin stergerea treptata a desenului celular. Ca rezultat celulele tind sa devina sferice si sa capete o structura amorfa.

In unele situatii efectul citopatic este caracteristic pentru virus cultivat pe un anumit tip de celule. Celulele de cultura isi modifica identic forma, marimea si in interiorul lor pot apare formatiuni noi denumite vacuole sau incluzii. Aceasta modificare uniforma a celulelor cultivate pot constitui un criteriu pentru identificarea virusului.

De multe ori, insa, efectul citopatic se finalizeaza rapid cu liza (distructia) celulei. Zonele de liza intr-o cultura celulara poarta numele de plaja. Plajele au forma circulara regulata, iar diametrul lor este corelat cu tipul de virus si cu tipul de celula dispus. Pentru unele virusuri se pot face aprecieri cantitative asupra masei virale pe baza numarului si dimensiunilor acestor plaje. (Tehnica UFP - unitatii formatoare de plaje).

2. Fuziunea celulara

Unele virusuri ( paramyxo virusurile) produc in culturile celulare formatiuni noi rezultate din fuzionarea (unirea) a doua celule. Aceste formatiuni poarta numele de sincitii.

Fuziunea celulara poate avea loc intre celula de acelasi sau intre celule cu origini diferite. Astfel s-au putut obtine hibrizi celulari prin fuzionarea unor celule umane cu celule de soareci.

Fuziunea celulara poate fi provocata si cu virusuri iradiate (virusul Sendai).

Acest fenomen are importanta practica deoarece a permis o serie de hibridari (incrucisari) imposibil de realizat pe cale naturala si a deschis portile productiei in masa a anticorpilor monoclonari.

3. Hamaglutinarea si hemabsorbtie

unele virusuri mai ales cele invelite in pericapsida au capacitatea de a aglutina hematiile unor specii de animale. Aceasta actiune este conditionata de prezenta pe suprafata virionului a unor prelungiri cu aspect de spiculi sau antene care au fost denumite hemaglutinine.

Hemaglutinarea este o consecinta a absorbtiei virusurilor la suprafata hematiilor, la nivelul carora produc modificari de natura electrostatica. Acest fenomen isi gaseste utilitate practica in unele tehnici de disgnostic.

O serie de factori fizico-chimici pot produce pierderea capacitatii de hemaglutinare. Dintre acesti factori, anticorpii (moleculele de imunoglobulina) fixati pe virusul respectiv impiedica absorbtia acestora la suprafata hematiilor.

4. Efectul incluziogen

In celulele in care se multiplica virusul apar frecvent structuri corpusculare de dimensiuni variabile care pot colora distinct prin tehnici histologice.

Aceste formatiuni poarta numele de incluzii virale. Incluziile au fost descoperite la microscop inainte de descoperirea virusurilor. Ele poarta diferite denumiri in functie de descoperitorul lor (incluzia Babes - Negri, Bollinger din variola aviara = pasarilor).

Sediul incluziilor este in gweneral citoplasma celulei gazda (in cazul virusurilor ARN) si nucleul (in cazul virusurilor ADN).

Incluziile unor virusuri pot avea o natura si un mecanism de formare diferit. Astfel la unele virusuri, incluziile reprezinta modificari ale organitelor celulare sau material genetic neasamblat si stocat in diferite sectoare ale celulei.

Incluziile reprezinta un criteriu eficient pentru stabilirea diagnosticului si ele se pun in evidenta in sectiuni hidologice colorate prin tehnici speciale.

5. Producerea de aberatii cromozomiale

Unele virusuri (herpesvirusurile, adenovirusurile) sunt capabile sa produca in celulele in care se multiplica modificari anormale la nivelul cromozomilor. Acestea poarta numele de aberatii cromozomiale si sunt rezultatul unor translocari si fuzionari de cromozomi nedirijate genetic.

Consecintele acestor aberatii sunt foarte grave si reprezinta sursa unor mutatii patogene intalnite mai frecvent la femelele insarcinate (produsul este un mutant).

Efectul transformant

Din totalitatea virusurilor existente in natura aproximativ 25% au potential omogen (cancerigen).

Transformarea tumorala este caracteristica pentru unele virusuri in special in conditiile unei infectii naturale grave. Prezenta tumorilor este de altfel si principala manifestare a bolii.

Ex: virusurile leucozelor la animale, virusul sarcomului la pasari, virusurile oncogene de la om.

O alta categorie de virusuri nu pot produce transformarea tumorala la speciile receptive, dar potentate cu factori chimici si fizici (radiatii, gudroane, detergenti) pot induce efectul transformant tumoral.

Seminarul 5

Insamantarea

Este operatia de introducere sau de depunere a unei mici cantitati dintr-o proba in interiorul sau la suprafata unui mediu de cultura steril cu scopul de a izola bacteiile eventual prezente in proba respectiva. Norme care trebuie respectate in timpul insamantarii:

instrumentarul utilizat sa fie steril

insamantarea se face pe perechi de medii, adica un mediu lichid si unul solid steril, adecvate tipului respirator si necesitatilor nutritive ale bacteriilor pe care dorim sa le izolam

manipularea materialului infectios se executa in boxe sterile, hote sterile sau cel putin in aproprierea flacarii unui bec de gau

inaintea insamantarii se executa examenul bacterioscopic al probei pentru a ne orienta asupra mediilor pe care se va face insamantarea

in timpul insamantarii nu se vorbeste si se evita formarea curentilor de aer

operatorul executa insamantarea din pozitia sezand avand in fata sa la 20 cm - 25 cm pe masa flacara becului de gaz in partea dreapta la jumatatea inchidere brat

se afla vasul cu instrumentar si vasul cu solutie antiseptica, iar in partea stanga se afla stativul cu medii de cultura sau culturi bacteriene

dupa insamantare se noteaza pe eprubeta numarul probei si data

Tehnica insamantarii din organe

Recipientul in care se afla organul respectiv se aseaza in fata operatorului apoi cu spatula de flambare incalzita la rosu se cauterizeaza suprafata organului intr-o zona cu leziuni specifice.

Insamantarea se poate executa cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamantare.

Insamantarea cu pipeta Pasteur

Se flambeaza capetele pipetei, se introduce varful pipetei prin suprafata cauterizata si se aspira imprimand pipetei miscari in plan vertical. Apoi se insamanteaza mai intai mediul lichid spaland pipeta in mediu (se flambeaza gura eprubetei inainte si dupa insamantare). Apoi pastram o mica cantitate din mediu insamantat in pipeta. Se insamanteaza mediul solid depunand 1 -2 picaturi de mediu insamantat la partea superioara a agarului inclinat. Pipeta se introduce in vasul cu antiseptic dupa utilizare.

Insamantarea cu ansa de insamantare se executa in aceeasi maniera cu deosebirea ca insamantarea agarului inclinat se face prin striere pornind de la baza agarului inclinat.

Transplatarea - este operatia de introducere sau de depunere a unei mici cantitati dintr-o cultura pura sau amestec bacterian in interiorul sau la suprafata unui mediu de cultura steril.

Incubarea - este operatia prin care se asigura mediilor insamantate conditii optime de temperatura, o anumita atmosfera, un anumit timp.

Temperatura se asigura cu ajutorul termostatului.

Majoritatea bacteriilor patogene se multiplica la 37^oC in 24 are. Exista unele specii bacteriene (yersinia) care se dezvolta la 20 25^oC.

Listeria monocytogenes este imobila la 37^o C, insa este mobila la 20 - 25^oC.

Bacillus Cereus este capabil sa se replice la temperaturi mai ridicate 42 - 45^oC.

Atmosfera de incubatie

Bacteriile aerobe cat si cele facultativ anaerobe se dazbolta in prezenta aerului atmosferic. Insa pentru bacteriile anaerobe trebuie asigurate conditii de anaerobioza. Ex: N 80 - 90%, H₂ 5 - 10%, CO₂ 5 - 10%.

Anaerobioza se poate asigura cu ajutorul termostatului cu anaerobioza.

Anaerostatul se poate asigura cu ajutorul termostatului.

Procedeul Mosel sau amestecul reducator.

Timpul de incubatie

Pentru majoritatea speciilor patogene este de 24 ore insa pentru unele bacterii cu o dezvoltare mai lenta timpul de incubatie se prelungeste la 10 - 30 pana la 90 zile. (ex: mycobacterium bovis).

Curs 9

Micologia generala

Ciupercile reprezinta microorganisme in majoritatea lor nepatogene.

Aproximativ 100 de specii pot fi implicate in declansarea unor boli la om si animale.

Ele sunt structuri cu un mod de organizare superior virusurilor si bacteriilor.

Nucleul si nucleonii poseda o membrana proprie ceea ce face ca ciupercile sa intre in grupul organismelor eucariote (protiste superioare).

Ciupercile au un perete rigid in structura caruia in loc de mureina intra chitina ceea ce confera o rezistenta superioara ciupericii.

Peretele celular este dublu, iar spatiul creat se afla o cantitate redusa de lichid.

Nucleul este diploid si contine intre 2 - 4 cromozomi. Inclusiv membrana nucleana are structura dubla.

Clasificarea ciupercilor

Dupa aspectul morfologic de baza, ciupercile microscopice pot fi grupate in doua categorii:

Levurile (drojdii) - acestea reprezinta un grup heterogen de forma unicelulara care se reproduc asexuat mai frecvent prin inmugurire si foarte rar prin diviziune directa.

Mucegaiurile - ciuperci cu structura pluricelulara avand un aspect filamentos. Sunt organisme saprofite sau parazite prezente in sol, apa si aer.

In unele situatii se pot adapta pentru parazitism la organismele animale sau la om.

Multiplicarea se face sexuat sau asexuat.

Structura ciupercilor (morfologia)

Levurile

au in general o structura simpla in care intra un invelis stratificat, citoplasma si nucleu de tip eucariot

forna predominanta este cea sferica sau ovala

din punct de vedere al dimensiunilor nu pot fi vizualizate decat cu microscopul sau cu o lupa puternica

Mucegaiurile

Sunt formate dintr-un miceliu (thal). Miceliul este alcatuit dintr-o impletitura de filamente subtiri numite hife.

In functie de dispozitia lor, hifele pot forma mai multe tipuri de micelii:

miceliul septat (eumiceliu) care este alcatuit din celule alungite asezate cap la cap

miceliul coenocitic (pseudomiceliu) si este format dintr-o celula unica mult alungita, foarte ramificata cu numerosi nuclei.

Inmultirea la ciuperci poate fi asexuata si sexuata.

Inmultirea asexuala - se face prin doua mecanisme:

inmugurirea este caracteristica pentru levuri. Ea consta in formarea unui mugure aparut ca o protuberanta la suprafata celei mama. Mugurele creste, isi formeaza pereti proprii si cand ajunge la faza de maturitate, se desprinde de celula mama rezultand o celula noua denumita spor.

Diviziunea directa - este identica cu cea intalnita la bacterii, celulele se alungesc mult, se produce o diviziune a nucleului cu segmentarea acestuia si migrarea celor doua segmente la extremitatile celulei. Procesul de divizare se incheie in momentul aparitiei peretilor despartitori.

Inmultirea sexuala - se realizeaza prin fenomenul de conjugare izogama sau heterogama. Prin acest fenomen se contopesc doua celule este zigotul. Zigotul poate sa se inmulteasca mai departe simplu prin inmugurire sau se poate transforma intr-o formatiune mai complicata ca structura numita axa. Aceasta axa genereaza in interiorul ei patru viitoare noi celule numite ascospori.

La levuri, inmultirea este de regula asexuata, dar in paralel cu aceasta s-au descris la unele specii de ciuperci si o inmultire sexuata.

Tot la levuri a fost identificat un tip de spor ce reprezinta o forma de rezistenta a ciupercii, numit clamidospor.

Aceasta forma speciala este asemanatoare cu sporii bacteriilor si are functia de a conserva ciuperca in conditii de mediu nefavorabile.

Rezistenta acestor structuri se poate prelungi timp de zeci de ani.

La mucegaiuri reproducerea prezinta aspecte diferite. In anumite faze ale cresterii hifelor se produce o modificare a acestora, ele devenind un fel de organe de reproducere specializate.

La aceasta grupa de ciuperci reproducerea in principal este sexuala, caracterizata prin producerea de spori, dar sunt specii care se pot reproduce si asexuat.

Tipurile de spori ai ciupercilor

Sporii asexuati

Acestia apar prin fragmentarea hifelor si dupa locul lor de formare pot fi impartiti in:

Endosporii (sunt formati in interiorul celulei)

Exosporii (sunt formati in exteriorul celulei)

La randul lor exosporii se impart in trei categorii:

zoospori - acestia se elibereaza odata cu ruperea peretelui celular, la inceput sunt foarte mobili, dar daca conditiile de mediu sunt nefavorabile se inchisteaza in asteptarea germinarii

conidiospori - spori asezati la extremitatea unor hife numite conidiofori. Partea terminala ia forme diferite si in functie de aspectul lor examinate la microscop ele pot fi folosite la identificarea ciupercii

artrosporii - se formeaza la mucegaiurile septate prin fragmentarea hifelor

Sporii sexuati - se formeaza prin fuzionarea a doua gameti identici sau diferiti.

Sporii sexuati tipici au un rol evolutiv deoarece rezulta din recombinari genetice formand ciuperci cu capacitate de adaptare crescuta la conditiile de mediu.

Ascosporii iau nastere prin fuzionarea a doua prelungiri tubulare emise de doua celule vecine. Aceste celule pot fi prezente pe acelasi miceliu sau pe micelii separate. Nucleii lor fuzioneaza si rezulta o celula denumita zigot.

Caracterele culturale ale ciupercilor

Ciupercile patogene se dezvolta pe medii speciale (ex: Czapek, Sabourand) sau medii care au ca suport semintele unor cereale ca orezul, porumbul. Aceste medii trebuie sa contina o concentratie mare de steroli si un pH acid.

Timpul de dezvoltare a ciupercilor pe aceste medii este variabil de la 3 zile pana la 3 saptamani.

In organismele in care se dezvolta, ciupercile formeaza leziuni specifice in care exista un numar mare de ciuperci nou formate si la care aspectul este asemanator unor tumorete (negi).

Pentru identificarea ciupercilor se fac preparate microscopice intre lama si lamela sau preparate colorate fie prin tehnica Gram, fie prin coloratii selective.

Proprietati antigenice si patogenitatea

In structura unei ciuperci intra o serie de molecule (compusi chimici) care confera identitate antigenica ciupercii respective. Aceste molecule poarta numele de antigene si pot fi de tip somatic (sau structural) sau pot fi antigene solubile care joaca rolul toxine.

Pe langa capacitatea de multiplicare foarte mare pe care o au ciupercile un element important al patogenitatii este secretia de toxine (toxinele ciupercilor se numesc micotoxine).

Aceste toxine produc modificari patogenice care determina imbolnavirea organismului in care s-a multiplicat ciuperca.

Micotoximele genereaza de multe ori stari de hipersensibilitate (stari de alergie).

Seminarul 6

Examenul conditiilor de cultivare si al caracterelor culturale

Examenul conditiilor de cultivare stabileste conditiile in care a fost obtinuta cultura respectiva. Mediile de cultura utilizate, pH-ul acestor medii necesitatea adaugarii unor factori de crestere, atmosfera de incubatie (in conditii aerobe sau anaerobe).

Examenul caracterelor culturale se executa cu ochiul liber sau cu lupa pe perechi de medii.

Examenul caracterelor culturale in mediul lichid.

Caracterele sunt: turbiditatea, fenomenele de suprafata si sedimentul sau depozitul.

Turbiditatea poate fi prezenta sau absenta, iar in cazul prezentei se aprecieaza gradul de turbiditate (mica, medie sau abundenta).

Fenomenele de suprafata pot fi prezente sau absente:

inelul, pelicula, membrana

sedimenttul poate fi prezent sau absent. In cazul prezentei se examineaza marimea sedimentului, culoarea (alb-gri), aspectul sedimentului inainte de agitare si dupa agitare.

Aspectul dupa agitare: sedimentul poate fi omogenizabil adica la agitare se disperseaza uniform in toata masa mediului sau neomogenizabil situatie cand putem intalni urmatoarele aspecte:

aspect de firicel sau filament la bacilul rejetului

aspect de fuior la Pasteurella multocida

aspect de floconos la Bacillus anthracis

Examenul caracterelor culturale la suprafata mediului solid

Cultura se poate dezvolta sub forma de gazon, adica un strat continuu uniform pe toata suprafata mediului sau sub forma de colonii izolate. O colonie izolata este o aglomerare vizibila cu ochiul liber de celule bacteriene rezultate in urma multiplicarii unei singure bacterii.

La o colonie izolata se examineaza:

forma (de obicei sunt rotunde)

dimensiunea

mici 1,2 mm diametru

mijlocii 2 - 3 mm diametru

mari 5 mm diametrul

aspectul marginilor

regulate

neregulate

aspectul suprafetei

neteda, lucioasa

aspra, rugoasa, neregulata

gradul de transparenta

transparente

semitransparente

opace

culoarea

nepigmentate

pigmentate avand diferite culori: albe, galbene, rosii, etc.

Uneori pigmentul este difuzibil in mediu pe care-l coloreaza.

aspectul pe sectiune

plane

convexe

concave

mamelonate

ombilicate

conopidiforme

gradul de emulsionabilitate

usor emulsionabile

greu emulsionabile

Examenul caracterelor culturale in final stabileste tipul cultural caruia apartine cultura respectiva. Sunt trei tipuri culturale:

S (smouth) - netede, lucioase cu marginile regulate

R (rought) - rugos. Marginile neregulate, suprafata aspra

M (mucos) - sunt difluente (cu consistenta scazuta)

In urma pasajelor repetate pe medii inepte de cultura tipul cultural S se poate transforma in tipul R, fenomen cunoscut sub denumirea de rofizare. Aceasta disociere este insotita de regula si de atenuarea patogenitatii.